시험관 내 조절 T 세포의 기능 분석: 증식과 분화에 초점을 맞춘다

요약

이 프로토콜은 조절 T 세포가 이펙터 T 세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 조사하기 위한 시험관 내 공동 배양 전략을 제공합니다.

초록

조절 T(Treg) 세포는 면역 항상성 유지에 중요한 역할을 합니다. Treg 세포 기능의 이상은 자가면역 질환, 장기 이식 거부, 감염, 암 등 다양한 질병과 관련이 있습니다. Treg 세포 조작은 자가면역 질환, 고형 장기 이식 거부, 이식편 대숙주 질환, 알레르기 질환 등 염증성 질환 치료에 잠재적 치료 전략으로 간주됩니다. 고전적인 시험관 내 Treg 세포 억제 분석은 주로 Treg 세포가 이펙터 T(Teff) 세포 증식에 미치는 억제 효과를 평가합니다. 하지만 증식 외에도 T 세포 분화는 T 세포가 면역 기능을 수행하는 데 중요합니다. 따라서 이 프로토콜은 테프 세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 조사하기 위한 수정된 시험관 내 Treg 세포 억제 분석법을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 먼저 마우스 Treg 세포와 나이브 T 세포의 준비를 도입하고, 이어서 Treg 세포가 Teff 세포(Th1 및 Th17 세포를 포함)의 증식 및 분화에 미치는 조절 효과를 연구하는 공동 배양 전략, 마지막으로 공동 배양 후 유동 세포분석의 염색 전략을 제시합니다. 이 시험관 내 Treg 세포 기능 분석은 T-세포 증식 및 분극에 미치는 영향을 조사하는 데 활용될 수 있습니다.

서론

CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ 조절 T(Treg) 세포는 면역 항상성의 중요한 매개체입니다^. 트레그 세포는 과도한 면역 반응을 적극적으로 억제하고 자가면역 내성을 유지하여, 면역 반응이 정상 조직과 장기를 손상시키는 것을 방지합니다². 트레그 세포 조작은 자가면역 질환, 고형 장기 이식 거부, 이식편 대숙주 질환, 알레르기 질환 등 염증성 질환 치료에 잠재적 치료 전략으로 간주됩니다 ^3,4,5. 한편, Treg 세포의 기능을 억제하는 것은 항종양 면역을 활성화하는 효과적인 전략으로 간주됩니다 ^6,7. 임상 연구에서는 자가면역 질환, 고형 장기 이식, 이식편 대숙주 질환에 대한 채택 조절 T 세포 치료 또는 저용량 IL-2 치료가 조사되었습니다 ^8,9,10. 더불어, 키메라 항원 수용체(CAR)-Treg 세포와 T-세포 수용체(TCR)-Treg 세포를 포함한 조작된 Treg 세포에 대한 연구도 점점 더 주목받고 있습니다^11,12.

현재까지 Treg 세포 치료는 일상적인 임상 치료에서 널리 확립되지 않았습니다. Treg 세포 치료의 임상 적용을 지원하기 위해서는 그 기능에 대한 체계적인 연구와 평가가 중요합니다. 시험관 내에서 조절 T 세포의 기능을 평가하는 일반적인 전략은 시험 관 내 Treg 억제 검사¹³으로, 이는 효과기 T(Teff) 세포 증식에 대한 Treg 세포의 억제 기능을 감지할 수 있습니다. 그러나 표준 시험관 내 트레그 억제 검사는 Teff 세포의 분화를 평가하지 않습니다. 효과기 T 세포의 증식과 분화를 동시에 평가할 수 있다면, 조절 T 세포의 기능에 대한 더 많은 정보를 얻을 수 있습니다.

여기서는 "트레그 세포의 시험관 내 기능 분석"이라 불리는 수정된 시험관 내 Treg 세포 억제 분석법을 제시합니다(그림 1). 이 프로토콜은 Treg 세포가 Teff 세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 조사하기 위한 시험관 내 공동 배양 전략을 제공합니다.

프로토콜

모든 쥐 실험은 쓰촨성 대학교 화서병원 동물윤리위원회(승인번호 20250814006, 2021121A)의 승인을 받았습니다. 이 실험에 사용된 모든 쥐는 C57BL/6 유전적 배경을 가지고 있었습니다.

