용액 NMR을 이용해 이상성 조건에서 생체분자 응축액을 특성화하기

요약

여기서는 NMR 방법론, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs(REDIFINE), 그리고 SEmi-고체 자화전이(CONDENSE-MT)에 의한 콘덴세이트 DEtectioN 프로토콜을 제시하여, 이상 조건에서 표지 없이 생체분자 응축액을 정량적으로 특성화할 수 있게 하여 분자 분열 분배, 교환 역학, 응축물 수화, 방울 구조를 침전이나 표지 없이 밝힐 수 있게 합니다.

초록

액체-액체상 분리(LLPS)를 통해 형성된 생체분자 응축액은 세포 내 환경을 조직하고 다양한 생화학적 과정을 조절합니다. 중요함에도 불구하고, 콘덴세이트 조성, 교환 역학, 내부 조직을 탐구하는 것은 특히 외부 태그가 없으면 여전히 도전적입니다. 핵자기공명(NMR) 분광법은 이러한 중규모 조립체를 독특하게 라벨 없이 볼 수 있는 창을 제공하여 분자 운동과 환경 이질성을 모두 포착할 수 있습니다. 두 가지 상호 보완적인 NMR 방법론은 응축액을 이상 상태 내에서 포괄적으로 특성화할 수 있게 합니다. NMR로 관찰할 수 있을 만큼 동적인 응축체의 경우, REDIFINE이라는 확산-교환 접근법인 REstricted Diffusion of INvisible speciE는 화학 교환과의 확산 대비를 이용해 응축상과 희석상 분자 비율을 정량화하고, 방울 크기와 경계 투과율을 결정하며, 상 경계를 가로지르는 분자 교환률을 추출합니다. NMR에서 보이지 않는 더 강단한 응축체의 경우, 물 감지 반고체 자화-전달 방법인 CONdensate DEtectioN by SEmi-고체 자화전달법(CONDENSE-MT)은 응축된 생체분자와 희석상 용매 간의 이완 대비와 양성자 교환을 이용해 대량 수질 양성자에 응축수를 모니터링하여 상대적 분배, 분자 회전 속도, 수화 역학, 결합물 함량에 접근할 수 있게 합니다. 이 방법들은 형광 또는 검출 태그 없이 거의 원래의 이상 조건에서 응축수 구조와 역학을 다차원적이고 정량적으로 관찰할 수 있게 합니다. 이들의 통합은 생체분자 상 분리 연구를 위한 NMR 도구 상자를 확장하고, 응축액의 물리화학적 특성과 생물학적 기능 및 병리학적 오조절을 연결하는 기초를 마련합니다.

서론

세포는 생화학적 반응을 구획화함으로써 비범한 공간적·시간적 조직을 달성합니다 ^1,2,3. 막에 결합된 소기관 외에도, 단백질과 핵산의 액체-액체상 분리(LLPS)로 형성된 막 없는 구획 내에서 많은 중요한 세포 과정이^{발생합니다.} 이러한 동적 조립체는 종종 생체분자 응축체라고 불리며, 핵소간, 응력 과립, 핵 반점, 가공체를 포함하며, 이들은 RNA 대사, 전사 조절, 신호 전달 등에서 중요한 역할을 합니다 ^5,6. 환경 신호에 따라 생성, 용해, 구성 요소를 교환하는 능력은 지질막에 의존하지 않고도 생화학적 활동을 조직할 수 있는 다재다능한 메커니즘을 세포에게 제공합니다.

생체분자 응축액의 큰 부분은 본질적으로 무질서한 영역(IDR)과 RNA 결합 도메인(RBD^)을 포함하는 RNA 결합 단백질(RBP)에서 유래합니다^7,8. 이 단백질들은 단독으로 또는 RNA와 복합체로 분리될 수 있어, 다양한 물질적 특성과 생물학적 기능을 가진 응축체를 생성합니다. 예를 들어, SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질(N)은 바이러스 게놈 포장 및 조립에 관여하는 RNA 의존성 생체분자 응축체(^RNA 의존성 응축체)를 형성하며, 폴리피리미딘 요로 결합 단백질 1(PTBP1)은 유전자 침묵에 기여하는 핵 응축체를 형성^합니다. 또한 FUS와 DDX4와 같은 단백질은 무질서한 영역에 의해 LLPS를 겪으며 RNA 대사와 스트레스 과립 형성에 영향을 미칩니다^11,12. 이러한 과정의 조절 장애는 근위축성 측삭경화증(ALS)과 전두측두엽 치매와 같은 신경퇴행성 질환과 연관되어 있으며, 이들 질환의 비정상적인 상전이가 집결과 기능 상실을 초래할 수 있습니다¹³.

