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Mitochondrial 콤플렉스에 대한 고해상도 네이티브 클리어 젤 Electophoresis (hrCNE)가 인 - 젤 활동 Assays
인간 배아 줄기 세포 (hESCs)은 다음 표준 약관을 사용 MEF - 냉방 중간에 5 일 동안 Matrigel에서 성장으로 전환 ˠ - 조사 또는 mitomycin C - 대우 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)의 monolayer에서 유지 관리되었습니다. MEFs 오염을 제거하려면, hESCs는 Matrigel에 다시 도금 및 추가 3 일간 MEF - 냉방 매체 성장했다. pluripotency 마커 월 4 SSEA - 4 Immunofluorescence 현미경은 hESC 차별 부족을 확인하는 데 사용되었다.
- 5 분 trypsinization (6 잘 플레이트에 따라 잘 1ml 1X의 트립신) 다음 따뜻한 1X PBS, pH를 7.4와 세포를 씻으십시오.
- 신선한 트립신 억제제의 동일한 음량을 (1X PBS, pH를 7.4에서 1mg/ml) 추가합니다. 200g에 수확 세포와 원심 분리기, 5 분, 실온.
- 신선한 1 '테아제 억제제 칵테일과 함께, 1.7ml (세포 펠렛의 크기에 따라) 얼음 차가운 mitochondria 절연 버퍼 (6.6mM 이미다졸 / HCL, pH를 7.0 83mM 자당)의 - 0.8에서 뜨는 및 resuspend pelleted 세포를 폐기하십시오. 10 분 얼음에 품어.
- 균 질기 (- 50 치기 ~ 40)와 세포를 다운스. 가벼운 현미경을 사용하여 균질의 완전성을 확인 trypan 파랑과 dounced 세포의 나누어지는 스테인.
- 4 10 분 2만그램에서 원심 분리기 ° C 또한 핵 및 큰 세포 조각이 들어있는 원유 mitochondrial 펠렛을 얻을 수 있습니다. 가만히 따르다가와 뜨는을 버리고 시켰던 원유 mitochondrial 펠렛의 무게. 펠렛은 -80에 저장할 수 있습니다 ·이가 멈추는 지점있다면 C 액화 질소에 즉시 냉동에 따라.
참고 : 차등 원심 분리 또는 기타 그라디언트 기반 절차가 순수한 mitochondrial 막 분획을 분리하고 수집하기 위해 사용될 수 있습니다. 심판을 참조하십시오. 자세한 내용은 4. 이러한 대체 방법은 mitochondrial 단백질 대신 세포 중량 또는 휴대폰 번호의 MG 당 복잡한 활동의 MG 당 mitochondrial 복잡한 활동을 얻을 것입니다. mitochondrial 단백질의 농도는이 비교를하기 위해 정화 후 결정이 필요합니다. 또한, 다른 절연 버퍼이 접근 방식이 필요할 수 있습니다. 순수 mitochondrial 막 분획의 solubilization 들어, 아래의 단계 6 다음의 참고를 참조하십시오.
- 얼음 차가운 solubilization 버퍼 (50mM NaCl, 50mM 이미다졸 / HCL 산도 7.0, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2mM 6 aminohexanoic 산성)과 vortexing하여 얼음에 원유 mitochondrial 펠렛을 Solubilize. 6 - aminohexanoic 산성은 1X 테아제 억제제 칵테일로 교체할 수 있습니다. 펠렛 중량의 20mg 당 solubilization 버퍼의 35μl를 사용하십시오. 10% 펠렛 중량 및 튜브를 flicking하여 믹스 20mg 당 W / V digitonin의 20μl를 추가합니다. 얼음 5-10 분 알을 품다. Dodecyl - BD - maltoside 또는 트리톤 X - 100은 단백질을 solubilize하는 digitonin에 대한 대체하실 수 있습니다. 세제 및 수량의 선택은 supercomplexes 또는 mitochondrial 단지의 multimeric 형태의 형성에 영향을 줄 수 있습니다. 자세한 내용은 ref.1를 참조하십시오.
참고 : 순수한 mitochondrial 막 분획을 solubilize에 필요한 세제의 수량 2~6그램 / G. 이르는 세제 / 단백질 무게 비율에 해당하는 mitochondrial 세포막을 solubilize하는 최적의 비율이 dodecyl - BD - maltoside에 대한 G / 2.5G이며, 대한 3g / G 트리톤 X - 100과 6g / digitonin에 대한 g.
- 4 15 분 ° C.에 대한 10만그램에서 solubilized 펠릿을 원심 분리기 맑은 뜨는를 수집합니다.
- 최종 5% W / V 글리세롤과 0.01 % W / V 개양귀비빛의 S (50 % W / V 글리세롤, 0.1 % W / V 개양귀비빛의 S 로딩 버퍼 재고 솔루션을 사용)에 버퍼를 로드할 추가합니다.
- 레인 당 원유 mitochondrial 펠릿 20 - 40mg이 들어있는 볼륨 젤 우물을로드합니다. 3.5 %가 젤 스태킹있는 아크릴 아미드 기울기 젤 (4 -13 %)를 사용합니다.
