자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 L-락산을 과생산하는 바실루스 응고 체 돌연변이체의 고처리량 스크리닝

요약

이 프로토콜은 산업 미생물을 위한 표준 고처리량 스크리닝 워크플로우를 제공합니다. 이 과정은 ARTP 돌연변이 유발을 통해 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 자동화된 마이크로플루이딕스를 이용한 양성 액상 스크리닝을 수행하며, 이후 결과를 검증하는 과정을 포함합니다. 이 워크플로우의 신뢰성은 고수율 B. coagulans 균주를 스크리닝하여 검증되었습니다.

초록

산업용 바이오제조는 미생물을 통해 설계된 조건에서 표적 제품을 효율적으로 합성합니다. 하지만 야생형 균주는 고유한 대사 네트워크 때문에 이를 수행할 능력이 부족한 경우가 많습니다. 따라서 대규모 돌연변이 라이브러리에서 고성능 균주를 신속하고 정확하게 스크리닝하는 것은 산업 미생물 육종에서 매우 중요한 단계입니다. 최근 몇 년간 드롭렛 마이크로플루이딕 기술은 높은 처리량, 낮은 소비량, 단일 세포 구획화 능력으로 큰 주목을 받으며 수많은 단일 세포 분류 시스템 개발로 이어졌습니다. 이 연구에서는 자동화된 액상 마이크로유체 플랫폼을 이용한 산업용 미생물 균주에 대한 고처리량 스크리닝 프로토콜을 제시합니다. 통합 작업 흐름은 네 가지 주요 단계로 구성됩니다: 대기 및 상온 혈장(ARTP)을 통한 돌연변이 라이브러리 구축; 고효율 단세포 캡슐화와 피콜리터 규모 액상 내 통제된 미세 배양; 형광 바이오센서의 정밀 피코 주입 후 형광 활성화 물방울 분류(FADS)를 통해 고생성 변이체를 포함한 방울을 분리하는 방법; 그리고 마이크로플레이트와 쉐이크플라스크 발효를 통한 선별 후보 균주의 검증. 완전하고 통합된 스크리닝 워크플로우가 표준화된 템플릿으로 의도되었으며, 그 검증은 B . 응고균 의 고수율 L-젖산 생성 돌연변이체를 분리하여 입증됩니다. 이 자동화된 고처리량 스크리닝 플랫폼은 고성능 품종의 산업적 육종을 가속화할 잠재력을 지닌 강력한 기술적 솔루션을 제공합니다.

서론

산업 생명공학은 미생물과 효소를 생물촉매로 사용하여 대규모로 가치 있는 제품을 생산합니다. 이 방식은 전통적인 화학 제조보다 더 친환경적이고 효율적인 것으로 여겨집니다. 그러나 미생물의 자연 대사 네트워크는 인간이 원하는 효율적인 합성보다는 자신의 생존과 번식을 우선시하도록 진화해 왔습니다. 따라서 엄격한 조건 ^1,2,3의 산업 생산 환경을 충족하기 위해 고처리량 미생물 육종이 종종 필요합니다. 이 과정은 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발을 통해 대규모 미생물 돌연변이 라이브러리를 신속히 구축한 후, 유전자형이 뚜렷한 돌연변이체를 배양하고 표현형을 검출하는 과정을 포함합니다. 그 후 상위 균주 중 극히 일부만이 선택됩니다. 그러나 전통적인 판 기반 및 마이크로판 기반 스크리닝 기술은 번거로운 절차, 낮은 처리량, 높은 비용 때문에 제약을 받고 있습니다. 이 병목 현상과 소모성 및 시약의 상당한 소비가 결합되어 미생물 육종의 전반적인 효율성이 낮아집니다 ^4,5.

드롭렛 마이크로플루이딕스는 최근 이 문제에 대한 혁신적인 해결책으로 부상했습니다. 분자가 세포 밖으로 빠르게 확산되어 분비 생성물을 스크리닝하는 데 적합하지 않은 형광 활성화 세포 분류(FACS)와 달리, 형광 활성화 액적 분류(FADS)는 피콜리터 규모의 구획형 마이크로 반응기 ^6,7,8 내에서 단일 세포를 캡슐화합니다. 이러한 물리적 격리는 균주 간 경쟁을 방지하고, 분비된 대사산물의 국소적 축적을 가능하게 하며, 형광 바이오센서를 통한 정량적 검출을 가능하게 합니다. 따라서 FADS는 아미노산, 유기산, 효소 등 다양한 세포외 산물의 고처리량 스크리닝에 이상적인 플랫폼임이 입증되었습니다. 한 팀은 유전적으로 인코딩된 형광 바이오센서 GECFINDER를 개발했고, FADS와 결합하여 고페닐알라닌 생성 균주를 성공적으로 스크리닝하고 스크리닝 효율을 1000배 이상 향상^{시켰습니다}. 또 다른 연구팀은 형광 활성화 방울 분류 플랫폼과 유전적으로 암호화된 바이오센서를 결합하여 대장균에서 3-디하이드로시키믹산 생성 균주를 고처리량으로 스크리닝할 수 있게 했으며, 최적화된 FADS 시스템은 스크리닝 효율을 크게 향상시켜 생산량이 크게 향상된 돌연변이 균주를 분리할 수 있게 했습니다¹⁰. 일부 연구자들은 Bst DNA 중합효소 공학에 FADS 기술을 적용하였고, 획득된 돌연변이체는 열안정성과 가닥 이동 활성이 크게 향상된 것을 통해 LAMP 검출에 추가로 적용되어 반응 시간을 40분에서 10분¹¹분으로 단축시켰다.

그러나 이러한 기술 진보를 일상적인 산업 변형 개발 워크플로우로 전환하는 것은 여전히 도전적입니다. 많은 상업용 액적 마이크로플루이딕 시스템은 정교한 하드웨어에도 불구하고, 미생물 표현형 스크리닝을 위한 완전하고 직관적이며 재현 가능한 표준 운영 절차가 부족합니다. 이 격차를 해소하기 위해 모듈식 유체 제어, 사용자 친화적 소프트웨어, 표준화된 칩 설계를 통합한 자동화된 액적 마이크로유체 플랫폼이 채택되어 완전 통합 스크리닝 워크플로우 구축을 위한 이상적인 기술적 토대를 마련했습니다. 본 연구는 고수율 L-젖산 생성 B. 응고군의 고처리량 스크리닝을 검증 사례로 사용한다. 드롭릿 마이크로플루이딕 플랫폼을 기반으로 다음 워크플로우가 구축되었으며, 네 가지 주요 순차적 단계로 구성되었습니다: (1) 대기 및 상온 플라즈마(ARTP) 돌연변이 유발을 통한 다양한 돌연변이 라이브러리 구축; (2) B. 응고균의 성장과 L-젖산 생성에 최적화된 조건에서 비방울 내 고효율 단일 세포 캡슐화와 통제된 미세 배양; (3) L-락테이트 특이적 형광 바이오센서의 정밀 피코 주입 후, 우수한 생산자를 캡슐화하는 비말의 고속 분류; 그리고 (4) 셰이크플라스크 발효를 통한 엄격한 후보 검증을 통해 생산성 향상과 유전적 안정성을 확인하는 것. 이 프로토콜은 산업 미생물 육종에 종사하는 연구자 및 엔지니어가 세포외 산물의 고처리량 스크리닝이 필요한 경우를 대상으로 합니다. 특히 소분자 대사산물이나 효소를 분비하는 배양 가능한 박테리아에 적합합니다. 스크리닝 플랫폼은 대상 대사산물의 특이적 검출을 가능하게 하기 위해 액적 미세환경과 호환되는 센서를 장착해야 합니다. 특별한 배양 요구가 필요한 품종(예: 엄격한 혐기성 종)의 경우, 배양 매개변수를 조정하여 최적화하고 전용 배양 전략을 확립할 수 있습니다. 이 폐쇄 루프 표준화된 선별 워크플로우를 구축함으로써, 본 연구는 균주의 산업적 육종을 가속화할 수 있는 강력하고 전이 가능한 솔루션을 제공하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

이 연구에는 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다. 모든 실험은 순수 미생물 배양을 사용하여 수행되었으며, 인간 대상이나 실험동물은 이 연구에 참여하지 않았습니다. 다음 프로토콜에서 사용되는 모든 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 준비

주의: 생물안전 수칙을 준수하세요. B. coagulans 는 생물안전 레벨 1 생물입니다. 장갑과 실험복을 착용하세요. 모든 개방 조작은 층류 후드 내에서 수행하세요. 버기 전에 121 °C에서 20분 동안 살아있는 세포와 접촉하는 모든 물질을 오토클레이브하세요.

