고체 위상 합성
출처: 비 M. 동과 다이앤 르, 캘리포니아 대학, 어바인, 캘리포니아 화학학과
메리필드의 고체 상 합성은 반응성 분자가 고체 지지에 묶여 있고 원하는 화합물을 형성하기 위해 연속적인 화학 반응을 겪는 노벨상 수상 발명품입니다. 분자가 고체 지지체에 묶여있을 때, 과잉…
1. 수지로드
- 100mL 펩타이드 합성 용기에 2-클로로트리틸 염화물(CTC) 수지(1.1mmol/g, 0.360 g, 0.400 mmol)를 첨가한다. 20mL DMF를 추가하고 N 2에서 30 분 동안 팽창 할 수있습니다.
- 진공 상태에서 구슬을 빼내고 10mL DMF를 추가합니다.
- 500 mg Fmoc-Ala-OH (1.60 mmol)와 2.5 mL i-Pr2EtN을 추가하고 N2에서 15 분 동안 혼합하십시오.
- 용매를 진공 상태에서 배출하고 Fmoc-Ala-OH로 15분 동안 적재를 반복합니다.
- 용매를 진공 상태에서 배출하고 10mL DMFunder N2로구슬을 세척하고 진공 3배 하에서 배수합니다.
2. Fmoc 그룹의 보호 해제
- DMF에 10mL 20% 4메틸피프리딘을 넣고 15분 동안 N2 아래에서 구슬을 저어줍니다.
- 용매를 진공 상태에서 배출하고 보호 해제를 반복합니다.
- 구슬을 N2에서 10mL DMF로 세척하고 진공 3배 이하로 배수합니다.
3. 카이저 테스트 수행
- 솔루션 A(0.5mL 0.01 M KCN, 24.5mL 피리딘), 솔루션 B(닌히드린 1g, 20mL n-부타놀), 용액 C(20g 페놀, 10mL n-butanol)를각각 2개의 시험튜브에 추가하여 카이저 테스트를 수행한다. 한 개의 테스트 튜브는 대조군이 될 것이고 다른 하나는 반응을 모니터링합니다.
- 반응 시험관으로부터 수지의 구슬을 몇 개 추가하고 두 개의 시험관을 110°C로 가열한다.
- 보호 가 완료되면 테스트 튜브의 내용이 진한 파란색 / 보라색 으로 바뀝니다. 보호 해제가 완료되지 않았거나 실패하면 솔루션은 노란색으로 유지됩니다. 반응 테스트 튜브를 제어 테스트 튜브와 비교합니다.
4. 다음 빌딩 블록 커플링
- 진공 상태에서 용매를 배출합니다.
- 구슬을 N-메틸-2-피롤리돈 10mL로세척하고 진공 상태에서 용매를 배출한다.
- 다음 커플링을 시작하려면 10mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1.6 mmol), 610 mg HBTU (1.6 mmol), 2.5 mLi-Pr2EtN을 추가하고 수지N2 에서 30 분 동안 거품을 허용하십시오.
- 진공 상태에서 용매를 배출합니다.
- 구슬을 N2에서 10mL DMF로 세척하고 진공 3배 이하로 배수합니다.
- 카이저 테스트를 수행 (단계 3.1-3.3 참조) 커플링의 완료를 찾습니다. 테스트 튜브의 구슬과 용액은 노란색이어야 합니다.
5. 수지에서 펩타이드를 찢어
- 2.1-2.3 단계를 사용하여 나머지 Fmoc 그룹을 클리크합니다.
- 용매가 진공 상태에서 배수된 후 N 2 에서 수지 및 버블에 40 mL 절단 용액(95% TFA, 2.5% H2O, 2.5% TIPS)을 추가하여N2에서 3h로 기포합니다.
- 펩티드 신디사이저에 새로운 수신 플라스크를 놓고 진공 하에서 원하는 펩티드를 포함하는 TFA 용액을 새로운 플라스크에 배출한다.