1. 해의 준비

1. 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충제: 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 1× PBS를 준비합니다.
2. 자기성 활성화 세포 분류(MACS) 버퍼를 준비합니다: 0.5% BSA와 2 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)을 포함한 1× PBS.
3. 세포 배양 배지를 준비하세요: 10% 태아 소 혈청(FBS), 1 mM 피루브산 나트륨, 2 mM L-글루타민, 10 mM HEPES, 55 μM β-머캡토에탄올, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 포함한 RPMI 1640 배지.

2. C57BL/6 마우스 림프구 준비

1. 6주에서 8주 된 C57BL/6 마우스(수컷 또는 암컷)의 비장과 말초 림프절(LN)을 멸균 상태에서 50mL 원심분리관에 5mL FACS 완충액과 함께 넣습니다.
   참고: 비장과 LNs의 해리는 표준 절차에 따라 이루어져야 합니다.
2. 50 mL 원심분리관에 70 μm 세포 체를 놓고, 비장과 LN을 체에 올린 뒤 5 mL 주사기 피스톤으로 1분간 부드럽게 조직을 갈아줍니다. 갈아줄 때는 FACS 버퍼로 체를 3번 헹구세요. 모든 조직을 완전히 갈아서 세포를 원심분리기 튜브에 헹구는 것을 잊지 마세요. 갈아버린 후에는 체를 제거하세요.
3. 4°C, 350 g 원심분리기에서 7분간 ×.
4. 상정액을 제거하고, 세포 펠릿을 3mL의 적혈구 용해 완충제에 다시 현탁한 후 상온에 3–5분간 둡니다.
5. 즉시 FACS 완충제를 원심분리관에 15–20mL 용량으로 추가하여 용해를 종료하고, 4°C, 350 g ×에서 7분간 원심분리합니다.
6. 상상액을 제거하고 FACS 완충액 10mL를 추가한 후 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다.
7. 세포 현탁액 10 μL를 사용해 트리판 블루 염색을 사용하여 총 살아있는 림프구 수를 세세요.
   참고: 이 세포들은 CD45.2⁺ 림프구입니다.

3. CD45.1 마우스 림프구 준비

1. 6주에서 8주 된 CD45.1 마우스(수컷 또는 암컷)의 비장과 LN을 멸균 조건에서 50mL 원심분리관에 5mL FACS 완충액과 함께 넣습니다.
2. 위에서 설명한 동일한 과정을 따라 CD45.1 마우스의 림프구를 준비합니다.
   참고: 이 세포들은 CD45.1⁺ 림프구입니다.

4. CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ 순생 T 세포의 준비

참고: 전체 과정은 MACS용 CD4⁺CD62L⁺ T 세포 분리 키트를 사용합니다. MACS 완충기는 4°C에서 미리 냉각되며, 모든 원심분리 조건은 4°C, 350 × g 에서 7분간 진행됩니다.

