3.2: 내부 표준

1. 적절한 샘플 처리: 솔루션 만들기

1. 깨끗한 비커를 가지고 정확한 양의 샘플을 대량으로 넣습니다. 사용된 실제 질량을 기록합니다. 이 예에서 아데닌의 용액은 다음 분석을 위한 내부 표준으로 사용하기 위해 볼륨 플라스크에서 만들어집니다. 아데닌의 질량은 100 mg. 긴 목을 가지고 있고 아데닌을 쉽게 추가하거나 제거할 수 없기 때문에 체적 플라스크에 직접 질량을 두지 마십시오.
2. 약 25mL의 용매(이 경우 디메틸 설산화물(DMSO)를 비커에 넣고 저어서 용해하도록 한다. 이 예에서 최종 용액은 50mL 체피 플라스크로 만들어지므로 약 25mL만 추가하여 비커를 헹구고 최종 볼륨으로 구성된 솔루션이 가능합니다.
3. 고체가 용해되면 용액을 체적 플라스크에 붓습니다.
4. 비커와 교반바를 소량의 용매로 헹구고 약 10mL로 헹구고 헹구는 플라스크에 붓습니다. 두 번 더 반복합니다. 이렇게 하면 적절한 솔루션 전송을 보장할 수 있습니다.

2. 내부 표준 교정 곡선 준비

1. 가스 크로마토그래피 분석을 위해 원하는 표준 샘플을 준비합니다. 이 예에서 카페인은 아세토닐릴을 사용하여 커피에서 추출한 다음 아데닌을 측정을 위한 내부 표준으로 사용됩니다.
2. 카페인 샘플의 경우 1 mg/mL 샘플을 만드는 데 필요한 샘플의 양을 측정합니다. 10 mL 볼륨 플라스크를 사용하는 경우, 즉, 10 mg입니다.
3. 분석물의 무게를 비커로 계량하고 용매(here methanol)를 몇 mL에 추가하여 용해한 다음 3개의 헹구기를 사용하여 체피 플라스크로 정량적으로 전달합니다.
4. 0.2, 0.5, 2 mg/mL 카페인과 비슷한 방식으로 3 가지 표준을 더 확인하십시오.
5. 각 카페인 표준의 1mL을 샘플 바이알에 넣습니다.
6. 각 시료 바이알에 2 mg/mL 아데닌 내부 표준의 0.2mL을 추가합니다.
7. 각 카페인 표준으로 가스 크로마토그래피 실험을 실행합니다. 각 크로마토그램에 대해 카페인과 표준에 대한 피크 영역의 비율을 계산합니다.
8. 면적 비율 대 농도 비율을 플롯합니다. 해당 플롯의 기울기는 응답 계수입니다.

3. 가스 크로마토그래피를 위한 내부 표준이 있는 실제 시료 준비

1. 가스 크로마토그래피 분석을 위해 원하는 샘플을 준비합니다. 이 예에서, 카페인은 아세트트론트트릴을 사용하여 커피에서 추출됩니다.
2. 커피 샘플의 경우 커피 2g을 100mL 비커에 넣습니다. 커피의 정확한 무게를 기록합니다.
3. 20mL의 아세토닐트리어를 비커에 넣습니다.
4. 자주 저어, 20 분 동안 앉아 있도록.
5. 깔때기의 필터 용지를 사용하여 커피 찌꺼기를 필터링합니다.
6. 소량의 아세토닐릴(5mL)으로 필터 용지 3x를 헹구는 다.
7. 여과물의 최종 볼륨을 측정합니다. 약 35mL이어야 합니다.

4. 샘플을 실행하고 농도를 계산

1. 커피 추출물 샘플 1mL을 추출하고 바이알에 내부 표준0.2mL를 추가합니다. 유리병을 자동 샘플러 랙에 넣습니다.
2. 샘플의 GC 분석을 실행합니다. GC 조건이 카페인과 아데닌이 분리되도록 하십시오. 이 예에서, 이소체 분리는 200°C에서 수행된다.
3. 분석 후 내부 표준 피크와 분석피크 모두에 대한 피크 영역을 계산합니다. 그들의 비율을 사용하여, 샘플에 카페인의 양을 계산합니다.

5. 결과: 내부 표준카페인 GC 분석

1. 카페인의 GC 분석은 도 1에도시된다. 아데닌은 내부 표준으로 사용됩니다. 피크 영역의 비율을 측정하고 농도의 비율에 비해 플롯할 수 있습니다. 플롯의 기울기는 응답 계수(이 경우 1.8)입니다.
2. 도 2는 아데닌 내부 표준을 가진 커피 샘플의 크로마토그램을 나타낸다. 피크 영역의 비율은 1.78입니다. 반응 인자 및 아데닌의 알려진 농도(0.33 mg/mL)를 사용하여 알 수 없는 시료의 카페인 농도는 0.33 mg/mL로 계산됩니다.