1. 변형 원천과 유지보수
   1. 상업용 배양 센터에서 B . coagulans ATCC 7050을 2세대 경사진 배양으로 구매하세요.
   2. 기울어진 배양물을 종자 배지에 한 루프 정도 줄이고, 50°C에서 24시간 배양합니다. 단일 군집을 골라 액체 씨앗 배지에 접종하고, 50°C, 200rpm에서 12시간 동안 키웁니다.
   3. 결과 배양물을 멸균 40% 글리세롤과 혼합하여 최종 농도는 25%(v/v)로 만들고, –80 °C에서 냉동 육즙으로 보관합니다. 각 실험 시에는 신선한 알리코트를 해동한 뒤, 씨앗 매체 아가에 줄무늬를 뿌린 후 50°C에서 24시간 배양합니다.
   4. 그 후 단일 군락을 골라 액체 종자 배지에 접종하고, 50 °C, 200 rpm에서 12시간 배양한 후 돌연변이 유발 및 선별에 사용한다(보완 그림 1).
2. 젖산 센서
   1. 보조 자료¹² (보완 그림 2)에 설명된 대로 eLACCO1.1 센서를 발현 및 정제하십시오.
   2. 정제된 센서에 5% (v/v) 글리세롤을 보충하여 –80 °C에서 보관하세요. 각 실험마다 얼음 위에 알리코트 하나를 해동한 후 즉시 멸균 10 mM PBS(pH 7.4)로 희석하여 최종 작동 농도인 0.1 mg/mL로 만듭니다.
3. 배양 배지 준비
   1. 종자 배양액(g/L: 포도당 20, 효모 추출물 5, 트립톤 10, 아세트산나트륨 2, 시트레이트 나트륨 2, K₂HPO₄ 2, MgSO₄·7H₂O 0.2, MnSO₄· H₂O 0.05, FeSO₄·7H₂O 0.01). 포도당은 115°C에서 200g/L 스톡으로 따로 20분간 멸균하세요.
      1. 나머지 부품은 121°C에서 15분간 오토클레이브합니다. 냉각 후에는 멸균 포도당 스톡을 최종 농도인 20 g/L로 추가한 후 미량 원소를 여과하여 멸균합니다.
      2. 전체 배지를 4°C에서 최대 일주일간 보관하세요. 야간 활성화, 접종 준비에 사용.
   2. 선별 배지 (g/L: 포도당 20, 효모 추출물 6.66, NaCl 0.333, NH₄Cl 0.665, KH₂PO₄ 2, Na₂HPO₄ 4.46, MgSO₄ 0.12, CaCl₂ 0.074).
      1. 포도당은 115°C에서 20분간 별도로 멸균하세요. 소금/효모 추출물 혼합물을 121°C에서 15분간 오토클레이브하세요.
      2. 식힌 후에는 멸균 포도당 스톡을 20g/L에 넣고, 4°C에서 최대 일주일간 보관하세요. 방울 생성의 수상으로, 10시간 배양 기간 동안 방울 내부의 배양지로 사용하세요.
   3. 발효 배지 (g/L: 포도당 90, 트립톤 13.33, 효모 추출물 13.33, 아세테이트 나트륨 0.67, NaCl 0.0133, MgSO₄·7H₂O 0.0133, MnSO₄· H₂O 0.0133, FeSO_{4.7H 2}O 0.0133).
      1. 포도당을 115°C에서 500g/L 육수로 20분간 멸균하세요. 다른 부품들은 121°C에서 15분간 오토클레이브합니다.
      2. 냉각 후에는 멸균 포도당 스톡을 90g/L에 넣고, 접종 직전에 멸균 CaCO₃ 분말(4% w/v)을 넣어 pH를 완충합니다. 매일 신선하게 준비하세요. 마이크로플레이트 1차 스크리닝 및 쉐이크 플라스크 검증에 사용됩니다.
         참고: 모든 미디어는 증류수를 사용해 최종 부피 1L로 준비하세요. pH를 1M HCl로 6.5로 조절하세요.

2. ARTP 이용한 돌연변이 라이브러리 구축

주의: ARTP 작동은 고주파 플라즈마와 자외선 램프를 사용합니다. 자외선은 눈과 피부 손상을 일으킬 수 있습니다. 플라즈마 방출은 오존과 고온을 발생시킵니다. 플라즈마가 켜져 있을 때는 항상 챔버 문을 닫아두세요. 실험실 가운과 자외선 차단 고글을 착용하세요. 순수 헬륨은 99.999%만 사용; 적절한 환기를 확보하세요. 돌연변이 유발 수술 후, 작업대와 돌연변이 유발 챔버 내벽을 75%(v/v) 에탄올에 담근 보풀 없는 천으로 닦아줍니다. 75% 에탄올은 매우 가연성이 강합니다. 불꽃, 불꽃, 뜨거운 표면에서 멀리 떨어져 보세요.

1. OD₆₀₀ 과 생존 가능한 세포 농도를 연관시키는 표준 곡선을 설정합니다.
   1. B. coagulans 단일 군락을 종자 배지에 접종하고 50°C, 200rpm에서 12시간 배양하여 배양이 중간 로그 단계에 도달할 때까지 보관합니다.
   2. 박테리아 현탁액을 10⁴, 10⁵, 10⁶ 경사에서 연속 희석 준비합니다.
   3. 희석액 100 μL을 피펫팅하여 씨앗 배지의 한천 플레이트에 3회로 고르게 발라.
   4. 모든 플레이트된 한천 플레이트를 50°C에서 24시간 배양합니다.
   5. 각 희석에 대해 집단 형성 단위(CFU)를 세어보세요.
      참고: 교정 결과 OD₆₀₀ = 0.5는 약 1 × 10⁸ CFU/mL에 해당합니다. 이 관계를 이용해 방울 캡슐화의 초기 세포 밀도를 결정하세요(보충 그림 3).
2. B. 배양은 중후반 로그 단계까지 응고 한 후, 신선한 씨앗 배양물을 신선한 씨앗 배지에서 OD₆₀₀ = 0.05로 희석합니다.
3. 층류 후드 안에서 8개의 멸균된 소형 금속 디스크와 1개의 큰 금속 디스크를 준비합니다. 8개의 작은 원반을 알코올 버너 위에서 1분간 불을 붙인 후, 멸균된 큰 원반 위에 올려놓고 10분간 식힙니다.
4. 마이크로피펫을 사용해 희석된 박테리아 현탁액 10 μL을 8개의 냉각된 작은 디스크 각각에 균일하게 발랐습니다.
5. 접종된 작은 디스크가 있는 큰 디스크를 멸균 페트리 접시로 옮깁니다.
6. ARTP 계기 전원을 켜고 메인 컨트롤 스크린을 활성화하세요. 돌연변이 유발 챔버 안의 UV 램프를 켜세요. 냉각기를 작동시키고 20분간 예식하여 온도가 20°C로 안정될 때까지 냉각하세요.
7. 돌연변이 유발 챔버 문을 빠르게 열고 작은 원반들을 안에 넣어.
8. 멸균 겸자를 사용해 각 작은 디스크를 순차적으로 ARTP 샘플 스테이지로 옮깁니다.
   참고: RF 출력, 헬륨 가스 유량, 노즐과 샘플 간 거리, 헬륨 순도는 각각 120W, 10 SLM, 2mm, 99.999%로 고정되어 있습니다. 헬륨 조사 시간은 각각 5, 10, 15, 20, 25, 30초로 설정되었습니다.
9. 각 작은 디스크를 설정된 매개변수에 따라 ARTP 돌연변이 유발 물질을 적용합니다. 조사 후에는 모든 디스크를 10mL 회수 배양액이 들어 있는 50 mL 원심분리관에 옮깁니다. 세포 회복과 성장을 위해 50°C에서 200rpm으로 흔들며 4시간 동안 배양하세요.
10. 치명률 결정.
    1. 회수된 배양물을 ^10-2 에서 ^10-6 사이로 연속적으로 희석합니다.
    2. 희석액 100 μL을 종자 배지 한천 플레이트에 바르고, 희석당 3번의 복제를 준비합니다.
    3. 모든 플레이트는 50°C에서 24시간 배양하세요.
    4. 콜로니를 세고 해당 CFU/mL를 계산하세요.
    5. 치명률은 다음 공식으로 계산합니다:
       (1)
       참고: 각 시점마다 실험을 3부로 수행하세요. 이 경우 ARTP의 최적 돌연변이 유발 시간은 20초입니다(보충 그림 4).