응축은 단백질과 단백질-RNA 복합체에만 국한되지 않습니다. RNA만으로도 LLPS가 발생할 수 있으며, 특히 여러 신경퇴행성 질환과 관련된 반복 확장 서열 맥락에서 그렇습니다(^14,15). 헌팅턴병의 CAG나 근긴장성 이영양증의 CUG와 같은 트리뉴클레오타이드 및 헥사누클레오타이드 반복 확장은 시험관 내외와 세포 내에서 방울 유사 응축액을 형성할 수 있습니다¹⁴. RNA 응축의 물리적 기초와 단백질 및 단백질-RNA 구동 응축체와의 차이점을 이해하는 것은 반복 증식 질환의 분자 메커니즘을 밝히는 데 매우 중요합니다.

생물학적 중요성에도 불구하고, 생체분자 응축액의 정량적이고 라벨 없는 특성 규명은 여전히 어려운 과제입니다¹⁶. 기존의 형광 현미경 및 분광법 기술은 외부 표지에 의존하는데, 이는 생체분자 구조, 동역학 또는 상 거동을 교란시킬 수 있습니다^17,18. 더불어, 일부 응축액은 분자 운동이 제한되고 선이 넓어 NMR에서는 보이지 않아 전통적인 NMR 접근법으로는 접근 가능한 정보가 제한됩니다. 따라서 응축액을 표지 없이 이상 및 원래와 유사한 상태로 직접 탐구할 수 있는 실험적 전략이 시급히 필요합니다. 물적 상 경계가 교환 과정과 응축수 성숙에서 중요한 역할을 하므로, 주어진 샘플 부피 내에서 생체분자 방울을 안정화하여 조밀한 상의 침전을 방지하는 것도 똑같이 중요합니다. 이는 세포골격을 모방하는 아가로스 하이드로겔을 사용하여 쉽게 달성할 수 있습니다.

최근 NMR 기반 방법론의 발전은 이러한 해결책을 제공합니다. REDIFINE(REstricted Disffusion of InVisible speciEs)¹⁹ 접근법은 확산 NMR과 화학 교환 분석을 결합하여 단백질 및 단백질-RNA 응축체에서 분자 분열, 교환 반응학, 방울 크기를 정량화합니다. 이와 함께 CONDENSE-MT(SEmi 고체 자화 전이에 의한 CONdensate DEtectioN) 기법²⁰ 은 물 자화 전달을 통해 NMR 보이지 않는 응축액을 검출하여, 주어진 조건에서 응축물질의 양을 정량화하고 응축 내 수화 역학과 분자 회전 속도를 추가로 밝혀냅니다. 이 방법들을 결합하면 평형 이상 조건 하에서 다양한 응축액 유형, 단백질 단독, 단백질-RNA, RNA 단독 응축액을 표지 없이 비침습적으로 조사할 수 있습니다. NMR 도구 상자를 확장함으로써, 응축수 구조, 역학, 그리고 생물학적 기능과 질병과의 연관성을 체계적이고 정량적으로 탐구할 수 있는 문을 열었습니다.

프로토콜

1. 샘플 준비

1. 완충제 선택: 생체분자가 가장 안정적인 테스트용 완충제를 사용하세요.
   참고: NMR 신호는 일반적으로 낮은 pH에서 더 강합니다. 기술적 요구사항으로, 모든 NMR 샘플(최종 v/v)에 필드 락으로 5% D₂O를 추가하세요.
2. 세포골격을 모방하는 아가로스 하이드로겔을 배지로 사용하여 이상 샘플을 안정화합니다. 같은 버퍼에 1.5% (w/v) 아가로스 스톡을 준비하기 위해 아가로스 가루를 무게를 재세요. 내재적으로 무질서한 단백질(IDP)과 RNA가 형성하는 생체분자 응축액을 대체하는 저렴한 대안으로 일반 아가로스를 사용하세요. 접힌 도메인을 포함하는 단백질을 포함하는 섬세한 응축액을 만들 때는 저융 아가로스를 사용하세요¹⁹.
3. 아가로스 육수 준비: 현탁액을 약 80°C로 10분간 가열한 후 혼합 또는 소용돌이 작용으로 완전히 녹입니다.
   주의: 용융 아가로스는 뜨겁고 타버릴 수 있습니다; 내열 장갑을 끼고 다루세요.
   참고: 용융 아가로스는 생물학적 샘플과 혼합하기 전에 물에 담겨 액체 상태로 유지하기 위해 따뜻한 온도(예: 일반 아가로스는 55°C, 저융 아가로스는 37°C)로 유지하세요.
   녹은 아가로스는 수십 분 동안 따뜻하게 보관할 수 있습니다^19,21.
4. 최종 이상 샘플 준비:
   1. 아가로스 하이드로겔로 안정화된 이상 시료를 준비하기 위해, 단백질(및/또는 RNA) 스톡과 해당 따뜻한 아가로스 버퍼를 1.5ml 마이크로 원심분리관 안에 혼합합니다.
      참고: 최종 단백질/RNA 농도는 일반적으로 NMR 검출에 적합하기 위해 50-500 μM입니다.
   2. 즉시 혼합물을 긴 유리 피펫을 사용해 3mm NMR 튜브로 옮깁니다. 이식 후 아가로스가 곧 굳어지도록 하세요.
      참고: 아가로스가 없으면 이상 시료가 시간이 지남에 따라 퇴적되어 NMR 데이터 수집과 분석이 복잡해집니다. 이는 시료가 실험 시간 척도에서 물리적으로 변하기 때문입니다.
5. 육안 검사: 샘플을 육안으로 점검하세요. 상 분리가 일어나면 시료는 즉시 탁한 상태로 보이며 그 상태를 유지합니다. 이는 이상 시료가 아가로스에서 성공적으로 안정화되었음을 나타냅니다.
6. CONDENSE-MT를 실행할 계획이라면, 생체분자 첨가를 생략한 동일한 과정을 통해 추가 아가로스 참조 샘플을 준비합니다. 대신 버퍼를 추가하면 같은 샘플 부피를 얻을 수 있습니다. 이 샘플은 응축수 샘플을 준비하고 모든 데이터를 측정하여 아가로스 기준 샘플이 더 오래 배양되지 않도록 한 후에만 준비하세요.