그림 1. 내부 표준을 사용하여 교정 플롯을 사용합니다. 각각에 0.33 mg/mL 아데닌 내부 표준이 추가된 3개의 표준 카페인 샘플(1, 0.5 및 0.2 mg/mL)에 대한 면적 비율 대 농도 비율의 플롯. 선의 기울기는 응답 계수인 1.8입니다.

그림 2. 아데닌 내부 표준 커피의 크로마토그램. 샘플에 대한 FID 검출기의 응답 플롯입니다. 세 가지 주요 봉우리는 아데닌 (IS), 카페인, 팔미티산입니다.

시료를 취급하거나 이송할 때마다 시료 손실이 발생할 수 있으므로 정확한 농도 계산이 어렵습니다.

정확성을 보장하려면 신중한 시료 준비를 사용하고 시료 처리 및 이송 단계의 수를 제한하여 시료 손실의 영향을 최소화해야 합니다. 그러나 샘플 손실은 불완전한 샘플 조작, 매트릭스 효과 및 분석 절차의 변형과 같은 시스템적 오류로 인해 발생할 수도 있습니다.

이러한 손실의 원인은 관심 화합물과 유사하지만 동일하지는 않은 종의 알려진 농도를 추가함으로써 설명할 수 있습니다. 이를 내부 표준이라고 합니다. 내부 표준물질에 대해 발생하는 모든 샘플 손실은 농도를 정확하게 계산할 수 있도록 분석물에 대해 유사해야 합니다.

이 비디오는 미지 물질의 농도를 결정할 때 샘플 손실을 설명하기 위해 내부 표준 및 적절한 실험실 기법을 사용하는 방법을 보여줍니다.

내부 표준물질은 분석 중에 표준물질, 샘플 및 블랭크에 알려진 양으로 추가되는 물질입니다.

크로마토그래피와 분광법에서는 내부 표준물질과 분석물에 대한 신호의 비율이 계산됩니다. 반응 계수(response factor)라고 하는 이 비율은 분석물과 표준 농도의 비율에 비례합니다.

반응 계수 R은 다음 방정식으로 표현할 수 있으며, 여기서 A는 시료 및 내부 표준물질의 분석 신호를 나타내고 C는 시료 및 내부 표준물질의 농도를 나타냅니다.

내부 표준은 체계적인 오류와 무작위 오류를 모두 보상할 수 있습니다. 예를 들어, 시료 측정 시 불일치와 같은 무작위 오류는 내부 표준물질과 분석물 모두에 대해 동일합니다. 따라서 신호의 비율은 변하지 않습니다.

용액의 매트릭스 효과와 같은 체계적인 오류의 경우, 매트릭스 효과가 표준물질과 분석물 모두에 대해 동일한 한 비율은 영향을 받지 않습니다.

내부 표준은 큰 이점을 제공하지만 적합한 표준을 선택하기가 어려울 수 있습니다. 내부 표준물질은 분석물과 유사하지만 동일하지 않은 신호를 가져야 합니다. 또한 어떤 식으로든 분석물의 측정에 영향을 미칠 수 없습니다.

마지막으로, 농도를 잘 알고 있어야 합니다. 이는 내부 표준물질이 샘플에 기본적으로 존재하지 않도록 함으로써 달성됩니다. 따라서 용액에서 그것의 유일한 공급원은 첨가된 알려진 농도입니다.

다음 실험에서는 미지의 샘플에서 카페인의 농도를 가스 크로마토그래피로 측정합니다.

이는 알려진 카페인 용액을 사용하여 검량 곡선을 생성하고, 아데닌을 내부 표준으로 사용함으로써 달성됩니다. 검량선의 기울기는 반응 계수와 같습니다.

반응 계수가 알려지면 측정된 크로마토그램 면적 비율에서 미지 물질의 농도를 계산할 수 있습니다.

이제 내부 표준의 기본 사항을 이해했으므로 절차를 살펴보겠습니다.

절차를 시작하려면 내부 표준물질인 아데닌 100mg의 무게를 깨끗한 비커에 정확하게 넣습니다.

다음으로, 약 20mL의 디메틸 설폭사이드에 용해시키고 용액을 혼합합니다.

아데닌이 용해되면 용액을 50mL 용량 플라스크에 붓습니다.