6. 펩타이드의 강수량과 나는 고양
- TFA 용액을 4원추형 바이알로 분리하고 각 유리병에 25mL 콜드 에테르(−20°C)를 추가하여 펩티드를 침전시한다.
- 20 분 동안 바이알 (3,000 rpm, 0-4 °C)을 원심 분리합니다. 원뿔 바이알에서 남은 TFA 및 에테르 용액을 데산하고 펩티드 침전물을 농축하여 원하는 디펩티드를 백색 고체로서 감당할 수 있다.
고체상 합성은 불용성 물질에 결합하면서 생성물을 합성하는 방법입니다.
고체상 합성은 종종 생물학적 올리고머 및 펩타이드, 핵산 및 올리고당과 같은 폴리머를 생산하는 데 사용됩니다. 이 분자는 단량체라고 하는 더 작은 분자 소단위체의 사슬로 구성되어 있습니다. 올리고머 또는 폴리머를 합성하려면 단량체를 올바른 순서로 추가해야 하기 때문에 여러 단계를 거쳐야 합니다.
다단계 합성의 문제는 중간 산물이라고 하는 각 단계의 안정적인 산물을 정제하고 분리하면 전체 수율이 감소한다는 것입니다. 고체상 합성에서 중간 생성물은 합성 전반에 걸쳐 고체 지지체에 결합된 상태로 유지됩니다. 이를 통해 용액상 시약, 용매 및 부산물을 씻어낼 수 있으므로 단계 간에 각 중간 생성물을 정제하고 분리할 필요가 없습니다.
이 동영상은 고체상 펩타이드 합성 절차를 설명하고 화학에서 고체상 합성의 몇 가지 응용 분야를 소개합니다.
고체상 합성에서 분자는 일련의 반응에서 고체 지지체에서 합성됩니다. 예를 들어, 올리고머 또는 폴리머는 한 번에 하나의 단량체를 합성하여 최종 제품을 형성합니다. 성장하는 올리고머 또는 중합체는 시약으로 지지체로부터 분리되거나 절단될 때까지 고체 지지체에 강하게 결합된 상태를 유지합니다.
각 단량체는 폴리머 사슬의 일부가 되기 위해 최소 두 개의 결합 부위를 가져야 하지만, 단량체가 올바른 원자에 결합하도록 보장하기 위해 한 번에 하나의 결합 부위만 사용할 수 있습니다. 이는 하나 이상의 합성 단계에서 반응하지 않는 작용기인 보호기를 통해 달성됩니다. 결합 부위는 보호 그룹을 반응성 작용기로 전환하기 위해 분자를 특정 시약으로 처리함으로써 복원되거나 탈보호됩니다.
고체상 합성을 시작하기 위해 출발 물질은 유일하게 사용 가능한 결합 부위에서 특별히 설계된 수지 또는 불용성 폴리머에 결합됩니다. 그런 다음, 결합된 시작 물질은 사슬에서 두 번째 단량체의 결합을 허용하기 위해 보호가 해제됩니다. 다음으로, 사슬의 두 번째 단량체 용액을 결합제와 함께 첨가하여 단량체 간의 결합을 용이하게 합니다.
두 번째 단량체가 출발 물질에 결합하면 생성된 이합체 중간 생성물이 탈보호됩니다. 이 공정은 타겟 올리고머 또는 폴리머가 형성될 때까지 반복됩니다. 생성물은 고체 지지체에서 용액으로 절단되어 정제, 분리 및 분석될 수 있습니다.
고체상 합성은 아미노산 사슬인 펩타이드의 합성에 자주 사용됩니다. 아미노산에는 아민기, 카르복실기, 치환기 또는 '측쇄'가 있습니다. 아민은 초기에 보호됩니다. 일단 탈보호되면, 아민은 다음 아미노산의 카르복실기와 펩타이드 결합을 형성합니다.
이제 고체상 합성의 원리를 이해했으므로 고체상 펩타이드 합성을 위한 절차를 진행하여 처음 두 아미노산의 추가를 시연해 보겠습니다.