2. REDIFINE 실험 기록

1. 평소처럼 ^1H채널을 잠그고, 심하고, 매칭하고, 튜닝하세요. 일반적인 절차로 ^1H의 90° 펄스 길이를 보정하세요.
2. 1차원 수분 억제 스펙트럼을 기록하세요. 이상적으로는 강한 생체 분자 신호가 관찰됩니다(보조 그림 1A).
   1. 신호가 전혀 없거나 매우 적으면, 응축된 단백질/RNA는 NMR 관측 불가능하며 응축된 상으로 나누는 비율이 높다고 가정합니다. 이 경우에는 REDIFINE을 진행하지 마세요. 이 방법론은 관찰 가능한 생체분자 신호에 의존하기 때문입니다.
   2. 이런 상황에서는 원칙적으로 CONDENSE-MT 실험이 매우 잘 작동할 것으로 보이므로 즉시 4단계(CONDENSE-MT 실험 기록)로 넘어가세요.
3. 기존 확산 순서 분광법(DOSY) 실험을 불러오는데, 이는 양극성 그라디언트(Bruker 펄스 시퀀스: stebpgp1s19)를 사용하는 기존 2D 자극 에코 절차에 의존합니다. 자세한 내용은 Bruker DOSY 및 Diffusion 사용자 매뉴얼을 참고하세요.
4. P0, P1, P27을 보정된 90° 펄스 길이로 설정하세요. 경험 법칙으로 설정하면, 국가 탐색 시간은 32회, DS 스캔은 16회, TD1은 16회로, TD2와 SW2는 조정하여 획득 시간 AQ를 80-100 ms로 만듭니다. d1을 1.5초로 설정하세요.
   참고: 그라데이션은 적절히 보정되어야 합니다.
5. 자기장에 따라 워터게이트 d19 지연을 평소처럼 최적화하여 방향족(약 7 ppm) 또는 지방족(약 1 ppm)에서 최대 여기를 얻으세요. d20을 75ms로 설정하세요. p30 선택은 단백질/RNA 크기에 따라 달라집니다. 단백질>20 kDa)의 경우 5 ms를 사용하고; 작은 단백질의 경우, 경험적으로 3.5ms 정도를 사용하세요.
6. 'xau dosy 2 95 16 l y y'라는 명령어로 DOSY 실험을 기록하는데, 이는 확산 기울기 세기를 16단계에 걸쳐 선형적으로 배열합니다.
   1. 이상적으로는 희석 위상에서 나오는 신호의 초기 감쇠를 관찰하고, 응축 위상 신호의 감쇠는 정체되어야 합니다(그림 1A 및 보조 그림 1B).
7. 전체 REDIFINE 세트의 데이터를 계속 획득하려면, 방금 실행한 초기 매개변수의 매개변수를 복사하여 9개의 새로운 stebpgp1s19를 생성하세요. 연속된 모든 실험에서는 d20 확산 지연을 가변 단계별로 변경하여 100–1000 ms(즉, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 700, 1,000 ms) 범위에 걸쳐 변경합니다.
8. 이 실험들 각각을 'xau dosy 2 95 16 l y n' 명령어로 실행하세요. 마지막 "n"은 10개의 실험 내내 수신기 이득이 유지되도록 보장합니다.