비커를 헹구고 DMSO 10mL로 바를 저어주고 헹굼을 플라스크에 붓습니다. 적절한 용액 전달을 위해 이 헹굼을 두 번 반복하십시오. 보정 표시까지 채우면 2 mg/mL 농도의 내부 표준물질이 생성됩니다.

다음으로, 100mg의 카페인을 비커에 넣어 원액을 준비합니다. 소량의 메탄올로 카페인을 녹입니다. 그런 다음 3회 헹굼을 사용하여 이 용액을 새로운 25mL 부피 플라스크로 옮깁니다. 이것은 4 mg/mL 원액입니다. 이를 사용하여 3가지 카페인 기준을 만드십시오.

다음으로, 각 플라스크에 0.2mL의 내부 표준물질인 아데닌을 추가합니다. 각각을 메탄올로 최종 부피까지 채웁니다. 각 용액을 샘플 바이알로 옮깁니다.

가스 크로마토그래프를 통해 각 카페인 표준물질을 실행합니다. 카페인과 아데닌 표준물질에 대한 피크 면적의 비율을 계산합니다.

먼저 100mL 비커에 커피 2g의 무게를 넣고 무게를 기록합니다.

다음으로 메탄올 20mL를 넣어 커피에서 카페인을 추출합니다. 용액을 20분 동안 저어줍니다.

B?chner 깔때기를 사용하여 커피 찌꺼기를 걸러냅니다. 소량의 메탄올로 비커를 헹구고 이 헹굼을 깔때기에 붓습니다. 헹굼을 두 번 반복합니다.

여과액의 최종 부피를 측정합니다. 약 35mL여야 합니다.

분석을 위해 샘플을 준비하려면 샘플 바이알에 커피 추출물 1mL를 추가합니다. 그런 다음 0.2mL의 아데닌 내부 표준물질을 추가하고 바이알을 기기의 자동 시료 주입기 랙에 놓습니다.

샘플에 대한 가스 크로마토그래피 분석을 실행하여 카페인과 아데닌이 분리되는 조건인지 확인합니다.

분석을 완료한 후 내부 표준물질과 분석물 모두에 대한 피크 면적을 계산합니다.

모든 샘플이 분석되면 피크 면적 대 농도 비율의 비율을 표시하여 카페인/아데닌 용액에 대한 표준 검량선을 결정할 수 있습니다. 반응 계수를 나타내는 이 선의 기울기는 1.8이었습니다.

다음으로, 추출된 커피 샘플의 GC 데이터를 분석합니다. 피크 면적의 비율은 1.78로 계산되었습니다. 반응 인자와 내부 표준물질인 아데닌의 알려진 농도를 사용하여 미지 샘플의 카페인 농도를 0.33mg/mL로 계산했습니다.

다양한 과학 전문가에 걸친 다양한 유형의 반응은 오류 및 샘플 손실의 영향을 최소화하기 위해 내부 표준물질을 활용합니다.

시료 전처리 중에 발생하는 시료 손실의 영향은 내부 표준물질을 사용하여 최소화할 수 있으며, 농도 비율을 거의 일정하게 유지할 수 있습니다.

이 예에서는 액체-액체 추출 공정을 사용하여 용해된 세포에서 생체 활성 지질을 추출했습니다. 샘플 준비 중 오류를 설명하기 위해 추출 시작 시 안정 동위원소 내부 표준물질이 추가되었습니다.

내부 표준물질은 생체 활성 지질의 준비뿐만 아니라 분석에도 중요했습니다. 지질은 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 분리하고 질량 분석법을 통해 분석했습니다.

분광학에서 내부 표준은 광원 강도의 변화로 인한 무작위 오류를 수정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 램프 또는 기타 광원이 가변 전력을 갖는 경우 흡수에 영향을 미치고 결과적으로 샘플의 방출에 영향을 미칩니다. 그러나 내부 표준물질과 분석물의 비율은 광원이 그렇지 않더라도 일정하게 유지됩니다.

크로마토그래피에서 가장 큰 오류 원인 중 하나는 주입입니다. 자동 샘플러는 이를 최소화하는 데 도움이 되지만 오류는 여전히 1?2%의 상대 표준 편차일 수 있습니다.

이 예에서는 내부 표준물질을 포함하는 증기 표준물질을 가스 크로마토그래피를 사용하여 분석하여 검량선을 설정했습니다. 이 작업이 완료되면 알려지지 않은 샘플을 측정하고 샘플의 휘발성으로 인한 손실을 설명할 수 있습니다.

방금 JoVE의 내부 표준 소개를 시청했습니다. 이제 샘플 손실, 내부 표준물질 및 반응 요인을 최소화하기 위한 모범 사례를 이해해야 합니다.

시청해 주셔서 감사합니다!