절차를 시작하려면 폐기물을 담는 수용 플라스크를 100mL 수동 펩타이드 합성 용기에 연결합니다. 그런 다음 0.360g의 2-chlorotrityl chloride resin을 용기에 넣습니다. 질소 가스 라인을 용기 사이드암에 연결하고 진공 라인을 톱니 모양의 호스 어댑터에 연결합니다.
수지에 20mL의 디메틸포름아미드를 넣고 질소 가스의 흐름에서 수지 비드가 30분 동안 팽창하도록 합니다. 그런 다음 진공을 적용하여 용매를 배출합니다.
DMF 10mL, Fmoc 보호 아미노산 1.6mmol, N,N-디이소프로필에틸아민 2.5mL를 용기에 추가합니다. 용액을 혼합하는 질소 가스 아래에서 15분 동안 기포를 일으켜 보호된 아미노산을 수지에 로드합니다.
진공 상태에서 용매를 제거하고 두 번째 로딩을 수행합니다. 용매를 제거한 후 로드된 수지 비드를 DMF의 10mL 부분에 3회 교반하고 각 세척액을 수용 플라스크로 배출합니다.
다음으로, DMF에서 20% 용액 4-메틸피페리딘 10mL를 로드된 비드에 추가합니다. 혼합물을 15분 동안 거품을 일으켜 Fmoc 그룹을 제거합니다.
용매를 배출하고 보호 해제 절차를 반복합니다. 이전과 같이 적재된 수지를 세 번 세척하고 배수합니다. 다음 단계를 위해 준비될 때까지 비드를 용매에 보관하십시오.
로드된 화합물이 완전히 보호되지 않았는지 확인하려면 먼저 두 개의 시험관에 각 Kaiser 테스트 용액을 1-2방울 떨어뜨립니다.
로드된 몇 개의 비드를 테스트 튜브에 넣고 오일 배스에서 두 튜브를 모두 110도로 가열합니다. 수지 혼합물이 짙은 파란색에서 자주색으로 변하면 탈보호화가 완료된 것이며, 이는 혼합물에 아민기가 존재함을 나타냅니다.
커플링 단계를 시작하려면 먼저 N2 가스 흐름에서 10mL의 NMP로 비드를 세척합니다.
그런 다음 NMP 10mL, 다음 Fmoc-protected 아미노산 1.6mmol, 커플링제 HBTU 1.6mmol 및 DIPEA 2.5mL를 로드된 수지에 추가합니다.
수지 혼합물을 통해 N2 가스를 30 분 동안 거품을 일으킨 다음 용매를 배출합니다. 이전과 같이 DMF 10mL 부분으로 비드를 세 번 세척하고 배수합니다.
카이저 테스트를 반복합니다. 비드와 용액이 노랗게 변하면 커플링이 성공적으로 발생한 것이며, 이는 아민기가 존재하지 않음을 나타냅니다.
다음으로, DMF에서 새로운 Fmoc 그룹을 20% 4-메틸피페리딘으로 절단하고 DMF 10mL 부분으로 비드를 세척합니다. 타겟 펩타이드에 남아 있는 각 아미노산에 대해 커플링 및 탈보호를 반복합니다.
마지막 아미노산이 보호해제되고 수지 비드가 세척된 후 40mL의 펩타이드 절단 용액을 첨가하여 수지에서 펩타이드 생성물을 분리합니다.
수지 혼합물을 통해 질소 가스를 3시간 동안 거품을 일으킨 다음 수용 플라스크를 교체하십시오. 수지 혼합물의 용액을 진공 상태에서 새 수용 플라스크로 옮깁니다.
최종 생성물을 생성하려면 회전 증발기로 용매를 제거하십시오.
고체상 합성은 생물학 및 화학에서 널리 사용됩니다. 몇 가지 예를 살펴보겠습니다.