3. REDIFINE 데이터셋 처리 및 결과 시각화

1. 모든 실험(총 10개)은 다음과 같이 처리합니다:
   1. SSB 2의 qsine을 윈도우 함수로 설정하고, qsin을 사용해 5^번째 단면을 추출합니다; fp, 1차원을 페이징하고 위상 매개변수를 2D 데이터셋에 저장합니다.
   2. 그 다음 xf2로 2D를 처리하고, 기준선 보정 abs2를 수행한 뒤, split2D로 이 16개의 슬라이스를 추출합니다(팝업 창에서 추가 입력: r – 16 – 11). 이렇게 하면 서로 다른 기울기 세기로 획득한 16개의 스펙트럼을 추출하여 동일한 데이터셋 내에서 11개에서 26개까지 1D 처리 실험으로 저장할 수 있습니다.
   3. 나머지 9개의 실험도 같은 방식으로 반복하세요. 페이징과 기준선 보정이 정확한지 확인하기 위해 최소한 처음 4-5개의 슬라이스를 확인하는 것이 매우 중요합니다. 필요하다면 수동으로 수정하세요 – 좋은 위상 측정과 기준선이 적절한 정량화의 전제 조건입니다(그림 1B).
2. 분석을 위해 제공된 Matlab 코드 LLPS_REDIFINE_fit 을 사용하세요(보조 그림 2A). 코드에서 실험 결과에 따라 다음과 같이 조정하세요: '델타'(확산 시간 d20), 'P.d'(총 구배 지속 시간 2*p30), exp(1,:)에서 exp(10,:)로 진행한 실험 #에 따라 조정하세요. 그 다음 프로브 그라데이언트 강도에 따라 P.g를 설정하세요(TopSpin 실험 폴더의 파일 "difflist"에서 접근 가능).
3. 데이터 위치에 따라 '폴더'와 '경로'를 조정하세요. 코드를 40행까지 실행하세요. 이렇게 하면 1D 슬라이스가 나옵니다 – 여기서 적분 영역을 선택하세요; 이 과정들은 방향족 또는 알리파틱을 포함해야 하며, 아미드와 같은 서로 다른 분자기를 고려하지 않도록 가능한 좁은 영역을 선택해야 합니다.
4. 적분 경계를 '왼쪽'과 '오른쪽' 변수의 점에 입력하세요(보충 그림 2A). 이는 정량적 분석을 위한 데이터를 통합하기 위한 것입니다(그림 1C). 샘플, 실행 날짜, 그리고 실험 특성에 따라 행렬 이름을 선택하세요.
5. 전체 코드를 실행하세요. 'fit0'에서는 최적화 함수가 최소화를 시작할 시작 매개변수를 선택할 수 있습니다. 기본값으로 시작하고, 수렴이 이루어지지 않으면 두 번째 fit0 값(응축 단계의 모집)을 0.1에서 1로 0.1로 변경합니다.
   참고: 때때로 데이터셋에 여러 국소 최소값이 있을 수 있으며, 더 전역 최소값으로 수렴하기 위해 시작 매개변수를 광범위하게 변경해야 할 때가 있습니다.
6. 만족스러운 적합이 달성되면, 적합 값은 그림 안에 기록되며(그림 1D 및 보조 그림 2B), 변수 'fit'에서 확인할 수 있습니다. 더 나은 시각화를 위해 이 매개변수들을 통계 그래프로 그래프로 그려보세요.

4. CONDENSE-MT 실험 기록

참고: 실험의 목표는 양성자 교환²⁰을 통해 용매 수신호에서 응축수를 관찰하여 간접적으로 검출하는 것입니다. CONDENSE-MT 실험에서는 지문 MT 프로필을 획득하여 분석합니다(그림 2A)²⁰.

1. 좋아하는 1D 수분 억제 스펙트럼을 녹음하세요. 신호가 거의 관찰되지 않으면 CONDENSE-MT 실험이 매우 잘 작동할 가능성이 매우 높습니다.
2. 정량적 CONDENSE-MT 분석은 R1 수분 비율을 사전에 결정해야 합니다. T₁ 역전 회복을 통해 R₁ 비율을 측정하세요. 제공된 펄스 시퀀스, Bruker 매개변수 세트, 그리고 vd 목록을 해당 폴더에 복사하세요. 매개변수 "T1_inversion_recovery"을 로드하고 NMR 분광기에 출력과 주파수를 조정하세요("edprosol"에 따라).
   1. 1시간 90° 펄스(p1)를 보정하고, NS를 2, DS 0, d1을 20초, SW를 10 ppm, TD2를 16k, TD1을 24로 설정하세요(조정된 VD 목록 길이 범위 내). 방사선 감쇠 효과를 피하기 위해 Z 방향에 약한 기울기(GPZ0 = 0.1%)를 설정하세요.
3. CONDENSE-MT 실험에 대해,
   1. 제공된 Bruker 파라미터 세트, 시퀀스, 주파수 목록을 Bruker 전용 폴더에 복사하고, "CONDENSE-MT" 파라미터 세트를 불러온 뒤, 분광기에 따라 주파수와 파워를 조정하세요.
   2. 복사 감쇠를 피하기 위해 P1을 보정된 90° 펄스 길이로, P4를 여기 펄스로 1 μs로 설정하세요. NS를 2, DS를 16, d1을 4초, SW2를 20ppm, TD2를 8k, TD1을 주파수 목록 길이(보통 46)로 설정하세요. SPNAM10 Squa100.1000으로 설정하고, 지속 시간은 p10에서 5초로 설정하세요.
   3. SP10 출력을 찾아 100Hz 조사를 가능하게 합니다('pulse 100 Hz' 명령어로 와트와 dB 양쪽 출력을 계산합니다). SP10 조사 펄스의 출력을 조절하고 'zg' 명령어로 이 의사 2D 실험을 실행하세요.
      참고: 실험은 제공된 주파수 목록을 사용하여 물과의 온공진에서 매우 멀리 떨어진 공진(100000Hz)까지 방사선 오프셋을 아우르는 주파수 목록을 사용하여 서로 다른 방사선 오프셋에서 물 신호를 감지할 것입니다(그림 2B). 물 적분 플롯(스펙트럼의 적절한 위상 배분을 보장함; 그림 2C) 조사 오프셋에 대해 측정하면 그림 2A에 나타난 CONDENSE-MT 프로파일이 나옵니다.
4. 7개의 새로운 실험을 만들고 연속된 각 실험에서 170 Hz에서 1000 Hz(즉, 170, 250, 330, 500, 650, 780, 1,000 Hz)까지 범위 내에서만 조사 출력만 증가시킵니다. 모든 실험에서 이전 지점의 명령을 사용하세요. 모든 포화 파워에 대해 전체 오프셋 리스트를 획득합니다(그림 2D).
   참고: CONDENSE-MT 피팅은 아가로스 전용 샘플(생체분자 응축체가 없는 배지)에서 획득한 참조 데이터가 필요합니다. 샘플 준비와 데이터 수집 사이의 시간 간격이 같은지 확인하고, 아가로스 참조 샘플에 대해 8개의 실험 데이터셋을 동일한 데이터셋으로 확보하세요. 이는 아가로스 기준과 이상 샘플이 동일한 시간 동안 배양되었음을 보장하기 위함입니다.