3. 자동 액적 마이크로플루이딕 플랫폼 및 소모품의 구성

1. 작동 시스템 (그림 1)
   참고: 0–1000 mbar의 압력 범위와 < 50ms의 압력 응답 시간을 가진 3개의 고정밀 압력 제어기로 구성되어 있습니다(그림 1A).
2. 영상 시스템
   참고: 고속 CMOS 미미경 영상은 ≥ 2 GB/s의 고속 이미지 데이터 획득, 0–20,000 fps의 프레임 속도, 최대 해상도 1280 x 860을 특징으로 합니다. 이 시스템은 방울 이동을 실시간으로 관찰할 수 있는 자동 초점을 갖추고 있으며, BMP, AVI, MP4, TIF 등 다양한 포맷으로 내보낼 수 있는 이미지와 동영상 녹화를 지원합니다.
3. 탐지 시스템
   참고: 2개의 레이저(488 nm와 633 nm, 2개의 검출 채널)로 형광 신호 검출을 가능하게 합니다.
4. 호스트 제어 시스템
   참고: 자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼 소프트웨어로 제어되며, 이 시스템은 유체 작동, 현미경 영상, 여기 및 검출, 액상 생성, 피코 주입, 분류 등 여러 모듈을 통합합니다. 또한 실험 데이터의 수집, 기록, 저장, 표시 및 내보내도 지원합니다. 자동 액상 마이크로유체 플랫폼의 부분 작동 단위가 나타났습니다(그림 1B).
5. 소모품
   참고: 이 프로토콜에서 사용되는 소모품에는 오일 상, 샘플, 시약을 위한 주입관(그림 2A); 액상 인큐베이션용 수집관(그림 2B); 액상 생성 칩(그림 2C); 액상 피코 주입 칩(그림 2D); 그리고 액적 분류 칩(그림 2E)을 사용했습니다.

4. 방울 생성

주의: 자동 액상 마이크로유체 플랫폼을 청소하세요. 각 실험 후에는 무보풀 물티슈로 75% 에탄올로 스테이지, 칩 홀더, 유출 부위를 닦아주세요. 잔여 불소유, 셀 현탁액, 센서 용액을 제거하세요.

1. 단일 셀 캡슐화. 14 pL 방울에서 λ = 0.1을 얻으려면, 박테리아 현탁액을 OD₆₀₀ ≈ 0.04로 희석합니다(OD₆₀₀=0.5는 1 ×^{10 8} CFU/mL에 해당). 포아송 분포에 따르면:
   (2)
   λ = 0.1일 때, 90.5%의 방울이 비어 있고, 9.1%가 단일 세포를, 0.4%가 여러 세포를 포함합니다.
   참고: 이 경우 측정된 단일 셀 캡슐화 효율은 11.2%였습니다(보충 그림 5). 방울당 세포 수는 DAPI 염색으로 확인할 수 있습니다. λ = 0.1이고 다세포 캡슐화율이 1%를 초과할 때, OD₆₀₀를 낮춰 여러 세포를 포함하는 방울 비율을 낮춰야 합니다.
2. 플루오린유 300 μL를 오일 상 입구 바이알에 피펫 주입합니다. 박테리아 현탁액 500 μL를 수용상 입구 바이알에 피펫 투여합니다.
3. 방울 생성 칩 표면을 덮고 있던 테이프를 떼어내세요. 오일 바이알, 샘플 바이알, 수집 바이알을 칩의 해당 우물에 순서대로 연결하세요.
4. 칩을 무대 위에 놓고 고정하세요. 가스 경로 라벨에 따라 공기 튜브를 하나씩 흡입 바이알에 연결하세요.
5. 자동 액상 마이크로유체 플랫폼 소프트웨어를 열어. 칩의 화살표 방향에 따라 스테이지 이동 노브를 조정하여 시야각을 방울 생성 지점으로 이동시킵니다.
6. 자동 액적 마이크로유체 플랫폼 소프트웨어의 "액적 생성" 인터페이스에서 "시작"을 클릭하세요(그림 3A). 영상 인터페이스에서 "Z축"과 광원 밝기 슬라이더를 드래그하면 이미지 선명도와 밝기를 조절할 수 있습니다.
7. "방울 속도"와 "방울 크기"의 "+"와 "-" 버튼을 클릭하여 생성 속도와 방울 크기를 조절할 수 있습니다.
   참고: 이 경우 방울 생성을 위한 오일 상 압력과 시료상 압력은 각각 300 mbar와 400 mbar로 자동으로 설정되어 1500 Hz의 생성 속도를 달성합니다. 이 설정에서는 방울의 부피가 14pL이며, 방울 직경의 CV는 5% 미만으로 유지되어 일관된 방울 크기와 신뢰할 수 있는 하류 작업을 보장합니다.
8. 장비가 안정되고 액자 생성 상태가 일정해질 때까지 1분간 기다리세요. 액상 수집을 시작하려면 수집 바이알을 빠르게 교체하세요.
   참고: 새로운 수집관에 소량의 플루오린유를 미리 첨가하여 테플론 튜브의 하단 포트를 덮어 액적이 튜브 벽에 직접 닿지 않아 융합이 발생하지 않도록 하세요.
9. 운영 후 30분 후 방울 수집을 중단하세요. 팝업 창에서 "Stop"을 클릭하여 비말 생성 중단을 확인하세요.
10. 칩에서 수집관을 조심스럽게 분리하세요. 튜브와 채취 바이알을 수직으로 놓고 튜브 안의 방울이 채취 바이알로 들어오기를 기다립니다.
11. 칩, 오일 상 입구 바이알, 수상 입구 바이알을 스테이지에서 분리하세요. 무대 표면을 75% 알코올로 닦으세요. 그 후 비말 생성 단계가 완료됩니다.

5. 물방울 배양

1. 수집관에 미네랄 오일 1mL를 추가하세요.
   참고: 광유층은 증발을 최소화하고 산소 노출을 줄이면서도 겸성 혐기성 B. coagulans에 충분한 가스 교환을 허용하기 위해 방울 부유액을 덮고 있습니다.
2. 수집관을 멸균수가 담긴 15mL 원심분리관 안에 세워 놓으세요. 채집관은 느슨하게 뚜껑을 닫고 45°C에서 10시간 배양하세요.
   참고: 배양 후에는 방울의 직경 CV가 <10%이고 방울이 응집되지 않도록 하십시오. 이 기준을 충족하지 못하면 배치를 폐기하세요.

6. 액적 피코 주입

주의: 피코 주입 시 기기 연결을 통해 칩 전극에 고전압이 가해집니다. 전기장은 심한 감전을 일으킬 수 있습니다. 고전압이 작동 중일 때는 금속 도구나 맨손으로 전극이나 칩 표면을 만지지 마세요. 칩을 다루기 전에 항상 고전압 출력을 비활성화하세요. 절연 장갑을 착용하고 비전도성 도구를 사용하세요.

1. 오일 단계 입구 바이알을 준비하세요. 층류 후드에서 300 μL의 플루오리네이트 오일을 오일 상 입구 바이알에 주입합니다.
2. 샘플 입구 바이알을 준비하세요. 물방울이 담긴 수집관에서 입구 바이알 캡을 분리하세요. 새 캡으로 교체하세요.
3. 새 흡입구 바이알 끝을 다듬어. 새 입구 바이알 앞부분에서 작은 부분을 잘라내어 팁이 샘플 바이알 내 방울 액체 수준보다 낮게 닿도록 합니다.
4. 뚜껑을 조여. 누수를 막기 위해 캡을 단단히 고정하세요.
5. 시약 입구 바이알을 준비하세요. 젖산 센서 500 μL를 시약 입구 바이알에 피펫 주입합니다.
6. 시약 입구 바이알에 PBS를 추가하세요. 동시에 동일한 시약 입구 바이알에 멸균 PBS 버퍼 500 μL를 추가합니다.
   참고: 이 실험에서는 방울의 pH 균형을 맞추기 위해 PBS 버퍼가 첨가됩니다. 락테이트 센서의 최종 작동 농도는 0.1 mg/mL였고, 락테이트 센서의 부하 부피는 500 μL였습니다.
7. 전극 웰을 덮고 있는 테이프를 칼날로 자르면 전극이 노출됩니다. 멀티미터를 연속성 모드로 설정하고 회로 연결과 칩의 단락 상태를 테스트하세요.
   참고: 멀티미터가 칩 전극의 정상 회로 연결을 보여주면 다음 단계로 진행하세요. 회로가 열려 있다면 인젝션 칩을 교체하고 다시 테스트하세요.
8. 멀티미터와 정상 회로 연결이 확인된 후, 칩 표면의 테이프를 떼어내세요. 오일 바이알, 샘플 바이알, 시약 바이알, 수집 바이알을 칩의 해당 웰에 순서대로 연결하세요.
9. 칩을 무대 위에 놓고 고정하세요. 가스 경로 라벨에 따라 공기 튜브를 하나씩 흡입 바이알에 연결하세요.
10. 자동 액상 마이크로유체 플랫폼 소프트웨어를 열어. 칩의 화살표 방향에 따라 스테이지 이동 노브를 조정하여 시야각을 드롭 칩의 전극 영역으로 이동시킵니다.
11. 자동 드롭렛 마이크로플루이딕 플랫폼 소프트웨어의 "Droplet Pico-injection" 인터페이스에서 "Start"를 클릭하세요(그림 3B). 영상 인터페이스에서 "Z축"과 광원 밝기 슬라이더를 드래그하면 이미지 선명도와 밝기를 조절할 수 있습니다.
    참고: 이 시점에서 기기는 자동으로 오일 상 펌프 압력을 400 mbar, 샘플 상 펌프 압력을 420 mbar, 시약 주입 단계 펌프 압력을 450 mbar로 조정합니다.
12. 수술 초기 단계에서 카테터 내 공기 구간이 칩 안으로 배출되는데, 이는 몇 분간 지속되는 정상적인 현상입니다.
13. 방울이 시야에 들어올 때까지 기다려. "피코 주입 시작"을 클릭하세요. 이 시점에서 장비의 전기장이 활성화됩니다. "방울 속도", "방울 간격", "주입 부피"의 "+"와 "-" 버튼을 클릭하여 방울 생성 속도, 방울 간격, 주입 부피를 조절할 수 있습니다.
    참고: 전기장은 기본 최대 기어로 설정되어 있습니다. 융합 과정에서 방울이 전기장 영역에서 깨지면 중간 또는 저단 기어로 전환하세요. 이 경우 물방울 주입 속도는 200 Hz였습니다.
14. 고속 이미지 디스플레이 소프트웨어에서 관찰하세요. 만약 액자가 1:1 비율로 젖산 센서에 안정적으로 주입될 수 있다면, 장비가 안정될 때까지 5분간 기다리세요. 액상 수집을 시작하려면 수집 바이알을 빠르게 교체하세요.
15. 안정 주사 후 2시간 동안 "중지"를 눌러 피코 주사를 종료하세요.
16. 칩에서 수집관을 조심스럽게 분리하세요. 튜브와 채취 바이알을 수직으로 놓고 튜브 안의 방울이 채취 바이알로 들어오기를 기다립니다.