1. C57BL/6 마우스의 세포 현탁액을 수집한 후 원심분리기로 상원액을 버리고, 총 10×⁸개의 초기 세포마다 400 μL MACS 버퍼와 100 μL ^CD4+ T 세포 비오틴-항체 칵테일을 원심분리관에 추가합니다. 부드럽게 섞고 4°C에서 어둠 속에서 5분간 배양하세요.
2. 4.1단계부터^10-8 개의 초기 세포×마다 300 μL MACS 완충제와 200 μL 항-비오틴 미생물구슬을 원심분리관에 추가합니다. 부드럽게 섞고 4°C에서 어두운 곳에서 10분간 배양하세요.
3. MACS 완충액 10mL를 넣고 원심분리기를 한 후 상원액을 버립니다. 세포 펠릿을 2mL의 MACS 버퍼에 재현탁합니다.
4. LS 열을 적절한 MACS 분류 자기 분리기에 올려놓으세요. 3mL의 MACS 버퍼를 사용해 컬럼을 세척하세요. 컬럼 내 버퍼가 완전히 배수될 때까지 기다렸다가 다음 단계로 넘어가세요.
   참고: LS 컬럼의 최대 셀 하중 용량은 양성 및 음수 셀을 포함해 2 × 10⁹ 셀이며, 최대 포착 가능한 양성 셀 수는 1 × 10⁸입니다. 보통 단일 마우스는 여기서 LS 열 하나만 필요합니다.
5. 4.3단계에서 셀 서스펜션을 LS 컬럼에 올립니다. 세포 현탁액이 완전히 컬럼으로 흘러들어오면, 3mL의 MACS 버퍼를 사용해 컬럼을 세척합니다. 모든 흐름 액체를 새로운 15mL 원심분리관에 모으세요.
   참고: 이들은 총 CD4⁺CD25^– T 세포입니다.
6. 4.5단계에서 얻은 전체 CD4⁺CD25^– T 세포를 원심분리하여 상정액을 버리고 세포 펠릿을 얻습니다.
7. 총 10 8개 초기 세포마다 800 μL MACS 버퍼와 200 μL CD62L 마이크로비즈×를 세포 펠릿에 추가합니다. 부드럽게 섞고 4°C에서 어두운 곳에서 10분간 배양하세요.
8. 원심분리관에 10mL의 MACS 버퍼를 추가하고, 원심분리하여 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 500 μL MACS 버퍼에 재현탁합니다.
9. MS 컬럼을 적절한 MACS 분류 자기 분리기에 올려놓고 1 mL MACS 버퍼를 사용해 컬럼을 헹구세요.
10. 셀 서스펜션을 MS 컬럼에 올려. 현탁액이 완전히 컬럼으로 흘러들어오면, 1mL의 MACS 버퍼를 사용해 컬럼을 2번 세척합니다.
11. MS 컬럼을 자기 분리기에서 분리하여 새로운 15mL 원심분리기 튜브에 올려놓으세요. 1mL의 MACS 버퍼를 컬럼에 추가하고 즉시 플런저를 단단히 눌러 자기 구슬로 표지된 세포를 용출합니다.
12. 세포 수를 세고, 원심분리하여 상원액을 버리고, 적절한 양의 배양지에 재현탁한 후 튜브를 얼음 위에 보관하세요.
    참고: 이 세포들은 CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ 나이브 T 세포입니다. 보통 한 마리의 마우스에서 약 8 ×^{10 6} 에서 ×10^{7 7} CD4⁺CD25^–CD62L⁺ 순진한 T 세포를 정제할 수 있습니다; 말초 림프절을 포함하면 수율이 증가할 수 있습니다.
13. 분리된 세포의 순도를 결정하세요: 5개 × 10개 4^{개의 분리된} CD4⁺CD62L⁺ T 세포를 1.5mL 원심분리관에 50 μL 항체 용액에 재현탁합니다.
    참고: 항생쥐 CD4 PerCP-Cy5.5 항체, 항생쥐 CD62L FITC 항체, 항생쥐 CD25 PE 항체를 FACS 버퍼에 1:100 비율로 첨가하여 항체 용액을 준비하십시오.
14. 어두운 환경에서 4°C에서 20분간 배양한 후, 세포를 세척하기 위해 FACS 완충제 1mL를 추가합니다. 세포를 원심분리하여 상원액을 제거한 후, 펠릿을 200 μL FACS 버퍼에 재현탁합니다.
15. 유세포분석을 통해 샘플의 순도를 검출합니다.
    참고: 유동세포계 분석에 대한 자세한 내용은 기기 사용 설명서 또는 이전에 보고된 프로토콜¹⁴를 참조하십시오. 분리된 T 세포 샘플에서 CD4⁺CD25^–CD62L⁺ 순도는 95% 이상이어야 합니다(그림 2).

5. CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg 풍부 세포 및 항원제시 세포 비CD4⁺ 세포의 제조

참고: 전체 과정은 MACS용 CD4⁺CD25⁺ 조절 T 세포 분리 키트를 사용하며, 키트 내 지침은 항원 제시 세포(APC) 비CD4⁺ 세포와 CD4⁺CD25⁺ Treg 풍부 세포를 동시에 얻을 수 있도록 최적화되어 있습니다. MACS 완충기는 4°C에서 미리 냉각되며, 모든 원심분리 조건은 4°C, 350 × g에서 7분간 진행됩니다.