참고 : 젤 준비와 전기 영동 조건 :
bisacrylamide의 아크릴 아미드와 1.5g (49.5 % T, T는 AA와 bisAA와 C의 총 농도는 3% C.가의 48g : 겔 준비, 다음과 같은 아크릴 아미드 / 비스 - 아크릴 아미드 (AA / bisAA) 3 믹스를 사용하여 총 단량체로 crosslinker (bisAA)의 비율).
젤 버퍼 (3 ') : 1.5M 6 - aminohexanoic 산성, 75mM 이미다졸, 산도 7.0
| 그라데이션 젤 : | 4퍼센트 | 13% | 젤 스태킹 : | 3.5 % |
| AA / bisAA 세 믹스 | 2 ML | 6.5 ML | | 0.6 ML |
| 젤 버퍼 3 ' | 8.3 ML | 8.3 ML | | 2.7 ML |
| 글리세린 | | 5g | | |
| H 2 O | 14.7 ML | 5 ML | | 4.7 ML |
| 총 부피 | 25 ML | 25 ML | | 8 ML |
| 10 % APS | 139 μl | 125 μl | | 67 μl |
| TEMED | 14 μl | 12.5 μl | | 6.7 μl |
양극 버퍼 : 25mM 이미다졸 / HCL, pH를 7.0
음극 버퍼 : 50mM Tricine, 7.5mM 이미다졸 / HCL, 0.02 % W / V dodecyl - BD - maltoside, 0.05 % W / V deoxycholate, 산도 7.0
기름을 붓고 감기 방 (4-7 ° C)에서 젤을 실행합니다. 사용되는 초기 전압은 100V입니다. 예제는 스태킹 젤 입력되면, 전압은 15mA (0.15 '14'14 cm 젤)로 현재 제한과 500V 증가합니다. 전기 영동은 붉은 개양귀비빛의 S 염료의 날카로운 라인이 젤 전면에 접근 3-4 H 후에 중지됩니다. 또는 젤은 70 100V에서 일정한 전압 밤새 실행할 수 있습니다.
- 인 겔 활동 assays. 각 분석에 대한 부화의 시간은 단백질 solubilization의 효율성과 잘 당 로드된 자료의 양에 따라 달라집니다. 단지 I, IV 및 V는 일반적으로 단지 II 및 III보다 강한 신호를 얻을 수 있습니다.
콤플렉스 I (CI)
몇 시간 동안 실온에서 CI 버퍼 (2.5mg/ml NBT,, 0.1mg/ml NADH 5mM 트리스 - HCL, pH를 7.4)로 겔 슬라이스를 품어.
CI 버퍼 : 5mM 트리스 - HCL, pH를 7.4의 100ml 당 추가 :
0.01g NADH
0.25g NBT
15-45 분의 50 %와 10 %의 메탄올 초산에서 젤 수정. 고정 젤은 10% 초산에 보존되어 있습니다.
콤플렉스 II (CII)
몇 시간 동안 실온에서 CII 버퍼 (5mM 트리스 - HCL pH는 7.4, 0.2mM phenazine의 methasulfate,, 2.5mg/ml NBT succinate 20mM 나트륨)로 겔 슬라이스를 품어.
CII 버퍼 : 5mM 트리스 - HCL, pH를 7.4의 100ml 당 추가 :
200μl 1M 나트륨 succinate
80μl의 phenazine의 methasulfate (250mM PMS는 DMSO에 용해)
0.25g NBT
처럼 복잡한에 대한 설명 젤 수정
콤플렉스 III (CIII)
상온에서 몇 시간 동안, CIII 버퍼 (0.05 % 3,3 '- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB) 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2)로 겔 슬라이스를 품어.
CIII 버퍼 : 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2 100ml 당 추가 :
50mg의 diaminobenzidine의 tetrahydrochloride
처럼 복잡한에 대한 설명 젤 수정
콤플렉스 IV (문학)
몇 시간 동안 실온에서, 문학 버퍼 (0.05 % 3,3 '- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB), 50μM 말을 마음 시토크롬 C 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2)로 겔 슬라이스를 품어.
문학 버퍼 : 50mM 인산 나트륨, 산도 7.2 100ml 당 추가 :
50mg의 diaminobenzidine의 tetrahydrochloride
0.1g 말을 마음 시토크롬 C
처럼 복잡한에 대한 설명 젤 수정
콤플렉스 V (CV)
CV 버퍼 (35 밀리 트리스베이스, 270mM 글리신, 25 pH를 8.3 ° C, 14mM MgSO 4, 0.2 % W / V PB (NO 3) 2, 필름 ATP) 몇 시간 동안 실온에서.로 겔 슬라이스를 품어
CV 버퍼 : 솔루션의 당 100ml 추가 :
| 트리스베이스 | 0.424g |
| 글리신 | 2.026g |
| MgSO 4 | 0.345g |
| PB (NO 3) 2 | 0.29g |
산도를 (8.3 있어야합니다) 조정 필요 - 산성이나베이스를 사용하지 마십시오. 필터 추가
30 분 50 % 메탄올에서 젤를 수정하고 물을 전송할 수 있습니다.