7. 물방울 분류

주의: 유두제는 자극제이며 피부와 눈 자극을 유발할 수 있습니다. 흡입하거나 삼키면 해롭습니다. 항상 적절한 개인 보호 장비(장갑, 실험복, 안전 고글)를 착용하세요. 탈혈제는 환기가 잘 되는 곳이나 훈풍 후드에서 다루세요. 폐기물 제거제는 별도로 명확하게 표시된 용기에 담아 보관하세요. 싱크대에 부지 마세요.

1. 층류 후드에서 300 μL의 플루오린유를 피펫팅하여 오일 상 입구 바이알에 첨가합니다. 미세 주입 방울이 담긴 채취관의 입구 바이알 캡을 새 캡으로 교체하세요.
   참고: 물방울 분류 실험을 수행하기 전에 5 μL의 물방울을 채취하여 형광 현미경으로 관찰하십시오. 최소 200개의 방울의 직경을 측정하세요; 이력서가 10%< 경우에만 진행하세요.
2. 전극 웰을 덮고 있는 테이프를 칼날로 자르면 전극이 노출됩니다. 멀티미터를 연속성 모드로 설정하고 회로 연결과 칩의 단락 상태를 테스트하세요.
3. 멀티미터와 정상 회로 연결이 확인된 후, 칩 표면의 테이프를 떼어내세요. 오일 바이알, 샘플 바이알, 분류 바이알을 칩의 해당 우물에 순서대로 연결하세요.
4. 칩을 무대 위에 놓고 고정하세요. 가스 경로 라벨에 따라 공기 튜브를 하나씩 흡입 바이알에 연결하세요.
5. 고속 영상 소프트웨어를 열어. 칩의 화살표 방향에 따라 스테이지 이동 노브를 조정하여 시야각을 드롭 칩의 전극 영역으로 이동시킵니다.
6. 자동화된 액상 마이크로유체 플랫폼 소프트웨어의 "액적 분류" 인터페이스에서 "시작"을 클릭하세요. 영상 인터페이스에서 "Z축"과 광원 밝기 슬라이더를 드래그하면 이미지 선명도와 밝기를 조절할 수 있습니다.
   참고: "시작"을 클릭하면 계측기가 오일 펌프 압력을 300 mbar로, 샘플 펌프 압력을 190 mbar로 조정하여 방울 처리량을 100 Hz로 만듭니다.
7. 수술 초기 단계에서 카테터 내 공기 구간이 칩 안으로 배출되며, 이는 몇 분간 지속되는 정상적인 현상입니다.
8. "레이저"를 선택하고 488nm 검출 채널을 선택하세요.
   참고: 실험 인력은 실험 검출 설계에 따라 488 nm 레이저, 633 nm 레이저 또는 두 레이저 조합을 선택할 수 있습니다. 레이저 출력: 20 mW.
9. "데이터 기록"을 클릭하세요. 기기는 방울 형광 신호를 획득하기 시작합니다(그림 3C).
   참고: 50,000에서 100,000 방울까지의 형광 신호를 수집하세요; 기기는 신호 값을 자동으로 정렬하고 형광 신호 히스토그램을 생성합니다.
10. 생성된 형광 신호 히스토그램을 바탕으로 전체 형광 신호의 상위 0.1%로 정렬 임계값을 설정하고, 이 임계값보다 높은 형광 신호 값을 가진 방울을 수집합니다.
    참고: 이 경우 분류 게이트는 형광 >강도 2750(a.u.)인 방울을 수집하도록 설정되었으며, 이는 방울의 상위 0.1%에 해당합니다.
11. 다시 "데이터 기록"을 클릭하세요. 기기는 남은 방울에서 나오는 형광 신호를 재기록하고, 7.10절에서 설정된 임계값을 기준으로 목표 방울을 분류합니다.
    참고: 나머지 방울 신호도 자동으로 정렬되어 형광 히스토그램으로 플롯됩니다.
12. 목표 물방울 영역을 선택한 후 "정렬 스위치"를 켜고 "편향력" 값을 설정하세요. 장비가 방울을 분류하기 시작할 거야.
    참고: 이 기기는 세 가지 선택 가능한 전기장 강도 수준(높음, 중간, 약함)을 제공합니다. 30 μm 이상의 물방울의 경우, High를 선택하세요; 25 μm 미만의 물방울은 중간 또는 낮은 값을 선택하세요. 이로 인해 안정적인 편향과 최적의 정렬 효율이 보장됩니다.
13. 장비가 5분간 안정된 후에는 양성 방울을 채취하기 위해 채취 바이알을 교체하세요.
    참고: 분류 과정에서 기기는 각 방울의 형광 강도를 실시간으로 지속적으로 측정하고 미리 설정된 임계값과 비교합니다. 임계값보다 형광 강도가 높은 방울만 편향되어 양성 수집관으로 수집됩니다. 기기가 분류 임계값을 초과하는 형광 신호를 표시하고, 동시에 영상 인터페이스에서 방울이 편향되어 양성 수집 채널로 성공적으로 유도되었음을 확인하는 방울은 양성으로 간주됩니다.
14. 4시간 동안 안정적으로 작동하면 방울 분류를 중단하세요. "Droplet Sorting" 인터페이스에서 "Stop"을 클릭하세요.
15. 칩에서 수집관을 조심스럽게 분리하세요. 튜브와 채취 바이알을 수직으로 놓아 튜브 안의 비울이 채취 바이알로 들어오도록 하세요.
16. 방울 수집이 완료된 후에는 산란도를 클릭하면 실험의 산란도, 정렬된 양성 방울의 형광 신호 값, 그리고 모든 방울의 형광 신호 값을 저장합니다.
17. 칩, 오일 상 입구 바이알, 샘플 바이알, 시약 바이알을 스테이지에서 분리하세요. 소프트웨어를 종료하세요.
18. 액滴 탈유화. 1H, 1H, 2H, 2H-퍼플루오록타놀 500 μL을 액상 수집관에 추가합니다. 5분간 기다린 후 500 μL 신선한 스크리닝 배지를 추가하여 회복을 돕습니다.
    참고: 분리제를 넣은 후 수집관을 세게 흔들지 마세요; 조심스럽게 섞어. 액상 탈유화 후에는 수용상과 오일상 사이에 명확한 경계면이 형성됩니다.
19. 20 μL 탈퇴 박테리아 현탁액을 10배로 희석한 후 두 개의 한천 플레이트에 펴 뿌리세요. 50°C에서 2일간 배양하세요.
    참고: 희석 계수는 수집된 방울 수에 따라 조정될 수 있습니다. 이 경우 두 판에서 약 400개의 단일 군락이 얻어졌습니다.

8. 데이터 내보내기

1. 소프트웨어 정렬 인터페이스의 빈칸에 있는 형광 신호 그래프를 클릭하세요. 전체 방울 수의 기록된 형광 강도 값과 선별된 양성 액울의 형광 강도 값이 포함된 형광 신호 산란도, 형광 신호 히스토그램, 형광 신호 Excel 스프레드시트를 저장하도록 선택하십시오.