5. CONDENSE-MT 데이터셋 처리 및 결과 시각화

1. 모든 CONDENSE-MT 실험(총 8개, 보충 그림 3A)을 다음과 같이 처리합니다.
   1. SSB 2의 qsine을 윈도우 함수로 설정하고, qsin을 사용해 46^번째 슬라이스를 추출합니다; fp, 1차원에서 물 피크를 위상화하고, 위상 매개변수를 2D 데이터셋에 저장한 후 xf2로 2D를 처리한 뒤 split2D로 이 46개의 슬라이스를 추출합니다(팝업 창에서 추가 입력: r – 46 – 11).
      참고: 이 도구는 서로 다른 방사선 오프셋을 사용해 획득한 46개의 1D 스펙트럼을 추출하여 동일한 데이터셋 내에서 11개에서 56개까지 1D 처리 실험으로 저장합니다(보충 그림 3A, 1000 Hz CONDENSE-MT 실험에 표시됨).
   2. 남은 7개의 실험도 똑같이 반복하세요. 각 실험에서 여러 슬라이스를 확인하여 위상 배치와 기준선이 정확한지 확인하세요(그림 2C). 필요하다면 수동으로 수정하세요 – 좋은 위상 측정과 기준선이 올바른 수치화의 전제 조건입니다!
2. 아가로스 참조 샘플과 역전 회복 실험을 통해 얻은 데이터에 대해 동일한 단계를 반복하며, 24번째 단면을 추출하여 위상화하고 split2D (r – 24 – 11)를 사용한다.
3. 제공된 Matlab 코드를 사용하여 획득한 데이터를 적합시켰습니다. 대본에 명시된 구체적인 지침을 따르세요.
4. 응축수가 없는 상태에서 배경 매개변수를 얻기 위해 먼저 아가로스 참조 샘플에 대해 적합 분석을 수행하세요. read_CONDENSE_MT_data 코드는 먼저 처리된 NMR 데이터를 읽고, split2D 명령어가 생성하는 1차원 슬라이스에 수분 공명 신호를 통합합니다(보조 그림 3B).
5. 통합 경계는 개별적으로 설정하세요; Matlab에 참조 1차원 스펙트럼을 표시하여 통합 경계를 평가할 예정입니다(보충 그림 3C). 이 코드는 데이터를 추가로 정규화하여 조사 오프셋과 전력의 함수로 정규화된 물의 적분을 CONDENSE-MT 모델²⁰에 적합시킵니다. read_CONDENSE_MT_data 은 정규화된 적분을 변수 integral_water_real_all에 저장하며, 이후 적합에 사용됩니다.
6. CONDENSE-MT 데이터를 적합하기 전에 아가로스 또는 응축수 존재 시 물의 R₁ 이완율을 결정하십시오.
   참고: 수분 역전 회복 실험의 적합은 CONDENSE-MT_full Matlab 스크립트의 첫 번째 섹션(또는 아가로스 참조 데이터의 경우 CONDENSE_MT_referenceMTpool 스크립트)에서 수행할 수 있습니다. 실험의 파일명과 경로, 실험 ID를 입력하면 Inversion_Recovery Matlab 스크립트를 실행할 수 있습니다(보조 그림 4A, 1절). 필요 시 이 스크립트에서 1차원 슬라이스 수와 적분 경계를 조정할 수 있습니다; 후자는 TopSpin에서 사용되는 처리 매개변수에 따라 다릅니다. 이 섹션에서는 R1 수분 비율을 결정하고 이를 CONDENSE-MT 데이터를 맞추기 위해 필요한 P.R1w 변수에 저장합니다.
7. 아가로스 데이터의 경우, CONDENSE_MT_referenceMTpool 문자( function_1MT 함수를 호출)를 사용하여 정규화된 적분을 적용해 적합을 쉽게 활용하세요.
8. 응축수 정량화를 위해, 응축된 샘플에서 획득한 데이터의 전역 적합을 위한 아가로스 적합 매개변수를 입력으로 사용한다(보완 그림 4A). 이 방법은 아가로스 메쉬워크의 물리적 특성을 적합도에 일정한 값으로 고정하여, 아가로스 메쉬워크에 내장된 응축액의 추가 효과를 정량화할 수 있게 합니다(그림 2E).
9. CONDENSE-MT_full 스크립트를 사용해 응축수 정량화를 수행하세요. 이 스크립트는 function_2MT Matlab 함수를 호출합니다. 계산 최적화의 시작 매개변수는 fit0(보조 그림 4B)를 통해 제공된다. 적합의 매개변수 불확실성은 분산-공분산 행렬이 도출되는 야코비안 행렬을 사용하여 계산됩니다(보완 그림 4B).
10. 실험 데이터에서 모델 예측의 잔류 편차와 유사한 적합 편차로 적합 품질을 평가합니다. 추가 품질 관리를 위해 실험 데이터와 결합하여 적합도를 그래프로 그려 보세요(보충 그림 4C).