1. CD45.1 마우스의 세포 현탁액을 원심분리기로 채취한 후 상원액을 버리고, 10^{× 8개의} 초기 세포마다 400 μL 예냉 MACS 버퍼와 100 μL CD4⁺CD25⁺ 조절 T 세포 비오틴-항체 칵테일을 원심분리관에 추가합니다. 부드럽게 섞고 4°C에서 어두운 곳에서 10분간 배양하세요.
2. 세척하지 않고 5.1단계부터 1^{× 총} 10개 8개 초기 세포당 380 μL 예냉된 MACS 버퍼 380 μL, 200 μL 항비타민 항체 CD25-PE 항체를 원심분리관에 직접 추가합니다. 부드럽게 섞고 4°C에서 어두운 곳에서 15분간 부양하세요.
3. 원심분리관에 10mL의 MACS 버퍼를 추가한 후 상원액을 버린 후, 총 10×⁸ 개의 초기 세포당 500 μL MACS 버퍼에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
4. LD 컬럼을 적절한 MACS 분류 자기 분리기에 올려놓고 2mL의 MACS 버퍼로 헹군다. 컬럼 내 버퍼가 완전히 배수될 때까지 기다렸다가 다음 단계로 넘어가세요.
5. 5.3단계의 셀 서스펜션을 천천히 LD 컬럼에 적재하세요. 세포 현탁액이 완전히 컬럼으로 유입되면, 2 mL MACS 버퍼로 컬럼을 2회 세척합니다. 모든 흐름 액체를 새로운 15mL 원심분리관에 모으세요.
6. LD 컬럼을 자기 분리기에서 분리하여 새로운 15mL 원심분리관 위에 올려놓습니다. LD 컬럼에 3mL의 MACS 버퍼를 추가하고, 즉시 플런저를 단단히 눌러 마이크로비즈 표지된 비CD4⁺ 세포를 배출합니다. 세포 수를 세고, 원심분리기로 하며, 적절한 양의 세포 배양 배양지에 재현탁하여 1 ×¹⁰ 7 세포/mL의 세포 농도를 달성한 후 튜브를 얼음 위에 보관하세요.
   참고: 이러한 비^CD4+ 세포는 주로 대식세포, 수지상세포, B 세포와 같은 APC로 구성됩니다. 이 프로토콜에서는 이 세포들을 APC 농축 비-CD4⁺ 분획으로 사용합니다.
7. 5.5단계에서 채취한 전체 CD4⁺ T 세포를 원심분리하여 상원액을 버리고 세포 펠릿을 얻습니다.
8. 총 10×⁸ 개의 초기 세포마다 900 μL MACS 버퍼와 100 μL 항 PE 마이크로비즈를 세포 펠릿에 추가합니다. 부드럽게 섞고 4°C에서 어두운 곳에서 15분간 부양하세요.
9. MS 컬럼을 적절한 MACS 분류 자기 분리기에 올려놓고, 500 μL 미리 냉각된 MACS 버퍼로 컬럼을 세척합니다. 컬럼 내 버퍼가 완전히 배수될 때까지 기다렸다가 다음 단계로 넘어가세요.
10. 5.8단계의 셀 현탁을 천천히 MS 컬럼에 적재하세요. 세포 현탁액이 완전히 컬럼으로 유입되면 1 mL MACS 버퍼로 컬럼을 2회 세척합니다. 새로운 15mL 원심분리관에 흐르는 액체를 수집합니다.
    참고: 현재 흐름 액체 내 세포는 CD4⁺CD25^– T 세포입니다.
11. MS 컬럼을 자기 분리기에서 분리하여 신선한 15mL 원심분리관 위에 올려놓습니다. 컬럼에 1mL의 MACS 버퍼를 추가한 후, 플런저를 즉시 눌러 자기 구슬로 표지된 CD4⁺CD25⁺ Treg 풍부 세포를 회수합니다.
12. 세포 수를 세고 나서 현탁액을 원심분리하여 상청액을 제거합니다. 펠릿을 충분한 배양지에 재현탁하여 최종 농도가 2 ×^{10 6} cells/mL로 되돌리고, 튜브를 얼음 위에 보관하세요.
    참고: 이 세포들은 CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg 풍부 세포입니다. 보통 한 마리의 쥐에서 약 8 × 10⁵에서 1 × 10^{6 CD4+}CD25⁺ 세포를 정제할 수 있습니다; 말초 림프절을 포함하면 수율이 증가할 수 있습니다.
13. 분리된 CD4⁺CD25⁺ Treg 풍부 세포의 순도를 결정하라: 각각 5개 × 10개 4개의 분리된 CD4⁺CD25⁺ Treg 풍부한 세포와 5개의 × 10⁴개의 분리된 APC 풍부하지 않은 비-^CD4+ 세포를 50 μL 항체 용액에 재현탁한다.
    참고: 항체 용액을 FACS 버퍼에 1:100 비율로 추가하여 항생쥐 CD4 PerCP-Cy5.5 항체와 항생쥐 CD25 PE 항체를 준비하십시오. 여기 있는 동일한 항마우스 CD25 PE 항체를 사용하여 CD4⁺CD25⁺ 세포가 적절히 표지되어 있고, 비-CD4⁺ 분획에 CD4⁺CD25⁺ T 세포가 없음을 확인해 보세요. Treg 세포의 보다 엄격한 식별을 위해 항마우스 Foxp3 PB 항체를 이용한 세포 내 염색도 시행할 수 있습니다.
14. 4°C에서 어두운 환경에서 20분간 배양한 후, 세포를 세척하기 위해 FACS 완충제 2mL를 추가합니다. 세포를 원심분리하여 상원액을 제거한 후, 펠릿을 200 μL FACS 버퍼에 재현탁합니다.
15. 유세포분석을 통해 샘플의 순도를 검출합니다.
    참고: Treg 농축 세포 집단의 순도가 실험 요구사항을 충족하도록 CD4⁺CD25⁺ 세포의 빈도는 95%로 ≥해야 합니다(그림 2). APC 농축 분획으로 사용되는 비CD4⁺ 세포는 CD4⁺ T 세포 비율이 5%를 넘지 않아야 합니다(그림 2).