9. 마이크로플레이트 1차 선별

1. 단일 식민지는 무작위로 선택하세요.
2. 24웰 딥웰 플레이트에 확장 배양을 위해 접종하세요. 각 선택된 콜로니를 골라서 2mL의 발효 배지를 담은 24웰 딥웰 플레이트의 한 웰에 접종합니다. 접종 루프를 사용하세요.
3. 24웰 딥웰 플레이트를 비통기성 멤브레인으로 밀봉하세요.
   참고: 통기성 멤브레인은 사용하지 마세요. 배양 배지의 증발을 유발합니다.
4. 확장 문화를 키우세요. 밀봉된 24웰 딥웰 플레이트를 50°C, 200rpm에서 24시간 동안 진동하는 인큐베이터에 넣습니다.
5. 발효 검증을 위한 하위문화. 24시간 후, 각 웰에서 200 μL의 배양물을 1.8mL의 발효 배지(10% v/v 접종량)가 담긴 신선한 24웰 딥웰 플레이트에 옮깁니다. 접종 전 각 단계에 최종 농도인 4%(w/v)의 멸균_CaCO3 를 첨가하여 pH를 완충합니다.
6. 컨트롤을 포함하세요. 각 신선한 24웰 딥웰 플레이트에서, 부모 균주 ATCC 7050을 음성 대조군으로 무작위로 선정한 세 개의 웰을 채웁니다. 후보 균주와 동일하게 가공하세요.
7. 24웰 딥웰 플레이트를 비통기성 멤브레인으로 밀봉하세요.
8. 24웰 딥웰 플레이트를 인큐베이팅하세요. 밀봉된 플레이트를 50°C, 200rpm에서 24시간 동안 흔들기 인큐베이터에 넣습니다.
9. 젖산 검출 샘플을 준비하세요. 플레이트를 5,842 × g 에서 10분간 원심분리합니다. 상원액 10 μL을 96웰 검은색 마이크로플레이트에 옮기고, 990 μL 초순수수로 희석합니다. 잘 섞으세요.
10. 락테이트 센서를 추가하세요. 희석된 샘플을 신선한 96웰 블랙플레이트의 각 웰에 100 μL을 첨가합니다. 그 다음 젖산 센서 100 μL을 추가합니다. 부드럽게 섞으세요.
11. 형광을 측정하세요. 플레이트를 실온에서 5분간 (빛을 차단한 상태) 부양하세요. 마이크로플레이트 리더를 사용해 485nm 여기, 515nm 방출을 측정합니다.
12. 히트 선택 임계값을 설정하세요. 세 개의 부모 대조군 웰(부모)과 표준편차(SD_parent)의 평균 형광을 계산합니다. 임계값을 F_parent + 3 × SD_parent로 정의합니다.
13. 주요 타격 위치를 파악하세요. 후보 균주는 형광 신호가 임계값을 초과하면 1차 타격으로 간주됩니다. 하위 검증을 위해 주요 히트 수를 기록하세요.

10. 고수확 품종의 2차 검증

주의: 이동상에는 부식성이 있는 희석 황산(5 mM)이 포함되어 있습니다. 피부 접촉과 흡입은 피하세요. 적절한 개인 보호 장비(장갑, 실험복, 안전 고글)를 착용하세요. 이동 위상은 환기가 잘 되는 곳이나 훈막 후드에서 준비하고 다루세요. 산성 함유 폐기물은 전용 산성 폐기물 용기에 모아 적절히 처리하세요. 싱크대에 부지 마세요.

1. 씨앗 배양을 준비하세요. 1차 타격 줄무늬가 씨앗 매체 한천 플레이트에 닿습니다. 50°C에서 24시간 배양하세요. 각 플레이트에서 하나의 군락을 골라 250mL 쉐이크 플라스크에 30mL의 액체 씨앗 배지를 접종합니다. 50°C, 200rpm에서 12시간 동안 인큐베이팅하세요.
2. 발효 준비를 하세요. 발효 배지를 준비하고 최종 농도인 4%(w/v)의 멸균 CaCO3 분말을 pH 중화제로 첨가합니다. 씨앗 배양 5mL를 250mL 에를렌마이어 플라스크(10% v/v 접종량; 최종 작업 용량 50 mL)에 이 배지 45mL에 옮깁니다.
   참고: 각 후보 균주와 부모 균주인 ATCC 7050은 대조군으로 각각 세 개의 독립 플라스크를 사용하세요.
3. 플라스크를 부화시키세요. 플라스크를 50°C, 200rpm의 흔들리는 인큐베이터에 넣으세요. 24시간 동안 발효하세요.
4. 샘플을 채취하세요. 24시간 후에는 각 플라스크에서 1mL의 배양액을 채취하세요. 원심분리기 13,800 g × 2분간 사용. 상원액을 초순수수로 100배 희석한 후 0.22 μm 주사기 필터로 여과합니다.
5. HPLC 조건을 설정하세요. Aminex HPX-87H 컬럼을 사용하세요. 이동상: 5 mM H₂SO₄를 초순수수에 준비하고, 0.22 μm 막을 통해 여과한 후 초음파 제거로 탈기합니다. 컬럼 온도를 40 °C, 유속 0.6 mL/min, 주입 부피를 20 μL, 시료당 20분으로 설정하세요(젖산은 ~12,600분 동안 용출됩니다). 굴절률 검출기(RID)를 사용하세요.
6. 표준 곡선을 준비하세요. 칼슘 L-락테이트를 초순수수에 녹여 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6 g/L(칼슘 L-락테이트로 표현됨)의 표준 용액을 만듭니다. 각 표준체를 3배로 주입하세요.
   참고: 피크 면적을 농도에 대해 그래프로 그리고 선형 회귀 방정식(R² > 0.999)을 얻으세요. 각 샘플 배치의 시작과 끝에 표준 검사를 사용하여 드리프트를 보정하세요.
7. 샘플을 주입하세요. 여과된 발효 상청액(20 μL)을 HPLC 시스템에 주입합니다. 칼슘 L-락테이트 피크의 피크 면적을 기록하세요.
   참고: 시스템 안정성을 모니터링하기 위해 10시료마다 품질 관리 샘플(1 g/L 칼슘 L-락테이트)을 주입하세요. 허용 가능한 보존 시간 이동은 초기 보정 표준에 비해 <0.2분이며, 최대 면적 변동은 <5%입니다.
8. L-젖산 수율을 계산하세요. 각 샘플의 피크 면적을 표준 곡선에 보간하여 칼슘 L-락테이트 농도(g/L)를 얻습니다.
   참고: 분자량 비율을 사용하여 L-락틱산 농도로 변환하세요:
   (3)
   개선 비율 계산:
   (4)
9. 최종 고수확 품종을 식별하세요. 검증된 돌연변이체로 부모 균주보다 일관되게 L-젖산 수량이 높은 균주를 선택하세요. 더 나은 캐릭터 묘사를 위해 최고의 연기를 선택하세요.

11. 고수확 계통의 유전적 안정성 평가

1. 선택한 돌연변이 균주를 종자 중간 한천 판에 줄무늬 처리합니다. 50°C에서 24시간 배양하세요. 이건 1세대입니다.
2. 1세대 플레이트에서 단일 군락을 골라 50mL 튜브에 5mL의 액체 씨앗 배지를 접종하세요. 50 °C, 200 rpm에서 12시간 배양하여 F1 씨앗 배양을 얻으세요.
3. 1세대 씨앗 배양액의 10%(v/v)를 250mL 셰이크플라스크 내 발효 배지(4% w/v 멸균 CaCO₃ 포함)에 옮깁니다. 50°C, 200rpm에서 24시간 배양하세요.
4. 발효 후 1mL의 배양물을 수집하세요. 13,800 × g에서 2 분간 원 심분리하고, 상청액을 초순수수로 100배 희석한 후 HPLC로 L-젖산 농도를 측정합니다. 각 세대마다 독립 플라스크 세 개를 사용하세요.
5. 다음 세대를 얻으려면, 1세대 배양균을 신선한 종자 배지에 한 줄로 스트레이크하세요. 50°C에서 24시간 배양하세요. 2세대에서는 11.2, 11.3단계를 반복합니다.
6. 서브컬처링 과정을 반복하여 3세대와 4세대를 얻습니다. 각 세대마다 세 개의 쉐이크 플라스크를 준비하고 HPLC로 젖산 생산량을 측정하세요.
7. 네 세대(1–4세대)의 수확량을 일원 ANOVA 또는 학생 t-검정을 사용해 비교합니다. 세대 간에 유의미한 유의미한 차이(p > 0.05)가 관찰되지 않으면 유전적으로 안정된 균주로 간주됩니다.

결과

자동화된 액적 마이크로유체 플랫폼을 기반으로 고처리량 스크리닝 모델이 구축되었습니다. ARTP 돌연변이 유발으로 B . coagulans 돌연변이 라이브러리가 구축되었으며, 최적의 조사 시간은 20초로, 치명률은 약 90%에 달했다(그림 4A). 돌연변이 세포들은 직경 약 30 μm, 14 pL 방울로 캡슐화되어 생성 속도 1500 Hz로 이루어졌습니다(그림 4B). 45°C에서 10시간 동안 인큐베이팅한 후, 센서는 각 방울에 200Hz 속도로 피코 주입되었습니다(그림 4C). 형광 활성화 액적 분류는 488 nm 레이저를 사용하여 100 Hz에서 수행되었습니다(그림 4D). 분리된 양성 비말은 탈퇴되었고, 단일 군집을 선택해 검증을 진행했습니다. 수확된 군락은 처음에 24개의 웰 딥웰 플레이트에서 50°C, 200rpm의 발효 매체를 24시간 동안 배양했습니다. 각 웰의 형광은 각각 485nm와 515nm의 여기 및 515 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더로 측정되었습니다. 부모 균주 평균보다 더 높은 형광을 보이는 클론과 3개의 표준편차를 추가한 클론을 선정하였다. 이 후보들은 10% 접종액이 포함된 250mL 쉐이크 플라스크에 옮겨져 같은 조건에서 24시간 더 발효시켰습니다. L-젖산 농도는 최종적으로 고성능 액체 크로마토그래피(그림 4E)로 결정되었습니다.

