아코니툼 펜듈럼의 생리활성 성분이 PI3K/Akt 경로를 조절하여 쥐의 류마티스 관절염 관련 염증을 완화합니다

요약

네트워크 약리학과 분자 도킹을 통해 A. pendulum 에서 항류마티스 관절염(RA) 성분이 확인되었습니다. 생체 내 연구에서는 디테르펜 알칼로이드, 특히 스미르노틴 A가 PI3K/Akt 경로를 통해 쥐에서 RA 증상을 완화하는 것으로 나타났습니다.

초록

전통 중의학과 다양한 민족 의학 관행에서 아코니툼 펜듈럼 N. 부시의 뿌리는 경락을 준설하고 류머티즘을 완화하며 혈액 순환을 촉진하고 관절통을 완화하는 능력으로 흔히 사용됩니다. 그 결과, 이 약용 식물은 다양한 민족 의료 시스템에서 염좌와 류머티즘 질환 치료제로 널리 인정받고 있습니다. 이 연구는 이전에 분리된 A. pendulum 에서 분리된 6가지 화합물이 류마티스 관절염(RA) 관련 염증을 개선하는 메커니즘을 시험 관 내 및 생체 내 접근법을 모두 사용하여 조사하였습니다. 네트워크 약리학, 분자 도킹, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 헤마톡실린 및 이오신(H&E) 염색, 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(q-PCR), 웨스턴 블롯(WB) 등 다양한 기법이 사용되었습니다. 결과는 6가지 화합물 중 하나인 스미르노틴 A가 PI3K/Akt 신호 경로를 표적으로 하고 염증 반응을 억제함으로써 RA 증상을 완화한다는 것을 보여주었습니다. 이 발견들은 전통적으로 A. pendulum 을 RA 치료에 사용한 근본적인 물질적 기초와 메커니즘을 이해하는 데 과학적 근거를 제공합니다.

서론

류마티스 관절염(RA)은 만성 자가면역 질환으로, 활막 염증, 활막 과형성, 면역 세포 침윤, 침습성 판누스 조직 형성, 그리고 그에 따른 관절 파괴가 특징입니다 ^1,2,3. 전 세계적으로 0.5%에서 1%의 유병률을 가진 RA는 공중보건에 큰 부담을 주며 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미칩니다 4,5,6,7. 메토트렉세이트(MTX), 글루코코르티코이드, 자누스 키나아제(JAK) 억제제, 비스테로이드성 소염제(NSAIDs)와 같은 기존 치료법은 부작용과 환자 반응의 변동성으로 인해 종종 제한적이며, 이는 새로운 치료법의 필요성을 강조합니다⁸.

천연 산물, 특히 알칼로이드는 다중 표적 메커니즘과 RA 관리에서 유리한 안전성 프로필로 주목받고 있습니다. 베르베린, 시노메닌, 마트린 같은 알칼로이드는 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK), 핵 인자 카파 B(NF-κB), 인산딜리노시톨 3-키나아제/단백질 키나아제 B(PI3K/Akt), 야누스 키나아제/신호 전달자 및 전사 활성화자(JAK/STAT)를 포함한 주요 염증 경로를 조절하며, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터루킨(IL)-1β, IL-6 같은 사이토카인을 하향 조절하여 치료 잠재력을 보여줌^{9, 10}.

티베트 의학에서 RA는 brum bu(습기 관절통)로 분류되며, 삼체액의 불균형과 관절에 미성숙한 노란 물이 축적된 것으로 여겨^집니다(그림 1^). Aconitum pendulum N. Busch는 전통적으로 습기를 배출하고 혈액순환을 촉진하며 통증을 완화하는 데 사용되는 허브입니다^13,14. 이 약초를 포함한 50가지 이상의 고전 티베트 제방이 문서화되었으며, 임상 사용의 역사는 300년이 넘는다^15,16. 그러나 그 생물 활성 성분과 메커니즘은 아직 제대로 밝혀지지 않았습니다.

여기서는 네트워크 약리학과 분자 도킹을 결합하여 Aconitum pendulum N. Busch의 항RA 성분과 그 잠재적 표적 및 경로를 예측합니다. 이 예측들은 이후 실험적으로 검증됩니다(그림 2). 이 통합 접근법은 RA 치료에서 Aconitum pendulum N. Busch의 물질적 기초와 기전적 기초를 밝혀 향후 신약 개발의 토대를 제공하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

후베이성 질병통제예방센터(후베이성 예방의학아카데미, 중국 우한)에서 공급한 특이적 병원체가 없는(SPF) 수컷 스프래그-도울리 쥐 50마리(무게 180–200g)가 제공되었습니다. 동물 면허 증명서 번호 SCXK(JB) 2023-0005). 동물을 대상으로 한 모든 실험 절차는 2011년 2011년 미국 국립보건원(NIH) 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(8판)에 엄격히 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 톈진겐잉크생물기술유한회사의 실험동물윤리위원회(승인번호)에서 검토 및 승인되었습니다. GENINK-20250074). 이 연구에 사용된 주요 시약과 장비는 동반된 재료표에 나열되어 있습니다.