고체상 합성은 에너지 저장과 같은 중요한 생물학적 역할을 하는 단순 설탕 단량체의 짧은 사슬인 올리고당에 대한 많은 새로운 합성 경로를 열었습니다. 펩타이드 결합과 달리 당 사이의 각 결합에는 입체중심이 포함되어 있습니다. 올리고당을 합성하려면 단량체의 순서가 정확해야 할 뿐만 아니라 결합도 올바른 입체화학을 가져야 합니다. 고체상 합성 기술은 고도의 입체 선택성 공정으로 각 단량체를 결합하기 위해 개발되었으며, 오늘날에는 자동화할 수 있을 만큼 충분히 정제되었습니다.
고체상 합성은 조합 화학에 대한 일반적인 접근 방식으로, 단일 합성 공정에서 화합물의 여러 변형을 합성하는 관행입니다. 적재된 수지는 다른 단량체 또는 분자와 반응하기 위해 부분으로 쉽게 분할될 수 있습니다. 각 반응 후, 부분을 세척하고 재결합합니다. 이는 원하는 수의 제품이 생성될 때까지 반복됩니다. 이 기술은 새로운 화합물을 생성하거나 다양한 분자를 가진 화합물의 반응성을 평가하는 데 사용할 수 있기 때문에 제약 연구에 특히 유용합니다.
방금 JoVE의 고체상 합성에 대한 소개를 시청했습니다. 이제 고체상 합성의 기본 원리, 고체상 펩타이드 합성 절차, 유기 화학에서 고체상 합성이 어떻게 사용되는지에 대한 몇 가지 예를 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!
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Q1: Why is solid phase synthesis better than traditional multi-step synthesis?
Solid phase synthesis improves overall yield by eliminating intermediate purification steps. Since the product remains bound to the solid support throughout synthesis, solution-phase reagents, solvents, and byproducts can be washed away without isolating each intermediate product. This streamlined approach saves time and increases efficiency in synthesizing oligomers and polymers.
Q2: What role do protecting groups play in solid phase synthesis?
Protecting groups are functional groups that remain unreactive during specific synthesis steps, ensuring monomers bind to the correct atom. Each monomer requires two binding sites but only one can be available at a time. Protecting groups are removed through deprotection, converting them back to reactive functional groups and allowing the next monomer to attach in the correct sequence.
Q3: How does the Kaiser test verify successful deprotection in peptide synthesis?
The Kaiser test detects amine groups present on resin beads after deprotection. When heated with Kaiser reagent solutions, a dark blue to purple color indicates complete deprotection and the presence of free amine groups. If coupling has occurred successfully, the beads turn yellow, showing no amine groups remain available for further reaction.
Q4: What are the main steps in solid phase peptide synthesis?
Solid phase peptide synthesis involves binding an amino acid to resin, then repeatedly deprotecting the amine group, coupling the next amino acid using a coupling agent, and washing away byproducts. After all amino acids are added in sequence, the peptide is cleaved from the resin with cleavage solution and purified. This cyclical process ensures amino acids attach in the correct order.
Q5: How is solid phase synthesis applied in combinatorial chemistry?
In combinatorial chemistry, loaded resin is split into portions that react with different monomers or molecules. After each reaction, portions are washed and recombined, repeating until many product variants are generated. This technique is valuable in pharmaceutical research for synthesizing new compounds and evaluating how a compound reacts with diverse molecules efficiently.
Q6: Why is solid phase synthesis particularly useful for synthesizing oligosaccharides?
Oligosaccharides require monomers in correct order and bonds with precise stereochemistry. Solid phase synthesis techniques enable highly stereoselective coupling of each sugar monomer, controlling stereochemistry at each bond. These methods are refined enough to be automated, making solid phase synthesis ideal for producing complex oligosaccharides with biological roles like energy storage.
Q7: What happens after the final peptide product is cleaved from the resin?
After cleavage with peptide cleavage solution, the peptide product transfers to a new receiving flask under vacuum. The solvent is then removed using a rotary evaporator to generate the final product. This purification step isolates the synthesized peptide from the resin and other impurities for analysis and characterization.