고L-젖산 생성 균주를 스크리닝하기 위해 젖산 센서 사용 가능성을 검증하기 위해 먼저 센서가 특성화되었습니다. 마이크로플레이트 내 검출 가능성을 검증하기 위해 L-락틱산 표준 성분(1, 10, 100, 1000, 10000, 10000 μM)을 마이크로타이터 플레이트에 추가하고, 각 웰에 100 μL의 젖산 센서 혼합물을 첨가했습니다. 결과는 젖산 농도가 100 μM에서 10 mM으로 증가할수록 형광 강도가 증가함을 보여주었다. 센서는 L-락틱산 모두에 대해 강한 형광 반응을 보였습니다(그림 5A). 그럼에도 불구하고 두 가지 이유로 본 연구에 완전히 적합하다. 첫째, B. coagulans ATCC 7050은 L-LDH 우위 대사 프로필로 확인된 D-락틱산 생성이 거의 없는 잘 특성화된 L-젖산 생성체입니다. 둘째, 실제 발효 샘플에서 L-락산의 정량 정확도를 HPLC와 비교하여 검증되었습니다(그림 5B). 따라서 시험관 내 D-락산과의 교차 반응에도 불구하고, 센서는 스크리닝 워크플로우에서 L-락틱산 수치를 신뢰성 있게 보고합니다. 젖산 센서를 이용한 정량적 젖산 검출의 타당성을 검증하기 위해, 수용액과 스크리닝 배지 모두에서 센서의 회수 속도를 측정하였습니다. 결과는 스크리닝 배양에서 각각 108.81%, 수용에서 98.39%의 높은 회복률을 보였으며, 상대 표준편차는 5%< 나타났습니다(그림 5C). 매질 내 약간의 고도는 허용 가능한 90–110% 범위 내에 있으며, 유의미한 매트릭스 간섭이 없음을 나타냅니다. 마이크로플레이트 분석에서는 센서를 L-젖산 표준 물질과 1:1로 혼합하여 5분간 배양하였고, 0–0.6 g/L 범위에서 우수한 선형성을 보였습니다(그림 5D). 또한 형광 방법을 통해 5분 만에 96개의 샘플을 검출할 수 있었으며, 이는 HPLC에 비해 총 검출 시간을 384배 단축한 결과를 의미합니다. 낙산 센서의 액상 스크리닝 가능성을 더욱 검증하기 위해, 다양한 농도의 L-젖산을 포함한 액적을 제작하고, 같은 부피의 젖산 센서를 각 액적에 피코 주입했습니다. 액상의 형광 강도는 자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼을 사용하여 검출되었습니다. 결과는 L-락산(L-lactic acid) 농도가 증가함에 따라 형광 신호가 유의미하게 우측으로 이동하는 것을 보여주었습니다(그림 5E). 저장을 위해 락테이트 센서에 5% 글리세롤을 보충하고 -80 °C에서 보관하여 최소 한 달간 검출 안정성을 유지했습니다(보충 그림 6).

FADS 기술을 이용한 적절한 배종용 센서 선택뿐만 아니라, 물방울 내 균주의 최적 배양 기간을 결정하는 것도 매우 중요합니다. 배양 시간이 부족하면 L-젖산 분비가 부족해 형광 신호가 낮아 고수율과 저수율 균주를 구분하지 못할 수 있습니다. 반대로, 과도하게 긴 배양 시간은 L-젖산 과도한 축적을 초래하여 젖산 센서의 검출 범위를 초과할 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 비말 내 균주의 배양 기간을 동적으로 모니터링하여 최적화했습니다. 균주는 6시간 후 방울에서 로그 성장 단계에 진입했으며, 10시간 후에는 방울 내 박테리아 생체량이 유의미하게 증가했습니다(그림 6A). 반면, 배양 시간이 12시간을 초과할 때는 비말이 뚜렷하게 수축하는 모습을 보였다. 이 현상은 변형 성장 후기 단계에서 방울의 삼투압 변화로 인해 방울이 수축하는 데 기인합니다. 이러한 수축은 이후 실험에서 다양한 비방울들 간의 피코 주입 부피가 일관되지 않게 만들 수 있습니다. 최적의 배양 시간을 결정하기 위해, 같은 부피의 젖산 센서를 다양한 시간 동안 배양한 방울에 주입했습니다. 배양 10시간 후 방울의 형광 신호가 유의미하게 증강된 것으로 나타났으며; 따라서 10시간을 방울 균주에 대한 최적 배양 기간으로 선택했습니다(그림 6B).

단일 스크리닝 라운드에서 액적은 100Hz 속도로 분류 칩을 사용해 4시간 동안 분류되었고, 형광 강도가 가장 높은 상위 0.1%의 방울이 수집되었습니다(그림 6C). 양성 방울은 멸균 수집관에 수집되어 500 μL 분리제와 500 μL 신선 씨앗 배지로 처리되었습니다. 5분간 부드럽게 흔든 후, 상부 수용상 20 μL을 10배 희석하여 두 개의 고체 한천 판에 발랐습니다. 50°C에서 2일간 배양한 후, 200개의 단일 군락을 무작위로 채취하여 24웰 딥웰 플레이트에 접종하여 확장 배양을 진행했습니다. 200개의 배양된 클론 중 78개의 돌연변이 균주가 부모 균주보다 더 높은 L-락산을 보였습니다(보충 그림 7). 이 78개의 돌연변이체는 셰이크플라스크 검증을 거쳐, 부모 균주보다 수율이 향상된 17개 균주가 최종적으로 발견되었습니다. 그중 돌연변이 ADC-17이 가장 큰 증가를 보였으며, 57.2 g/L에서 67.04 g/L로 17.2% 개선되었습니다(그림 6D). ADC-17의 유전적 안정성은 4세대 연속으로 평가되었습니다. 네 세대 간에 유의미한 차이가 관찰되지 않았으며(p > 0.05), 이는 ADC-17의 고수율 형질이 네 차례 연속된 아위배양에서도 안정적으로 유지되었음을 나타낸다(그림 6E). 이 결과는 FADS 플랫폼의 효율성과 신뢰성을 입증하는데, FADS 플랫폼은 젖산 센서를 이용해 무작위 돌연변이 라이브러리에서 고수율 균주를 단일 스크리닝 라운드로 농축합니다.