결과

여기서 설명한 LLPS REDIFINE 프로토콜은 FUS N-터미널 도메인(NTD)에 적용되었습니다. FUS NTD는 미세몰 농도에서 상기 조건에서 쉽게 위상 분리^됩니다. 이 샘플은 200 μM 농도로 200 mM HEPES 버퍼에 200 mM KCl이 함유된 30 mM HEPES 버퍼에 pH 7.5, 0.5% 일반 아가로스를 사용해 준비되었습니다. 위상 분리 후에도 FUS NTD 신호는 응축 위상에서 관측 가능합니다(그림 1A, B). 이로 인해 LLPS REDIFINE을 공부하기에 완벽한 후보가 됩니다. 즉, 대부분의 LLPS 취약한 단백질은 고유 상태에서 보통 관찰 가능한 긴 내재적 무질서한 영역을 포함하고 있습니다; 하지만 더 구조화된 단백질에서는 그렇지 않습니다.

REDIFINE 적합(그림 1D 및 그림 3A,B)은 이 FUS NTD 샘플에 대해 여러 고유한 매개변수를 밝혀냈습니다. 구체적으로, 희석상과 응축상에서의 확산 계수(D_dil 및 D_cond), 응축상 단백질 집단(ν_cond), 평균 방울 크기 R, 그리고 간기 투과성 p를 결정했습니다. 방울 크기와 투과율은 응축된 상에서 희석 상으로의 간기 교환율을 정의하며, 이는 교환 역학에 관한 정보를 얻을 수 있게 합니다^{. 19}.

이 결과들은 여러 방식으로 시각화할 수 있습니다(그림 3B). 거미 플롯을 사용하면 다양한 조건이나 샘플에서 결과를 비교할 수 있습니다. 반면, REDIFINE 매개변수를 모델 내에서 그림으로 표현하여 가장 효과적으로 시각화할 수 있습니다. REDIFINE은 단 하나의 샘플로 몇 시간 만에 라벨 없이 모든 결과를 제공합니다.

FUS NTD의 NMR 신호가 응축 상에서도 여전히 검출 가능하므로(그림 3C), 이완 대비가 부족해 CONDENSE-MT는 적용되지 않을 가능성이 큽니다. CONDENSE-MT 데이터 세트를 FUS NTD에 기록했으며, 실제로 아가로스 기준과 FUS NTD 이상 샘플 간에 MT 프로필에 차이가 관찰되지 않았습니다(그림 3C). 이로 인해 CONDENSE-MT 방법론은 이 특정 FUS NTD 샘플에는 적용할 수 없습니다.

그러나 CONDENSE-MT는 반복 확장형 RNA 응축액의 동적 특성 분석을 제공합니다(그림 3C,D)²⁰. CONDENSE-MT는 기존 NMR에서는 RNA의 신호가 관측되지 않음에도 불구하고(그림 3D) 응축상 내 RNA를 고유하게 특성화하는 여러 매개변수를 제공할 수 있다는 점에 유의하세요(그림 3C). 얻어진 매개변수는 응축수와 벌크수(k_{응축수, H2O} 및 k_{H2O, 응축수} 사이의 양성자 교환 속도), 응축수에 대한 T 2 이완율(T_{2, 응축}수), 그리고 응축 시 생체분자의 동적 정지 정도를 반영하는 T₂ 이완율, 그리고 벌크 워터의 겉보기 R₂ 속도(R_{2, 물})). 이 마지막 매개변수는 벌크, 희석된 물, 느리게 굴러가는 응축수의 회전 속도의 선형적 결합입니다. R_2,수분 수치가 높을수록 응축수 내 수분 농도가 증가함을 나타내며, 이는 전체 수분 R₂ 수율²⁰을 높인다(그림 2E 및 그림 3D).