6. 세포 증식 염료를 이용한 순진한 CD4⁺ T 세포의 표지

참고: 모든 원심분리 조건은 4°C, 350 g × 7분 동안 가능합니다. PBS 완충류는 사용 전에 실온에 미리 평형화됩니다. 라벨링 과정은 염료 담금질을 방지하기 위해 빛 보호 하에서 진행됩니다.

1. 순진한 CD4⁺ T 세포 현탁액을 원심분리하여 상원액을 버리고 세포 펠릿을 얻습니다.
2. 세포 증식 염료 eFluor 450을 PBS에 희석하여 상온에서 20 μM 농도를 얻습니다.
3. 10×⁷ 개의 세포당 0.5mL의 PBS를 첨가합니다. 튜브를 약 45°로 기울인 상태로 유지하고, 피펫팅으로 50회 위아래로 부드럽게 세포를 재현탁하세요.
4. 세포 증식 염료 용액을 같은 부피로 빠르게 세포 현탁액에 첨가하여 최종 농도가 10 μM이 되도록 합니다. 튜브를 약 45° 기울인 상태로 유지하고, 세포와 증식 염료 사이에 50회 피펫팅으로 세포를 위아래로 섞어 완전히 접촉하도록 합니다.
5. 즉시 원심분리기 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 빛 노출을 피하세요. 실온에서 20분간 부화하세요. 세포 모임을 막기 위해 5분마다 부드럽게 소용돌이를 돌리세요.
6. 원심분리관에 10mL의 미리 냉각된 세포 배양지를 넣고, 염색을 부드럽게 소용돌이로 마무리한 후 원심분리기로 상청액을 버립니다.
7. 세포 펠릿에 5mL의 미리 냉각된 세포 배양지를 넣고 원심분리기를 사용한 후 상상액을 버려 세포를 세척합니다.
8. 다시 5mL의 미리 냉각된 세포 배양지를 세포 펠릿에 넣고 세포를 재현탁합니다.
9. 세포 수를 세고, 원심분리하여 상원액을 버리고, 적절한 양의 배양지에 재현탁하여 세포 농도를 2 ×⁶ cells/mL로 만들고, 튜브를 얼음 위에 보관합니다.

