이 동영상은 피더 세포가없는 조건에서 어떻게 피더에서 연속 통과 hESCs 세포가없는 조건에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 성장을 유지하는 방법을 보여줍니다. hESC의 확인은 pluripotency immunofluorescence 현미경으로 피더 셀없는 조건을 재배도 증명됩니다. 3 부 2.
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이 논문에서
요약
초록
이 동영상은 어떻게 MEF 플레이트에서 통과 hESCs에 피더 셀 - 무료 Matrigel 플레이트에 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 세포에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다.
프로토콜
hESC 문화 일상 유지 보수
- hESC 문화 미디어는 모든 24 시간을 변경해야합니다. 4 ° C에 저장된 ES 미디어 주식 병에서 (6 잘 플레이트 당 ~ 20ml) 필요한 솔루션의 금액, 50ml 팰컨 관에서 개최하고, ° C 물 목욕 37에 따뜻한를 꺼내. 미디어가 따뜻하게되면 10ng/ml의 최종 농도가 4에 저장된 bFGF ° C를 추가합니다. ° C 즉시 사용 후 4 다시 bFGF 주식을 버려!
- 모든 6 자 접시에서 제거하지만, 미디어의 500μl를 ~. 소용돌이 제거 파편을 일시 중 지할 수있는 문화 접시를해야합니다. hESC 문화 미디어에서 bFGF가 철저하게 혼합되어 있는지 확인하고 6 자 판의 각 잘 돌아 신선한 미디어 3ml를 추가합니다. 인큐베이터에있는 플레이트 다시 꽂아.
Matrigel에 MEFs에서 분리 hESCs
보통 MEFs에 hESCs의 합류 6 자 판은 6 - 잘 접시는 우물이 4-5일 분리 후 다시 합류되고 함께 Matrigel에 1시 3분부터 1시 2분까지을 분할 수 있습니다.
- Matrigel, MEF - 냉방 미디어 (CM)에 분할 hESCs는 pluripotency 유지하는 데 사....
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토론
이 동영상은 어떻게 통과 hESCs에 MEF 플레이트에서 피더 셀 - 무료 Matrigel 번호판을 보여줍니다. Matrigel에 식민지 밀도가 MEFs에 대한 일반적인 분할하여 식민지의 밀도보다 높은됩니다. 그러한 월 4 SSEA - 4로 hESC pluripotency 마커에 대한 Immunofluorescence 염색법과 현미경이나 흐름 cytometry는 피더 무료 문화 조건에 undifferentiated 상태에서 hESCs의 유지를 확인하기 위해 필요합니다.
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감사의 글
Teitell 연구실에서 인간 배아 줄기 세포 연구는 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 씨앗 부여 RS1 - 00313에 의해 지원됩니다. 우리는 UCLA, 특히 박사 Amander 클라크 박사 제롬 잭, 우리의 연구들의 지원 UCLA 브로드 연구소 줄기 세포 핵심 시설의 멤버에 재생 의료 및 줄기 세포 연구의 브로드 센터의 회원을 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| Knockout Serum Replacer (KSR) | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| 비필수 아미노산 (Non-essential Amino Acids) | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | 시약 | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | 시약 | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | 시약 | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | 시약 | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | 시약 | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | 시약 | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 항체 | 시약 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | 시약 | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | 시약 | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
참고문헌
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK.
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