데이터 및 코드 이용 가능

LLPS REDIFINE의 원시 데이터와 처리 코드는 Zenodo 저장소에서 제공됩니다: https://doi.org/10.5281/zenodo.15228787 . CONDENSE-MT의 원시 데이터와 처리 코드가 Zenodo 저장소 https://doi.org/10.5281/zenodo.15789697 에 저장되었습니다. 처리에는 MATLAB이 필요합니다. 이 문서(보조 코딩 파일)에도 포함되어 있습니다.

그림 1: REDIFINE 워크플로우. (A) 확산 측정은 응축된 시료에서 복잡한 이상 확산 붕괴 곡선을 제공합니다. 결과적으로 얻은 붕괴는 응축상과 희석상에서 종의 확산 계수, 개체군, 방울 크기, 간상 교환률을 설명하는 디컨포브드 매개변수를 포함합니다. (B) 이러한 고립된 매개변수를 해독하기 위해, 기울기 세기뿐만 아니라 확산 지연도 변화하여 의사 3D 데이터셋을 기록해야 합니다. 이 측정값의 모든 단면이 적절히 위상 조정되고 기준선 보정을 하는 것이 절대적으로 중요합니다. (C) 측정 및 처리된 데이터의 품질을 확인한 후, 이 1차원 슬라이스들은 분석 및 최종 플롯을 위해 MATLAB 코드에 입력됩니다. (D) 그 후 비선형 프로그래밍 해법기로 데이터를 적합시킵니다. 적합 및 결과 매개변수는 이상 FUS NTD 샘플에 대해 설명되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: CONDENSE-MT 워크플로우 (A) 응축된 생체분자와 물의 존재로 인한 확산을 보여주는 수질 공명에서 관찰된 독특한 CONDENSE-MT 프로파일. (B) 모든 방사선 오프셋마다 물이 관측된다. (C) 정량화를 위해서는 모든 스펙트럼이 올바르게 위상화되어야 합니다. (D) 서로 다른 조사 오프셋에서 물 공명을 획득한 후, 실험은 서로 다른 조사 출력에서 반복됩니다. 이렇게 하면 방사선 오프셋과 방사선 출력(E) 모두에 따른 상대 수질 신호 데이터셋이 생성됩니다. 그 후 비선형 프로그래밍 해법기로 데이터를 적합시킵니다. 적합도와 결과 매개변수는 2상 31xCAG RNA 샘플에 대해 설명되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: REDIFINE 및 CONDENSE MT 결과 제시. (A) 샘플 또는 조건 간 비교 분석을 위한 REDIFINE 매개변수의 스파이더 플롯 표현. (B) 확산 계수, 방울 반경, 분할, 상간 교환률 등 REDIFINE에서 유도된 매개변수를 보여주는 회로도 모델. (C) 500Hz 방사선 기준 및 아가로스 기준 2상 FUS NTD를 위해 획득한 CONDENSE-MT 프로파일의 비교.
(D) 31xCAG 반복 확장 RNA 응축액의 CONDENSE-MT 분석을 통해 콘덴세이트 관련 자화 전달 효과를 매개변수 추출 및 시각화합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 1: REDIFINE 설치 자료. (A) FUS N-말단 도메인은 이상 응축 시료 준비 후에도 관찰 가능합니다. 강한 아미드/아미노 및 방향족 양성자 신호가 관찰됩니다. (B) 확산 DOSY 실험에서 관찰된 신호 감쇠는 희석상 단백질 집단의 붕괴 속도가 빨라지고 응축상 단백질의 붕괴가 느려진다는 것을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: REDIFINE 가공. (A) REDIFINE 피팅에 사용되는 Matlab 코드로, 특정 입력이 필요한 부분에 매개변수가 강조되어 있습니다. 삽입 부분은 통합 영역을 선택하는 방식을 보여줍니다. (B) 적합 함수의 최소화와 그에 따른 결과. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 3: CONDENSE-MT 설정. (A) CONDENSE-MT 분석에 필요한 NMR 실험 개요, 여기에는 수질 역전-회복 실험(실험 번호 5)과 다양한 조사 강도에서의 CONDENSE-MT 실험(실험 번호 11-18)이 포함됩니다. (B), (C) CONDENSE-MT 데이터셋의 물 1D 스펙트럼을 읽고 통합하는 Matlab 스크립트 개요. CONDENSE-MT 실험은 main부터 main8로 나뉩니다. 통합 경계는 water_left 와 water_right로 입력됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 4: CONDENSE-MT 처리. (A) CONDENSE-MT 피팅 스크립트의 첫 번째 섹션, 여기에는 물 역전 회복 피팅(섹션 1)과 이전에 결정된 진정당 배경 매개변수 입력이 포함됩니다. (B) CONDENSE-MT 데이터셋의 적합 및 매개변수 불확실성 결정. 적합의 시작 매개변수는 fit0 내에서 설정할 수 있습니다. (C) CONDENSE-MT 적합 결과의 플롯 섹션. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 코딩 파일: REDIFINE 및 CONDENSE-MT 분석을 위한 MATLAB 스크립트. Bruker Topspin은 REDIFINE 확산 데이터셋 및 CONDENSE-MT 자화-전달 데이터셋 처리 및 적합에 사용되는 CONDENSE-MT 실험과 MATLAB 스크립트를 설정하는 코드를 작성했으며, 여기에는 데이터 통합, 이완 분석, 전역 모델 적합 루틴이 포함됩니다. 스크립트를 실행하려면 MATLAB이 필요합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