그림 1: 자동 액적 마이크로플루이딕 플랫폼의 구성. (A) 플랫폼 내부 구조. 이 모듈은 압력 구동 유체 제어, 고속 CMOS 이미징, 488 nm/633 nm 이중 레이저 형광 검출, 그리고 물적 조작 및 데이터 출력을 위한 호스트 제어 시스템 네 개의 핵심 모듈로 구성되어 있습니다. (B)자동 액적 마이크로유체 플랫폼 작동 플랫폼 . 라벨링된 부품에는 a. 배치 플랫폼, b. 고속 카메라, c. 칩 전극, d. 칩 고정 클램프, e. 칩 배치 홈, f. 금속 배조, g. 에어 펌프 1: 오일 위상을 제어합니다. 에어 펌프 2: 샘플을 제어합니다. 에어 펌프 3: 시약 주입을 제어합니다. 그림 1A는 Biorender를 사용하여 제작되었으며, 저작권 라이선스가 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 실험용 소모품. (A) 주입관: 오일 상, 샘플 박테리아 현탁액, 시약 용액을 주입하는 용도. (B) 수집관: 비말을 수집하고 이후 배양하는 용도. (C) 액滴 준비 칩: 14 pL 액자를 생성합니다. (D) 액상 미세주입 칩: 시약을 액자에 미세주입합니다. (E) 액상 분류 칩: 전극을 통해 양의 변형을 분류합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 자동 액적 마이크로유체 플랫폼의 주요 소프트웨어 인터페이스. (A) 액자 생성 소프트웨어 인터페이스 소개. A. 시작: 방울 생성을 시작하려면 클릭하세요. B. 속도: 방울 생성 속도를 조정합니다. C. 크기: 방울 양을 조절하세요. D. 정지: 비말 생성을 멈추려면 클릭하세요. (B) 액상 피코 주입 인터페이스. E. 주입 부피: 시약 주입 부피를 조정합니다. F. 융합력: 세 가지 전압 레벨(높음/중간/저음). (C) 액적 분류 인터페이스 소개. G. 레이저. 레이저 종류를 선택하세요(488nm 또는 633nm). H. 데이터 기록. I. 편향력: 세 가지 전압 레벨(높음/중간/낮음). J. 분류 스위치: 드롭렛 분류를 시작하려면 클릭하세요. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 자동화된 액적 마이크로유체 플랫폼을 기반으로 한 고처리량 스크리닝 워크플로우. (A) ARTP 돌연변이 유발을 통한 돌연변이 라이브러리 구축. (B) 방울 생성 및 부화. 단일 세포는 피콜리터 방울로 구획화되어 있습니다. (C). 액상 피코 주사. 각 방울에는 형광 센서가 피코 주입됩니다. (D) 물방울 분류. 형광이 높은 방울(L-락틱산 생성이 높음을 나타내며)은 FADS에 의해 농축됩니다. (E) 마이크로플레이트 및 쉐이크 플라스크에서의 양성 클론 검증. 약어; FADS = 형광 활성화 액적 분류. 그림 4는 Biorender를 사용해 제작되었으며, 저작권 라이선스가 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 시험관 내 젖산 센서의 특성 분석. (A) 젖산 센서의 L-락틱산에 대한 반응 범위. 여기/방출 = 485/515 nm. 세 개의 독립 실험(n = 3, 각각 3중 기술적 복제 포함)에서 평균 ± SD. (B) HPLC와의 상관관계. 여섯 개의 발효 샘플(서로 다른 시점)을 각각 락테이트 센서와 HPLC에 의해 한 번씩 분석되었습니다. 선형 회귀 결과 R² = 0.9927이 되었다. 여기/방출 = 485/515 nm. (C) 젖산 회수 실험. L-락산은 초순수수와 선별액에 0.5 g/L로 첨가되었습니다. 데이터는 표준± 평균 기준(n = 3개의 독립 실험)입니다. 회복률은 98.39%(수분)와 108.81%(검진지)였으며, 성병 < 5%였습니다. 여기/방출 = 485/515 nm. (민주당) 탐지 시간 최적화. 센서는 L-젖산 표준액(0–0.6 g/L)과 혼합되어 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30분간 배양되었습니다. 가장 높은 R² = 0.990은 5분간 혼합한 후 얻어졌습니다. 데이터는 세 개의 독립적인 실험(n = 3)에서 나온 것입니다. 여기/방출 = 485/515 nm. (E) 방울 형광 히스토그램. L-젖산 농도당 최소 2000개의 방울이 분석되었습니다. 검출 채널: 488 nm, DC (V) = 액적의 형광 강도를 나타내는 전압 신호. 약어; STD = 표준편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: L-젖산 생산이 높은 B.coagulans 의 고처리량 스크리닝. (A) 0, 2, 4, 6, 8, 10시간에서 물약 내 변형 형태가 관찰되었다. 스케일 바: 20 μm. 노출 시간: 100 ms. (B) B . 응고균을 포함한 방울의 형광 강도 변화, 그리고 젖산 센서 주입 시 다양한 기간 동안 인큐베이션. 이미지는 노출 시간 2000ms, 1500% 게인으로 촬영되었습니다. 스케일 바: 50 μm. (C) 방울의 형광 강도 분포. 선별 임계값: FL 강도 > 2750(a.u.). 검출 채널: 488 nm (D) L-락산은 부모 균주(ATCC 7050)와 대표적인 양성 돌연변이체의 g/L을 생성합니다. 데이터는 SD ± 평균 기준입니다(균주당 n = 3개의 독립적인 쉐이크 플라스크). 부모 균주와 비교해 p < 0.0001. 가장 우수한 돌연변이인 ADC-17은 17.2% 증가를 보였습니다. (E) 상위 성능의 B. coagulans ADC-17의 4세대 연속 유전적 안정성(1–4). L-젖산 수율은 24시간 쉐이크 플라스크 발효 후 HPLC로 결정되었습니다. 데이터는 SD ± 평균(n = 세대당 3개의 플라스크)입니다. 일방향 ANOVA는 세대 간 유의한 차이를 보여주지 않았다(p > 0.05, ns). 약어; HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피; SD = 표준편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 1: 락테이트 센서 eLACCO1.1의 정제. 단백질은 500 mM 이미다졸로 용출되어 -80 °C에서 5% 글리세롤과 함께 보관되었습니다. 작동 농도는 0.1 mg/mL이며, 검출 한계는 2 mg/L입니다. 보조 그림 1은 저자들이 Microsoft PowerPoint의 기본 도형, 선, 텍스트 박스 포함 기본 그리기 도구만을 사용하여 전적으로 재현하였습니다. 서드파티 아이콘, 템플릿, 외부 이미지 소스는 사용하지 않았습니다. 모든 요소는 저자들의 오리지널 창작물입니다. 따라서 이 수치는 추가적인 출판 허가가 필요하지 않습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: B. coagulans ATCC 7050의 성장 곡선. 균주는 50°C의 씨앗 배지에서 200rpm 속도로 흔들며 배양되었습니다. 데이터는 평균 ± 표준균(n = 3개의 독립 배양)으로 제시됩니다. 배양은 약 12시간에 후기 로그 단계에 도달했으며, 이 시점은 이후 실험에서 접종 물질 준비에 사용되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 3: B. coagulans ATCC 7050의 OD₆₀₀ 보정 곡선과 생존 가능한 세포 농도의 비교. 중간 로그 단계 배양의 연속 희석을 준비하고 OD₆₀₀을 측정하였다. 적절한 희석액 100 μL를 종자 배지 한천 플레이트에 발라하고 50 °C에서 24시간 배양하여 해당 군락 형성 단위(CFU/mL)를 결정하였다. 데이터는 평균 ± SD(n = 3개의 독립 실험)로 제시됩니다. 이 곡선에 따르면 OD₆₀₀ = 0.5는 약 1 × 10⁸ CFU/mL에 해당합니다. 이 보정은 방울 캡슐화를 위한 초기 세포 밀도를 결정하는 데 사용되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 4: ARTP 돌연변이 유발 하에서 B. coagulans ATCC 7050의 치명도 곡선. 세포들은 헬륨 혈장에 5, 10, 15, 20, 25, 30초 동안 노출되었습니다. 조사 후 세포는 종자 배지 한천에 플레이트되었고, 50°C에서 24시간 배양 후 CFU를 계수했습니다. 치명률(%)은 식(2)에 따라 계산되었습니다. 데이터는 평균 ± SD(n = 3개의 독립 복제)로 제시됩니다. 화살표는 선택된 돌연변이 유발 시간(20초)을 나타내며, 치명률은 약 90%입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 5: DAPI 염색을 통한 단일 세포 캡슐화 효율 측정. B. 응고균 ATCC 7050 세포는 DAPI로 염색되어 λ = 0.1의 방울로 캡슐화되었습니다. 총 2000개의 비말이 형광 현미경으로 조사되었고, 0, 1, 또는 ≥2 세포를 포함한 비말의 수가 집계되었다. 관찰된 단일 셀 캡슐화 효율은 11.2%로, 이론적 포아송 기대치(λ = 0.1 시 9.0%)보다 약간 높다. 이 편차는 활성 세포 분산, 손상된 세포의 비특이적 DAPI 염색, 그리고 방울 형성 중 전단에 의한 소 응집체의 전단 유발 붕괴 등의 요인에 기인합니다. 스케일 바: 30 μm. 최소 2000개의 미세 비말이 분석되었습니다. 이미지는 노출 시간 2000ms, 1500% 게인으로 촬영되었습니다. 약어; DAPI = 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 6: 센서 저장 안정성.  -80°C에서 5% 글리세롤과 함께 저장된 센서의 형광 반응을 4주간 보여줍니다. 신호 손실이 유의미하게 관찰되지 않아 저장 안정성이 우수함을 확인했습니다(p > 0.05). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 7: 78개 균주에 대한 1차 선별 결과, 심부 웰 플레이트에서 대조군보다 더 높은 젖산 생산 이 나타났습니다. 이 1차 선별검사에서 모체 균주보다 높은 L-락산을 가진 돌연변이 균주가 총 78종 확인되었습니다. 모든 돌연변이 균주 데이터는 생물학적 복제가 없는 단일 점 선별 결과를 나타냅니다. 모균주(대조군)는 참조용으로 24개의 심부 웰 플레이트에 무작위로 분포되었으며, 데이터는 세 개의 독립적인 24개 심부 플레이트 복제 간의 평균 ± 표준편차(n = 3)로 제시되었습니다. y축은 x축에 각 균주별 L-젖산 수율(g/L)을 표시하며; 오류 바는 부모 스트레인 컨트롤에만 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