세포 배양
인간 류마티스 관절염(RA) 세포주 MH7A는 10%(v/v) 태아 소 혈청(FBS)을 보충한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 배양지에서 5% CO₂¹⁷ 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양하였습니다.

동물과 치료
동물들은 개별 환기(IVC) 시스템을 갖춘 표준 특정 병원체가 없는 시설에서 엄격히 통제된 환경 조건 아래 보관되었습니다: 온도 조절 21.0–25.0 °C, 상대습도 40–70%, 12시간 광주기, 시간당 15회 완전 공기 재생 등이 이루어졌습니다. 7일간의 적응 기간 후, 쥐들은 무작위로 여섯 개의 실험 그룹으로 나뉘었고, 예기치 못한 상황에 대비해 추가 쥐는 백업으로 남겨두었다. 급성 염증성 보조제(AA) 모델은 100 μL 완전 프로인트 보조제(CFA; 10 mg·^mL-1)를 오른쪽 뒷발¹⁸에 피하 주입하여 유도하였다. 실험군은 다음과 같이 설계되었습니다: 공백 대조군, AA 모델 그룹, 양성 대조군(메토트렉세이트, 0.9 mg·^kg-1)¹⁹, 그리고 IC₅₀ 값을 기준으로 저용량(0.962 mg·kg-1), 중간(1.923 mg·^kg-1), 고용량(3.846 mg·^kg-1) 용량으로 투여된 세 개의 스미르노틴 A 치료 그룹입니다.

질병 및 화합물 표적 예측
우리 연구팀이 수행한 예비 활성 스크리닝을 바탕으로, 유리한 생활성을 보이는 6가지 화합물이 선정되었습니다: 5개의 디테르페노이드 알칼로이드(그림 3), 벤조일라코닌(1), 14-벤조일-8-O-메틸라코닌(2), (−)-(A-b)-14α-벤조일록시-N-에틸-13β, 15α-디하이드록시-1α, 6α, 8β, 16β,18-펜타메톡시아코니탄(3), 스미르노틴 A(4), 아코니틴(5)과 함께 한 가지 쿠마린 유도체인 스코폴레틴(6)²⁰. 이들 화합물의 단순화된 분자 입력 라인 입력 시스템(SMILES) 표기법은 PubChem 데이터베이스(https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/)에서 가져왔거나 ChemDraw 18.0을 사용해 생성되었습니다. 이 표기법들은 이후 SwissTargetPrediction 데이터베이스(https://swisstargetprediction.ch/)에 수입되었으며, 종은 "Homo sapiens"로 명시되었습니다. 잠재적 표적은 확률 값이 0인 유전자를 선택하여 식별하고, 해당 표적 이름과 UniProt ID를 수집하여^21,22> 수집하였습니다.

PPI 네트워크
겹치는 표적 유전자들은 STRING 데이터베이스(https://string-db.org/)²³을 이용한 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 통해 분석되었습니다. 생성된 TSV 형식의 데이터는 추가 시각화 및 분석을 위해 Cytoscape 3.9.1로 가져왔습니다. 네트워크의 위상 매개변수는 내장된 Network Analyzer 플러그인을 사용하여 계산되었습니다. 시각화된 네트워크에서는 노드 크기와 색상 강도가 각도 값에 매핑되었고, 가장자리 두께는 타겟 간 상호작용의 강도를 반영했습니다. 핵심 목표가 식별되어 연관 단계²⁴를 기준으로 순위가 매겨졌습니다.

유전자 온톨로지(GO)와 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 경로 풍부화 분석
공통 표적은 메타스케이프 데이터베이스(https://metascape.org)에 제출되어 GO 및 KEGG 경로 농축 분석을 수행했다²⁵. 기능적 결과는 WeiShengXin 생물정보학 플랫폼(https://www.bioinformatics.com.cn)을 사용하여 시각화되었습니다.

