Name: Hindlimb 국소 빈혈의 Murine 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: 학습하세요 쥐 후지 동맥 결찰을 통한 일측성 후지 허혈 유도 방법과 레이저 도플러 관류 영상 확인 기법을. 이 모델은 말초동맥질환 및 혈관 재생 연구에 필수적입니다.

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저자 안드레아 액스텔, 사토시 이토, MD, 제프 Velotta, MD, 그랜트 호이트, 로버트 C. 로빈스, MD, 진 유, MD, 팀 도일, 박사, 그리고 기술 지원을위한 스탠포드 작은 동물 이미징 핵심 주셔서 감사합니다. 저자는 또한, 수의 장비의 지원을 오전 비크포드 (주) 감사합니다. 이 연구는 국립 보건원에서 연구 기금 (R01 HL - 75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), 캘리포니아 대학 (15IT - 0257 및 1514RT - 0169)의 캘리포니아 담배 관련 질병 연구 프로그램에 의해 지원되었다 및 재생 의료 (RS1 - 00183)의 캘리포니아 연구소. NH는 미국 심장 협회에서 친교에 의해 지원됩니다.

1. 일방적 Hindlimb의 국소 빈혈의 유도 <ol><li> 이 작업에 필요한 수술 도구는 다음과 같습니다 좋은 지적 포셉, 지적 포셉, 스프링 가위, 외과 가위, 바늘 홀더, 그리고 견인기 있습니다. 그것이 상용 견인기보다 작은이기 때문에 우리는 클립을 사용하여 우리 자신의 견인기합니다. 압력솥이나 핫 구슬 살균기 사전 수술 이러한 도구를 소독. 소작 도구 및 살균 좋은 지적 목화 면봉도이 수술을 위해 필요한 것입니다. 이것은 도구로 절차를 수행하는 동안 필요한 끝을 다시 소독하는 것이 좋습니다. </li><li> 도구가 준비되면 1L/min의 흐름 속도 100 % 산소 isoflurane 1~3%을 포함하고있는 마취 유도 챔버에 마우스를 놓으십시오. </li><li> 그것이 외부 자극에 응답하지 않는 때까지 유도 챔버에 마우스를 둡니다. 그런 다음 유도 챔버에서 동물을 제거합니다. 그것은 isoflurane에 운영자 노출을 감소하기 위해 뚜껑을 여는하기 전에 상자에서 마취를 플러시하는 것이 좋습니다. </li><li> 그런 다음 미리 운영 테이블에 위로 향한 위치에 동물을 배치하고 isoflurane의 지속적인 흐름에 연결합니다. 전기 면도기를 사용 hindlimb에서 머리를 제거합니다. 철저하게 머리를 제거하는 제모 크림을 적용합니다. </li><li> 운영 테이블에 draped 온수 패드 위에 부정사 위치에 마우스를 놓고, isoflurane의 지속적인 흐름에 연결합니다. 확장 테이프의 조각으로 hindlimb을 확보. hindlimb가 안전되면 세 번갈아 betadine 및 알코올 스크럽으로 피부를 닦아냅니다. 수술의 나머지 부분은 hindlimb 지역의 확대를 얻을 10X 20X 확대 또는 해부 현미경을 사용합니다. </li><li> 좋은 포셉, 외과 가위를 사용하여 중간 허벅지 향해 무릎에서 약 1cm 길이, 피부의 절개합니다. </li><li> 인산염을 사용하면 생리를 버퍼 (PBS) 허벅지 근육을 둘러싸고있는 피하 지방 조직을 부드럽게 브러시 거리, 괜찮아요 지적 목화 면봉을 moistened. </li><li> 다음 절개 및 기​​본 대퇴 동맥을 나타내기 위해 피하 지방 조직을 통해 해부하다에 transversely 소작을 적용합니다. </li><li> 상처를 열고 아래쪽 끝단 vasculature의 더 나은 전망을 얻기 위해 견인기을 사용합니다. </li><li> neurovascular 번들을 폭로하는 막의 대퇴 칼집을 통해 부드럽게 잘 포셉과 좋은 지적 면봉, 피어스를 사용하여. </li><li> 그런 다음, 고급 포셉 및 면봉의 클린 세트를 사용하여 절개하다 그리고 사타구니 근처에있는 근위 위치에서 대퇴 정맥과 신경의 대퇴 동맥을 분리. 