7. Treg 세포의 시험관 내 기능 분석 설정

1. 세포 배양에 필요한 샘플 수를 계산하고, 2.5 μg/mL 항생쥐 CD3 항체 또는 유도 사이토카인을 포함한 적절한 양의 세포 배양지를 준비한 뒤, 준비된 CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ 순생 T 세포, CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg 풍부 세포, APC 비CD4⁺ 세포를 부드럽게 소용돌이로 돌리세요.
   참고: 반응자 T(Tresp) 세포로 CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ 를 사용하세요. 이 예제 실험은 Treg 세포가 Th1 및 Th17 세포의 분화 및 증식에 미치는 영향을 연구합니다. 따라서 세포 배양을 위한 샘플은 총 네 가지입니다: Treg 풍부 세포가 존재하거나 없을 때 Th1 또는 Th17 유도 조건에서 배양된 Tresp 세포입니다.
2. 48웰 플레이트에 100 μL CD45.2⁺CD4⁺ 나이브 T 세포(웰당 2× 10⁵ 세포)를 추가합니다.
3. 48웰 플레이트에 100 μL CD45.1⁺ APC 농축 비CD4⁺ 세포(웰당 10×⁶ 세포)를 추가합니다.
4. 실험 웰에 CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg 풍부 세포 100 μL(웰당 10⁵ 세포 2× 추가하고, 대조 웰에는 100 μL 세포 배양지를 추가합니다. 실험 샘플에서 Treg 농축 세포: Tresp 비율은 1:1입니다.
   참고: Treg 셀과 Tresp 셀의 비율은 필요에 따라 설정할 수 있으며, 여러 비율로 구성된 패널을 설계할 수도 있습니다. Tresp 세포의 수는 공동 배양에서 고정되어 있으며, Treg 세포의 수는 필요에 따라 변경할 수 있습니다. 일반적으로 실험 샘플에서 Treg와 Tresp 비율은 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 0:1 등이 있습니다. 더 나아가, 각 실험 조건은 무작위 실험 오차를 최소화하기 위해 3배로 준비할 수 있습니다. 명확성을 위해 이전 연구 경험^15,16을 기준으로 1:1 비율을 예시로 사용한다.
5. 각 웰에 2.5 μg/mL 항생쥐 CD3 항체를 포함한 세포 배양 배지 100 μL을 첨가합니다.
   참고: 항생쥐 CD3 항체의 최종 농도는 0.5 μg/mL입니다. 실험 샘플 외에도, 항생쥐 CD3 항체가 없는 빈 대조군 샘플을 설정합니다. 이 샘플에 항마우스 CD3 항체가 없는 T 세포 배양 배지 100 μL을 첨가하여 증식되지 않은 T 세포의 형광 강도 또는 피크 0의 강도를 측정합니다. 이를 통해 확산 분포의 정확한 보정이 가능합니다.
6. 각 웰에 지정된 사이토카인을 포함한 세포 배양 배양액 100 μL을 추가하여 각 웰의 최종 부피가 500 μL로 만듭니다.
   참고: 이 실험에서는 최종 농도 10 ng/mL의 재조합 마우스 IL-12 p70을 사용하여 Th1 세포를 유도하고, 최종 농도인 2 ng/mL의 재조합 인간 TGF-β1과 50 ng/mL의 재조합 마우스 IL-6를 사용하여 Th17 세포를 유도합니다.
7. 나머지 빈 웰(500 μL/웰)에 PBS를 첨가하여 플레이트의 습도를 유지하고 가장자리 효과를 줄입니다.
8. 48웰 플레이트를 37°C의 5%_CO2 인큐베이터에서 3일간 배양하세요.
   참고: 이 공동 배양 시스템에서 용해성 항생쥐 CD3 항체는 T 세포 활성화를 위한 1차 T 세포 수용체(TCR) 신호를 제공하며, APC 비농축 비CD4⁺ 세포는 T 세포를 완전히 활성화하는 공공자극 신호를 제공합니다. TCR 및 공동자극 신호는 플레이트 코팅된 항생쥐 CD3 항체와 용해성 항생쥐 CD28 항체에 의해서도 유발될 수 있습니다. 연구자들은 필요에 따라 자극 방법을 선택할 수 있습니다.

8. 트레그 세포의 시험관 내 기능 분석

참고: 모든 원심분리 조건은 4°C, 350 g × 7분간 가능합니다.