"약물 활성 성분-질병 표적-경로" 네트워크 구축
활성 성분과 그에 대응하는 표적을 체계적으로 선별한 후, 주요 신호 전달 경로와 관련 표적을 규명하기 위해 기능 농축 분석을 거쳤습니다. 이 요소들은 이후 Cytoscape 3.9.1을 사용하여 통합되어 포괄적인 "약물-활성 성분-질병-표적-경로" 네트워크를 구축했습니다. 이후 네트워크 분석기 도구를 사용하여 도수(Degree)와 간도(Betweenness) 등 주요 매개변수를 기준으로 노드를 순위화하여 네트워크 내 중심 요소를 식별하는 위상 분석을 수행했습니다.

핵심 화합물과 핵심 표적의 분자 도킹
ESR1(9BQE), PTGS2(5F19), EGFR(2XKN), GSK3B(5HLN), SRC(5MTJ), ERBB2(8U8X) 등 핵심 표적 단백질의 3차원 구조가 RCSB 단백질 데이터베이스(http://www.rcsb.org/; 2025년 5월 7일 접속)에서 수집되었습니다. 화합물 구조는 ChemDraw(버전 18.0)에서 구성되었고, 이후 통합 Chem3D 모듈을 사용하여 3차원 SDF 형식으로 변환되었습니다. 분자 결합 결과는 PyMOL로 시각화되었고, 결합 친화도는 상호작용 에너지(kcal·^mol-1)에 따라 평가되었다²⁶.

세포 생존성 검사
로그 성장 단계의 MH7A 세포는 웰당 5× 10³ 셀의 밀도로 96웰 플레이트에 시딩되었습니다. 80% 합류율에 도달하면 세포들은 먼저 지지다당류(LPS)(1 μg·^mL-1)로 6시간 처리한 후 다양한 농도의 스미르노틴 A(5, 25, 50, 75, 100 μg·^mL-1)에 노출되었다. 각 처리군은 4중으로 설정되어 37°C에서 5% CO₂ 아래 24시간 배양하였습니다. 배양 후에는 각 웰에 100μL 10% CCK8 용액을 추가하고, 37 °C에서 2시간 동안 추가 배양했습니다. 450 nm에서의 흡입도는 마이크로플레이트 리더기를 사용해 측정되었습니다.

MH7A 세포에서의 ELISA 분석법
상원액은 2000 × g 에서 4 °C에서 20분간 원심분리하여 수집했습니다. IL-6, IL-1β, TNF-α, IL-10 등 염증성 사이토카인의 농도는 제조사 지침에 따라 상청액에서 해당 ELISA 키트를 사용해 정량화되었습니다.

발가락 부종 정도 측정
모델링 후 3일마다 발 부피를 측정하여 오른쪽 뒷발의 부종 정도를 평가하였다. 쥐당 두 번씩 측정값을 측정하고 평균을 내었습니다. 염증 반응은 기준선에 비해 발 부피의 증가 비율로 정량화되었습니다.

장기 지수 측정
모든 쥐는 마지막 투여 후 24시간 이내에 마취 및 안락사되었습니다. 국제 수의학계가 인정하는 인도적인 방법이 채택되었습니다. 먼저, 5% 농도의 이소플루란을 사용해 동물을 깊게 마취합니다. 의식과 반사 신경을 모두 잃으면 가슴을 열고 심장을 절단하여 동물이 고통 없이 감각 없이 죽도록 합니다. 비장과 흉선은 즉시 절제되어 체중을 측정했다. 생리식염수로 세척한 후, 조직 표면의 과도한 수분을 필터 페이퍼로 얼음질하여 제거하였고, 장기의 젖은 무게는^27.28로 기록되었다.

헤마톡실린과 에오신(HE)
발 조직 샘플의 완전성을 보존하기 위해 각 쥐의 오른쪽 발목 관절 원위 부분 전체를 수집하여 보관했습니다. 절절 수술에는 부어오른 발 조직이 사용되었습니다. 샘플링 절차는 다음과 같았습니다: 오른쪽 발목 관절 위 약 1cm 지점의 조직을 완전히 해부하고, 털을 제거한 후 골축을 근위 끝에서 절단했습니다. 시료는 즉시 10% 파라포름알데히드 용액에 고정되었습니다. 고정 후 조직은 15% EDTA 탈석화 용액에 넣었습니다. 탈석화는 3일마다 모니터링되었으며, 조직이 부드러워져 탈석화 완료를 나타낼 때까지 용액을 필요에 따라 교체했습니다. 그 후 조직은 단계별 에탄올 시리즈(4시간 동안 75%, 2시간 동안 85%, 1.5시간 동안 90%, 1시간 동안 95%, 그리고 0.5시간간 100% 에탄올 두 차례 교환)를 통해 탈수되었다. 절편들은 탈파라핀 처리, 에탄올로 재수화, 헤마톡실린으로 10분간 염색, 수돗물로 세척, 염산-에탄올로 10초간 분별, 수돗물로 세척, 청색 처리, 다시 세척, 85% 에탄올에 5분간 담근, 에오신으로 5분간 교환 염색, 수돗물로 3초간 헹군 후 탈수 처리, 투명화 후 관찰을 위해^장착하였다.