여기서는 이상 생체분자 응축체의 라벨 없이 NMR 특성화를 위한 상세한 프로토콜을 제시했습니다. 이 두 가지 신흥 방법론, LLPS REDIFINE과 상호 보완적이지만 직교적인 실험인 CONDENSE-MT가 포함됩니다. 일반적으로 적용 가능하지만, LLPS REDIFINE은 생체분자 검출에 의존하며, 적절한 분석을 위해서는 상 분리 시 관측 가능한 신호가 필요합니다. 이로 인해 REDIFINE의 적용 범위가 제한될 수 있지만, 대부분의 응축액에는 일반적으로 NMR로 관찰 가능한 본질적으로 무질서한 영역을 가진 단백질이 포함되어 있습니다. 특히 단백질:RNA 및 RNA 단지 응축체의 경우, 응축상 내 생체분자의 신호는 상 분리 시 검출 한계를 넘어 확장됩니다. 응축상 분할 계수가 높으면 기존 NMR에서는 거의 신호가 관찰되지 않습니다. CONDENSE-MT는 희석상과 응축상 분자 종 간의 이완 차이에 의존하는 수중 관찰 기법으로서 이 검출 한계를 우회합니다.

REDIFINE과 CONDENSE-MT의 성공적인 적용을 위해서는 적절한 시료 준비가 핵심입니다. 따라서 아가로스가 완전히 용융된 상태에서 혼합물로 옮기는 것이 중요하며, 이는 전달 과정에서 광범위한 기포 형성을 방지하고, 처음에는 유리벽에 달라붙는 이상식 혼합물로 NMR 튜브를 안정적으로 채울 수 있는 충분한 물질을 제공하는 것입니다. CONDENSE-MT의 경우, 아가로스 배경이 별도로 정량화되므로 주어진 양의 아가로스를 재현 가능하게 전송하는 것이 매우 중요합니다. 응축상과 희석상 간 생체분자의 분배가 매우 왜곡되거나, 상상 간 교환이 매우 느리거나 빠르면 REDIFINE이나 CONDENSE-MT 효과가 없거나 신뢰할 수 있는 정량화가 너무 약할 수 있습니다. 이것이 이러한 기술의 주요 한계점일 수 있습니다. 하지만 이런 경우에는 온도를 올리거나 내리는 것이 도움이 될 수 있는데, 온도는 분자 분배와 화학 교환 속도를 강력한 조절자이기 때문입니다. 데이터셋을 획득한 후에는 초기 또는 이전 적합의 최적 적합 매개변수를 입력값으로 사용하여 계산 최적화를 반복하여 반복하여 최적의 적합 결과를 얻는 경우가 많습니다.

강한 REDIFINE 및 CONDENSE-MT 효과를 내는 시스템의 경우, 이러한 실험은 다른 라벨 없는 방법으로는 달성하기 어려운 분자 분배, 교환율, 분자 역학에 대한 라벨 없는 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한, NMR 기반 방법은 일반적으로 비침습적이어서 샘플을 여러 번 분석하거나 장기간 보관할 수 있어 응축수 특성을 시간에 따라 모니터링할 수 있습니다. 이는 병리적 응축액 섬유화 성숙 맥락에서 특히 중요한데, 이는 상보적 방법으로 매우 장기간 연구하기 어려운 분야입니다.

막이 없는 세포 소기관은 일반적으로 복잡한 구조를 가진 다성분 조립체이므로, 이 기법의 향후 응용 분야로는 점점 정교해지는 다성분 응축수 모델 시스템의 검출 및 특성 분석, 그리고 세포 내 NMR을 통한 응축액 분석이 포함될 것입니다. 하지만 이를 위해서는 REDIFINE이나 CONDENSE-MT를 이러한 복잡한 시스템에 적응시키는 작업이 필요하며, 이를 위한 노력이 진행 중입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
700 MHz 아방스 NEO NMR 분광기	브루커 바이오스핀	https://www.bruker.com/en.html	데이터는 700 MHz NMR 분광기로 수집됩니다.
탑스핀	브루커 바이오스핀	https://www.bruker.com/en.html	데이터는 이 소프트웨어를 통해 처리됩니다.
FUS NTD 단백질		해당 없음	이 단백질은 우리 실험실에서 발현 및 정제됩니다
31xCAG RNA		해당 없음	RNA는 우리 실험실에서 생성되고 정제됩니다
MATLAB	수학 작품	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	데이터는 이 소프트웨어를 사용하여 처리되고 시각화됩니다.