1. 배양된 세포를 부드럽게 피펫으로 재현탁한 후 1.5mL 원심분리관으로 현탁액을 옮깁니다. 세포를 원심분리하고 상원액을 제거하세요.
2. 각 튜브에 5 ng/mL PMA, 1 μg/mL 이오노마이신, 1:1,000 희석된 골지플러그 단백질 운반 억제제를 포함한 세포 배양 배지 500 μL를 넣고, 부드럽게 소용돌이를 하여 세포를 재현탁시키고, 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터에서 3시간 배양합니다.
3. 원심분리기에서 상원액을 버리고, Zombie Yellow 염료 1회와 1:100 희석된 항생쥐 CD16/32 항체를 포함한 PBS 50 μL을 각 샘플에 첨가한 후 소용돌이 후 실온에서 어두운 환경에서 15분간 배양하여 죽은 세포를 표지하고 Fc 수용체를 차단합니다.
4. 원심분리기에서 상원액을 버리고 50 μL 표면 항체 혼합물을 첨가한 후 4°C에서 20분간 어두운 환경에서 배양합니다.
   참고: 표면 항체 혼합물을 준비하기 위해 1:200 비율로 항CD4 PerCP-Cy5.5 항체, 항CD45.1 FITC 항체, 항CD45.2 APC-eFluor 780 항체를 FACS 버퍼에 첨가하세요.
5. 각 원심분리관과 원심분리기에 1mL의 FACS 버퍼를 추가한 후 상청액을 버립니다.
6. 각 원심분리관에 300μL의 고정 및 투과액을 추가하고, 소용돌이를 보류한 후 4°C에서 어두운 환경에서 20분간 배양합니다.
7. 각 원심분리관, 원심분리기에 1× mL 투과/세척(Perm/wash) 버퍼 1mL를 추가한 후 상원액을 버립니다; 그 후 이 세척 과정을 한 번 반복하여 잔여 고정액을 완전히 제거하세요.
8. 사이토카인 항체 혼합물 50 μL을 추가하고, 소용돌이로 4°C에서 어두운 환경에서 40분간 배큐합니다.
   참고: 사이토카인 항체 조합을 준비하기 위해 퍼름/워시 버퍼에 항-IFN-γ PE 항체와 항-IL-17A PE-Cy7 항체를 1:100 비율로 첨가하세요.
9. 각 샘플을 1mL의 Perm/Wash 완충액으로 세척하고, 세포를 원심분리한 후 상원액을 제거합니다. 펠릿을 300 μL FACS 버퍼에 재현탁합니다.
10. 유세포분석을 통해 Tresp 세포의 증식 및 분화를 측정합니다. 다음과 같은 게이팅 전략(그림 3)을 사용하세요: 먼저, 전체 세포 내에서 림프구 집단을 게이트시키고 세포 잔해와 불순물을 배제합니다; 둘째, 산란 신호를 기반으로 림프구 내 단일 세포 집단을 게이트화한다; 셋째, 단일 세포 사이에 생세포 집단을 게이트화하는 것; 넷째, 살아있는 세포들 사이의 CD4⁺ T 세포 집단을 게이트화합니다; 다섯째, ^CD45.1+ Treg 풍부 세포군과 CD45.2⁺ Teff 세포군을 CD4+ T 세포 집단에 게이트화하는 것; 여섯째, 게이트 CD45.2⁺CD4⁺IFN-γ⁺ Th1 세포, CD45.2⁺CD4⁺IL-17A⁺ Th17 세포, 그리고 CD45.2+CD4+ T 세포 내 비증식된 CD45.2⁺CD4⁺ T 세포입니다.
11. 유세포측측 데이터를 수집하고 데이터를 분석합니다.
    1. 세포 증식 염료 eFluor 450으로 표지한 배양 T 세포를 단일 염색 대조군으로 사용하세요. 세포 증식 염료로 표지되지 않은 배양 T 세포로 좀비 옐로우 염료 단일 염색 대조군을 준비합니다. 다른 단일 염색 대조군은 각 형광체마다 보상 비즈를 준비합니다.
    2. 세포 증식 염료 eFluor 450으로 표지하고 항생쥐 CD3 항체 없이 배양한 T 세포를 사용하여 비증식 세포의 게이트를 정의합니다.
    3. 세포 증식 염료로 표지하고 좀비 옐로우 염료로 염색한 배양 T 세포, 모든 세포 표면 항체, 항생쥐 IFN-γ PE 항체 및 항생쥐 IL-17A PE-Cy7 항체의 아이소타입 대조를 사용하여 IFN-γ⁺CD4⁺ 및 IL-17A⁺CD4⁺ T 세포의 게이트를 정의합니다.