쥐 혈청의 ELISA 분석
혈액 샘플은 2000 × g 온도에서 4°C에서 20분간 원심분리한 후, 생성된 상원액을 세포 분석용으로 수집했습니다. IL-1β, IL-6, TNF-α의 농도는 제조사 프로토콜에 엄격히 따라 상업용 ELISA 키트를 사용하여 측정되었습니다. cvxpt32 소프트웨어를 사용해 표준 곡선을 생성하고 적합했으며, 각 사이토카인의 발현 수준은 해당 표준 곡선 방정식에 흡수도 값을 보간하여 계산했습니다. 최종 단백질 농도는 실제 실험 측정값을 바탕으로 산출되었습니다.

정량적 중합효소 연쇄반응 분석(qPCR)
총 RNA는 TRIzol 시약을 사용해 유활 세포에서 분리했으며, 클로로포름^{첨가 30}번 상분리가 이루어졌습니다. 그 후 제조사의 지시에 따라 상용 역전사 키트를 사용해 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성했습니다. qRT-PCR은 SYBR 프리믹스 시약을 사용하여 수행되었습니다. 내인성 기준 유전자로 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)를 사용했으며, 상대 유전자 발현 수준은 ^2-ΔΔCt 방법으로 계산하였습니다. 다음 프라이머 서열이 사용되었습니다: GAPDH 전진: ACAGCAACAGGGTGGTGGAC, GAPDH 역방향: TTTGAGGGTGCAGCGAACTT; IL-17A 전진: CTGATGCTGTGTGTGTGCTACTGA, IL-17A 역방향: TGGAACGGTTGGTGTGTGTGA; TRAF6 전진: ACATTTCCCTCTTTGTCCACAC, TRAF6 후진: TTAGCATCCATGACCTCTCTCTCTGT; IL-10 전진: CTGCAGGACTTTAAGGGTTACTT, 그리고 IL-10 후진: CTTGCTTTTTTATTCTCACAGGGGA; IL-1β 전진: CCTGTGTGATGAAGACGGC, IL-1β 역방향: TATGTCCCGACCATTGCTGT; IL-6 전진: GTTGCCTTTTGTGTGTGTGACTGATG, IL-6 후진: TACTGGTCTGTGTGTGTGTGTGT.

단백질 추출과 서부 블롯팅
농막 조직은 인산효소/프로테아제 억제제 보충 방사면역침전법(RIPA) 완충제에 용해되었고, 단백질 농도는 비신코닉산(BCA) 검사 키트로 측정하였다. 웨스턴 블롯팅에서는 단백질 함량이 같은 양의 용해액을 나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 노출시킨 후 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 옮겼습니다. 5% 탈지유를 Tris 완충 식염수와 0.1% 트윈(TBST)에서 25°C에서 2시간 차단한 후, 막을 4°C에서 1차 항체와 함께 하룻밤 배양했습니다(GAPDH 1:50000; P-PI3K 1:1000; PI3K 1:1000; P-AKT 1:3000; AKT 1:6000). TBST로 광범위한 세척을 한 후, 막은 고추냉이 과산화효소(HRP) 결합된 2차 항체(항생쥐 IgG 1:10000; 항토끼제 IgG 1:1000) 상온에서 2시간 동안 투여했습니다. 또 다른 TBST 세척 시리즈를 거쳐, 향상된 화학발광(ECL) 기질을 사용하여 단백질 밴드를 시각화하였습니다. 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어로 정량화되어 GAPDH로 정규화되어 부하 제어를 수행했습니다.

통계 분석
모든 데이터는 Graphpad Prism 9.5 소프트웨어를 사용해 분석되었으며, 표준편차±± 평균으로 제시되었습니다. 적절한 경우 일원 ANOVA를 사용하여 통계적 비교를 수행하였습니다. p-값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 대조군과 비교하면: ^*p < 0.05, ^**p < 0.01, p < 0.001, p < 0.0001; 모델/LPS 그룹과 비교하면: ^#p < 0.05, ^##p < 0.01, ^###p < 0.001, ^####p < 0.0001.

결과

A. pendulum의 유도체가 항RA 표적에 미치는 영향
여섯 가지 화합물의 3D 구조는 SDF 형식으로 수집되었고, SMILES 수치는 표적 예측을 위해 SwissTargetPrediction 데이터베이스에 업로드되었습니다. 확률이 0인 목표는 유지되었고, 결과는 CSV 파일 형태로 내보내졌습니다. 중복 제거 후 총 97개의 잠재적 화합물 관련 표적이 확인되었습니다.

