이 동영상은 피더 세포가없는 조건에서 어떻게 피더에서 연속 통과 hESCs 세포가없는 조건에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 성장을 유지하는 방법을 보여줍니다. hESC의 확인은 pluripotency immunofluorescence 현미경으로 피더 셀없는 조건을 재배도 증명됩니다. 3 부 3.
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이 논문에서
요약
초록
이 동영상은 피더 세포가없는 조건에서 어떻게 피더에서 연속 통과 hESCs 세포가없는 조건에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 성장을 유지하는 방법을 보여줍니다. hESC의 확인은 pluripotency immunofluorescence 현미경으로 피더 셀없는 조건을 재배도 증명됩니다.
프로토콜
Matrigel에서 Matrigel을 분리 hESCs
보통 Matrigel에 hESCs의 합류 6 잘 판은 우물이 4-5일 분리 후 다시 합류되기와 다른 Matrigel 판에 1시 5분에서 1시 3분까지 분할 수 있습니다.
- 분할하기 전에 위에서 설명한 CM과 Matrigel 플레이트는 준비가되어 있습니다.
- 분할 당일, × 1 분리를위한 PBS, pH7.4를 각각 잘 씻어 각각 잘하는 1mg/ml Dispase (DMEM/F12 매체와 희석 5mg/ml 재고 솔루션)의 1ml을 추가하고, 37 품어 ° C 3 분.
- 1 각 잘 세 번 씻어 × PBS, pH7.4은, bFGF없이 ES 미디어 1ml를 추가 우물의 바닥에서 식민지를 긁어 세포 스크레이퍼를 사용하여 50ml 팔콘 튜브의 정지 hESCs를 수집하고, 원심 분리에 의해 펠릿 200g에 상온에서 5 분.
- 다시 타석으로 Matrigel 플레이트에 hESCs 먼저 DMEM/F12과 Matrigel 접시를 씻어 잘 당 10ng/ml bFGF와 보충 CM의 2.5ml를 추가합니다. 10ng/ml bFGF, 피펫 세포 현탁액 위, 아래로 세 번 함께 보충 CM의 적절한 볼륨에 hESC 펠렛을 Resuspend. (참고 : ....
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토론
3 동영상이 시리즈는 (MEF) 피더 세포 (비디오 1) 어떻게 통로를 피더 셀 - 무료 접시 (비디오 2) Matrigel을하고, 방법을 유지하기 위해 마우스 배아 fibroblast에서 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다 Matrigel 피더 셀 무료 조건 (동영상 3) passaging하여 hESCs. 많은 이전의 연구는 실용적, undifferentiated hESCs의 유지 보수가 inactivated MEF 피더 세포에 대한 문화를 필요로했다. 그러나 대부분의 실험, 피더 세포 오염의 무료 hESCs의 순수한 인구가 필요합니다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 우리는 어떻게 통과 hESCs에 MEF 피더 플레이트에서 피더 셀 - 무료 Matrigel 플레이트 및 유지하고 피더에서 연속 통과 hESC 식민지 세포가없는 조건을 증명하고있다. 이 프로토콜에 따라, MEF 피더 셀 오염의 작은 금액은 아직 Matrigel의 접시에 통로 하나가 존재할 수 있지만,이 오염 물질은 일반적으로 시각화하기 쉽습니다. 이상 Matrigel 통로.......
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감사의 글
Teitell 연구실에서 인간 배아 줄기 세포 연구는 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 씨앗 부여 RS1 - 00313에 의해 지원됩니다. 우리는 UCLA, 특히 박사 Amander 클라크 박사 제롬 잭, 우리의 연구들의 지원 UCLA 브로드 연구소 줄기 세포 핵심 시설의 멤버에 재생 의료 및 줄기 세포 연구의 브로드 센터의 회원을 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| Knockout Serum Replacer (KSR) | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| 비필수 아미노산(Non-essential Amino Acids) | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | 시약 | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | 시약 | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | 시약 | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | 시약 | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | 시약 | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | 시약 | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | 시약 | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 항체 | 시약 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin 접합 Mouse IgG3 | 시약 | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-접합 항토끼 IgG | 시약 | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
참고문헌
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK.
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