결과

대표적인 실험에서는 나이브 T 세포를 Tresp 세포로 사용하여 Treg 풍부 세포가 Th1 및 Th17 세포의 증식과 분화에 미치는 영향을 조사했습니다. 이 실험에서 Tresp 세포는 항마우스 CD3 및 APC 풍부 비CD4⁺ 세포에 의해 활성화된 후, IL-12 p70 유도 하에 Th1 세포 또는 TGF-β1 및 IL-6 유도 하에 Th17 세포로 분화하였습니다. 이 두 유도 조건 하에서, Treg 풍부 세포를 1:1 비율로 첨가한 후 Tresp 세포의 증식 및 분화 변화가 연구되었습니다.

CD45.2⁺CD4⁺ Tresp 세포를 CD45.1⁺CD4⁺ Treg 풍부 세포와 공동 배양했을 때, Th1 및 Th17 유도 조건 모두에서 증식되지 않은 Tresp 세포의 빈도가 유의하게 증가하여(그림 4A, B

토론

본 연구에서 Th1 유도 조건에서의 공동 배양 결과는 Treg 세포가 Th1 세포 증식 및 분화를 억제할 수 있다는 이전 보고와 일치한다^17,18. Treg 풍부 세포는 Th17 유도 조건에서 Tresp 세포의 증식을 억제했습니다. 그러나 여기서 사용된 Th17 분극 조건 하에서, Treg 풍부 세포가 존재하는 IL-17A⁺ Tresp 세포의 빈도가 증가하는데, 이는 Treg 세포가 Th17 세포 분화를 억제할 수 있다는 이전 보고와는 다르다^19,20. 이 데이터는 Treg 세포가 Tresp 세포에 미치는 영향이 유도 조건과 분석된 측정값에 따라 달라질 수 있음을 시사합니다. 이 분석법은 유전적 또는 기능적으로 변형된 Treg 세포의 기능을 ...

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 원심 분리기 튜브	Thermo Fisher Scientific	3457IW	또는 동등
12.5 μL 필터 피펫 팁	Thermo Fisher Scientific	94420043	또는 동등
1250 μL 필터 피펫 팁	Thermo Fisher Scientific	94420813	또는 동등
15 mL 원추형 원심 분리기 튜브	Thermo Fisher Scientific	339650	또는 동등
200 μL 필터 피펫 팁	Thermo Fisher Scientific	94420318	또는 동등
48웰 플레이트	Corning Incorporated	3548	또는 동등
5 mL 주사기 피스톤	Shifeng Medical	SB2-061(A)	또는 동등
50 mL 원추형 원심 분리기 튜브	Thermo Fisher Scientific	339652	또는 동등
50 μL 필터 피펫 팁	Thermo Fisher Scientific	94420258	또는 동등
70 μm 세포 스트레이너	Biosharp Life Sciences	BS-70-CS	또는 동등
Anti-mouse CD28 항체	BioXcell	BE0015-1	또는 동등
Anti-mouse CD3 항체	BioXcell	BE0001-1	또는 동등
Anti-mouse CD4 PerCP-Cy5.5 (RM4-5)	Thermo Fisher Scientific	45-0042-82	또는 동등
Anti-mouse Foxp3 PB (FJK-16s)	Thermo Fisher Scientific	48-5773-82	또는 동등
Anti-mouse IFN-gamma PE (XMG1.2)	BioLegend	505808	또는 동등
Anti-mouse IL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)	Thermo Fisher Scientific	25-7177-82	또는 동등
Beckman CytoFLEX S 유세포 분석기	Beckman Coulter	N/A	면역 세포 샘플의 유세포 분석 데이터 획득용
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CD4+CD62L+ T 세포 분리 키트, 마우스	Miltenyi Biotec	130-106-643	세포 분류용
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