이 프로토콜은 자동화된 액적 마이크로유체 플랫폼을 기반으로 한 산업용 미생물 스크리닝을 위한 표준화된 워크플로우를 제공합니다. 통합 워크플로우는 돌연변이 라이브러리 구축, 방울 생성 및 단세포 캡슐화, 마이크로 반응기 배양, 바이오센서 주입, 형광 활성화 방울 분류, 그리고 표적 균주의 최종 검증을 포함합니다. 고수율 L-젖산을 생성하는 B. coagulans의 고처리량 스크리닝을 검증 사례로 사용하여, 이 워크플로우는 B. coagulans 균주 개선 측면에서 기존 마이크로플레이트 및 아가플레이트 방법에 비해 여러 가지 장점을 입증했습니다. 스크리닝 처리량과 효율성 측면에서 이 플랫폼은 마이크로플루이딕 칩을 활용해 수천에서 수만 개의 방울을 병렬로 생성하고 처리하며, 전통적인 마이크로플레이트^{기반 방식에} 비해 단일 라운드 스크리닝 처리량을 약 10/⁴배 증가시킵니다. B. 코아굴란의 경우, 4시간 내에 10개의⁶개의 방울을 스크리닝하여 균주 발달 주기를 몇 주에서 며칠로 단축하고 번식 과정을 크게 가속화합니다. FADS 시스템의 스크리닝 효율은 플레이트 기반 스크리닝 시스템의 약 3×^{10 3}배이며, 인프라, 인건 및 소모품 비용을 크게 절감^합니다. 하지만 다양한 미생물의 고유한 특성 때문에 이 표준 워크플로우의 목표 최적화가 필요합니다. 예를 들어, 효모 배양 36시간 후 삼투압 변화로 인해 방울 부피가 감소하므로, 주입 및^{분류 작업의} 안정성을 보장하기 위해 배양 시간을 조정해야 합니다. 섬유성 곰팡이의 경우, 균사체 성장으로 인해 방울의 경계면이 끊어지거나 융합되는 것을 방지하기 위해 방울 부피를 늘려야 합니다^15,16.

또한, 피콜리터 규모 방울의 초소형 부피로 인해 각 표적 제품에 맞춤형 형광 바이오센서를 개발하는 것이 필수적입니다. 프로테아제와 소분자 대사산물에 대한 고전적인 형광 검출 시약들이 이미 상업적으로 사용 가능하며, 예를 들어 과산화수소¹⁷, 글리코시다아제¹⁸, 에탄올¹⁹, 포도당²⁰용 제품이 있습니다. 그럼에도 불구하고, 화학적으로 합성된 형광 탐침은 종류가 제한적이며, 점액에서 인접한 빈 물방울로 새어나가는 경향이 있어 배경 형광이 증가하는 경향이 있습니다. 이는 주로 소수성 형광 분자가 석유-^{물 계면}을 쉽게 침투할 수 있기 때문입니다.

최근 몇 년간 바이오센서는 주로 유전자 인코딩 바이오센서와 전사 인자(TF) 기반 바이오센서 두 가지 유형으로 구성됩니다. 유전적으로 암호화된 형광 바이오센서는 세포 내에서 발현될 수 있는 키메라 단백질을 말하며, 생체 내 신호 전달을 모니터링하는 센서로 설계됩니다. 우수한 안정성, 빠른 형광 반응, 높은 특이성 덕분에, 유전적으로 암호화된 형광 바이오센서는 여러 시나리오에 적용되어 왔습니다²². 한 팀은 마이크로플루이딕 액적 분류 시스템 내에서 강도 기반 글루타메이트 감지 형광 리포터(iGluSnFR)를 사용하여 글루타미나제 생성이 향상된 바실루스 아밀로리케파시엔스 돌연변이를 선별하는 고처리량 워크플로우를 구축했습니다. 이 바이오센서 기반 플랫폼은 56배의 농축 비율을 가능하게 했고, 10개의⁵인원 전체 유전체 돌연변이 라이브러리에서 글루타미나제 생산이 47% 이상 증가한 변이를 분리했습니다²³.

전사 인자(TF) 기반 전사 생물센서는 전사 인자를 중심으로 구성된 중요한 전세포 생물센서 클래스입니다. 전사 인자는 특정 DNA 서열에 결합하여 유전자 발현을 조절하는 단백질 군입니다¹⁴. 일부 전사 인자는 대사산물이나 외래 화합물에 결합할 때 활성화됩니다; 이들을 알로스테릭 전사 인자(aTFs)라고 부릅니다. 활성화된 aTFs는 구조 변화를 겪으며, 이는 다시 표적 유전자 상류의 DNA 서열에서 해리되거나 결합하여 해당 유전자의 발현을 활성화하거나 억제합니다. 전사 인자는 합성생물학에서 흔히 사용되는 다른 DNA 요소들(프로모터, 리보솜 결합 부위, 종단자, 리포터 유전자 등)과 결합하여 TF 기반 바이오센서 유전 회로를 구성할 수 있습니다. 이 유전 요소들은 세포나 환경 내 다양한 리간드의 농도를 감지하고 이에 따라 반응할 수^{있습니다.} 에리스리톨 검출은 전사 인자 기반 바이오센서와 FADS 플랫폼과 통합되어 성공적으로 구현되어, 에리스리톨 생산이 크게 향상된 돌연변이 균주를 분리할 수 있게 되었습니다¹⁴. 이 두 유형의 바이오센서 개발은 FADS 플랫폼의 미생물 육종 적용을 촉진할 큰 잠재력을 지니고 있으며, 기존 화학 프로브의 한계를 극복하고 스크리닝 가능한 표적 제품의 범위를 확장합니다.

요약하자면, 산업용 미생물을 위한 표준 고처리량 스크리닝 워크플로우가 제시되었습니다. 이 워크플로우의 신뢰성은 고수율 L-젖산을 생성하는 B. coagulans 균주 스크리닝에 성공적으로 적용됨을 통해 입증되었습니다. 이 워크플로우는 향후 고처리량 스크리닝을 수행하는 연구자들에게 귀중한 참고 자료를 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agar	Becton, Dickinson and Company	214030	고형 플레이트 준비
무수 에탄올	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	실험실 벤치 및 기기 닦기 및 소독
대기 및 실온 플라즈마(ARTP)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-002	ARTP는 변이체 라이브러리를 구성하기 위해 변이 유도에 활용되었습니다.
B. coagulans	Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC	1511C0004000002355	B. coagulans ATCC 7050는 변이 유도를 위한 시작 균주 및 고속 드롭릿 스크리닝의 대상으로 사용되었습니다.
검은색 마이크로플레이트(96웰)	Corning	3925	96웰 검은색 마이크로플레이트는 젖산 센서 분석 및 젖산 농도 결정에 사용되었습니다.
탄산칼슘	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20011062	L-젖산 과잉생산자를 분리합니다.
염화칼슘	Sinopharm	10005819	염화칼슘은 미생물 배양 배지 제조에 사용되며 미생물 성장에 필수 영양소를 제공합니다.
칼슘 L-젖산염	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	69027528	검출 과정에서 표준 곡선 제조용 샘플로 사용됩니다.
원심분리 튜브(15 mL)	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	세균 액체 희석에 사용됨
채취 튜브	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-CL	드롭릿 수집 및 후속 배양용
컴퓨터	Lenovo	E450	소프트웨어 설치 및 DREM Cell 제어.
DAPI	Solarbio	c0065	세포 염색용
심도 웰 플레이트(24웰)	BKMAMLAB	110424008	깊은 우물 플레이트를 사용하여 B. coagulans 변이체의 초기 수율 검증
유화제(1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol)	MACKLIN	H817022	드롭릿 유화제는 물-기름 마이크로 드롭릿을 분해하고 내부 세포, 균주 또는 상청을 방출하여 후속 검출 및 분석을 위해 사용됩니다.
D-글루코스	Solarbio	G8150-1000	D-글루코스는 미생물 배양 배지 제조에 사용되며 미생물 성장에 필수 영양소를 제공합니다.
디암모늄 수소 시트르산염	Solarbio	D9950	디암모늄 수소 시트르산염은 미생물 배양 배지 제조에 사용되며 미생물 성장에 필수 영양소를 제공합니다.
무수 디포타슘 수소 인산염	Sigma-Aldrich	P8281	무수 디포타슘 수소 인산염은 미생물 배양 배지 제조에 사용되며 미생물 성장에 필수 영양소를 제공합니다.
DREM 소프트웨어 버전	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell v02.01.18	DREM 셀 기기 제어.DREM 소프트웨어는 Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.의 DREM Cell 기기 전용 상업용 프로그램입니다. 공식 액세스 또는 다운로드 URL이 없으며 기기와 함께 인증을 통해 배포됩니다.
드롭릿 포획 미세유체학 세포 분리기(DREM Cell)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-027	드롭릿 포획 미세유체학 세포 분리기는 단일 세포 캡슐화 및 분리를 위해 높은 처리량으로 변이체 라이브러리에서 고수율 균주를 신속하게 스크리닝하는 데 사용되었습니다.
드롭릿 생성 칩	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-009	드롭릿 생성 칩은 단일 세포 캡슐화를 위한 모노디스퍼스 피코리터(pL) 규모의 드롭릿을 생성하는 데 사용됩니다.
드롭릿 주입 칩	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-003	드롭릿 마이크로 주입 칩은 후속 생화학 반응을 위해 사전 형성된 드롭릿에 정밀하고 미량의 시약을 주입하는 데 사용됩니다.
드롭릿 분류 칩	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-002	드롭릿 분류 칩은 형광 신호를 기반으로 고수율 세포를 포함하는 대상 드롭릿을 분류하는 데 사용됩니다.