류마티스 관절염(RA)과 관련된 질병 표적은 GeneCards, OMIM, TTD 데이터베이스에서 각각 3520, 5, 3개의 표적을 얻었습니다. 중복 표적을 합병하고 제거한 후, 3,257개의 RA 관련 표적을 획득했습니다. 복합물 표적과 병적 표적 간의 교차를 벤 다이어그램을 사용하여 시각화하여 79개의 겹치는 표적을 드러냈다(그림 4A).

토론

이 통합 연구는 Aconitum pendulum N. Busch의 C19-디테르페노이드 알칼로이드인 스미르노틴 A의 항류마티스 관절염 활성에 대한 새로운 기전적 통찰을 제공합니다. 우리의 연구 결과는 스미르노틴 A가 PI3K/Akt 신호 전달 경로를 표적으로 억제함으로써 RA 염증을 완화한다는 것을 보여주며, 이는 이전에 보고된 디테르페노이드 알칼로이드와는 구별되는 기전을 나타냅니다.

네트워크 약리학 예측과 분자 도킹 검증의 결합 결과, EGFR과 PTGS2가 각각 -9.5 kcal·mol⁻¹이라는 뛰어난 결합 친화도를 가진 주요 표적으로 성공적으로 확인되었습니다. 네트워크 약리학 분석에 따르면 스미르노틴 A의 항RA 효과가 EGFR과 PTGS2의 조절과 관련되어 PI3K/Akt의 신호 억제로 이어질 수 있습니다. 이러한 예측과 이전 보고를 바탕으로, 이 효과는...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AceQ qPCR SYBR 그린 마스터 믹스	바지임	Q111
AKT (60 kDa) 단클론 마우스 항체	우한 산잉 생명공학	60203-2-Ig
BCA 단백질 분석 키트	광저우 제베이시 바이오테크놀로지	G3522
BSA 표준	광저우 제베이시 바이오테크놀로지	G8532
MH7A 세포용 완전 배지	상하이 푸헹 바이오테크놀로지	FH-MH7A
IL-10용 ELISA 키트	런탕슈오 바이오테크놀로지	ED-13626
IL-17A용 ELISA 키트	런탕슈오 바이오테크놀로지	ED-10344
IL-1 및 베타용 ELISA 키트;	런탕슈오 바이오테크놀로지	ED-10351
IL-6용 ELISA 키트	런탕슈오 바이오테크놀로지	ED-10377
TNF-및 알파용 ELISA 키트;	런탕슈오 바이오테크놀로지	ED-11776
형광 정량 PCR 시스템	응용 생명 시스템	VIIA-7
GAPDH 단클론 마우스 항체	우한 산잉 생명공학	60004-1-Ig
고속 냉장 원심분리기	후난커청 계기 장비	HI-16KR
HiScript II Q Select RT 슈퍼믹스 for qPCR	바지임	R223
HRP 표지된 염소 항생쥐 2차 항체	우한 산잉 생명공학	SA00001-1
HRP 표지된 염소 항토끼 2차 항체	비요타임 바이오테크놀로지컬	A0208
인간 류마티스 관절염 섬유아세포 유사 시노비오사이트 계통 MH7A	키사이 생명공학	QS-H075
마이크로플레이트 리더	바이오텍	MQX200
현미경	라이카	플렉사캠 C1
멀티모드 마이크로플레이트 리더	분자 장치	플렉스스테이션 3
P-AKT(60 kDa) 다클론 토끼 항체	우한 산잉 생명공학	28731-1-AP
파라핀 미세토름	라이카	RM 2016
PCR 증폭기	응용 생명 시스템	프로플렉스
인산염 완축 식염수 (1× PBS)	키사이 생명공학	QS-S001
PI3K (85 kDa) 다클론 토끼 항체	친화력	AF6241
P-PI3K (85 kDa) 다클론 토끼 항체	친화력	AF3242
스미르노틴 A	우리 실험실에서 분리 및 확인됨	C<서브>39H<서브>49NO<서브>11<서브>
티슈 탈수기	우한 준지에 전자	JT-12J
조직 삽입기	우한 준지에 전자	JB-L6
조직 확장 및 베이킹 머신	우한 준지에 전자	JK-6
트리졸	암비온	15596-026
트립신 세포 소화액 (0.25% 트립신, nbsp; EDTA 포함, 페놀 레드 없음)	키사이 생명공학	QS-S401