절개 후, 대퇴 동맥의 근위 끝 아래 7-0 실크 봉합사의 가닥을 전달합니다. 더블 노트를 사용하여 근위 대퇴 동맥을 막다. 두 번째 넥타이 가로 것입니다 개입 세그먼트 길이를 떠나하기 위해 가능한 한 상처에서 근위로 선박에 넥타이를 놓으십시오. </li><li> 무릎에 가까운 말초 위치에서 대퇴 정맥에서 대퇴 동맥을 분리합니다. 오금 동맥 근위 대퇴 동맥의 말초 끝에 아래 7-0 봉합사의 가닥을 전달합니다. 더블 노트를 사용하여 혈관을 막다. </li><li> 노트의 첫 번째 집합에서 불과 근위 더블 노트의 두 번째 세트와 함께 말초 대퇴 동맥을 막다. 봉합의이 두 번째는 거래 절차를 수행하는 동안 동맥을 재밌 위해 사용됩니다. </li><li> 마찬가지로, 재밌 목적 노트의 첫 번째 집합에 단지 말초 더블 노트의 두 번째 세트와 함께 근위 대퇴 동맥을 막다. </li><li> 좋은 지적 면봉과 봄 가위로 말초 및 근위 매듭 사이의 대퇴 동맥의 세그먼트를 가로로 쪼개다. 피어스 대퇴 정맥 벽하지 않는주의하십시오. </li><li> 견인기를 제거하고 5-0 Vicryl 봉합을 사용하여 절개를 닫습니다. 그들이 스스로 해산 이러한 봉합은 나중에 제거할 필요가 없습니다. </li><li> 절개가 폐쇄되면, 복구 새장에 draped 온수 패드의 상단에있는 동물을 장소와 정신까지 지속적으로 모니터합니다. </li><li> 동물은 1 시간 동안 회복 후 국소 빈혈의 유도를 확인하기 위해 레이저 도플러 혈액 관류 단계로 진행하십시오. </li></ol> 2. 레이저 도플러 혈액 관류 <ol><li> 레이저 도플러 재관류 단계를 시작하려면 1L/min의 흐름 속도 100 % 산소 isoflurane 1-3%을 포함하고있는 마취 유도 챔버에 마우스를 놓으십시오. </li><li> 그것이 외부 자극에 응답하지 않는 때까지 유도 챔버에 마우스를 둡니다. 그런 다음 유도 챔버에서 동물을 제거합니다. 그것은 isoflurane에 운영자 노출을 감소하기 위해 뚜껑을 여는하기 전에 상자에서 마취를 플러시하는 것이 좋습니다. </li><li> isoflurane의 지속적인 흐름에 연결된 사전 운영 테이블에있는 동물을 놓으십시오. 그런 다음 필요에 따라 제모 크림 다음 전기 면도기를 사용하여 hindlimb에서 머리를 제거합니다. </li><li> 머리를 제거 후,isoflurane의 지속적인 흐름에 따라 5 분 37 ° C 온수 표면에 동물을 놓으십시오. 온도 변화가 현저하게 재관류에 영향을하므로, euthermia을 보장하기 위해 핵심 온도를 모니터링합니다. </li><li> 5 분 후에, isoflurane의 지속적인 흐름에 연결된 같은 녹색 색 헝겊으로 비 반사 빛을 흡수 표면에있는 위로 향한 위치에 동물을 놓으십시오. hindlimbs를 확장합니다. </li><li> 다음, 레이저 도플러 영상기 및 수집 소프트웨어를 켜고 소프트웨어를 초기화합니다. 전망 및 해결 분야의 크기를 지정합니다. 그것은 미래의 분석을 쉽게하기 위해 동물 사이에보기 및 픽셀 밀도 분야가 일관성이 유지하는 것이 좋습니다. </li><li> 새 파일을 엽니다. 이미지 데이터를 획득 시작 시작 버튼을 누르십시오. 일반적으로, 영상기 자동으로 마우스의 거리를 감지하지만, 메시지가 표시되면, 영상기에 동물의 거리를 지정합니다. 레이저 볼 분야의 경계를 표시하고 데이터를 수집하기 시작합니다. </li><li> 인수가 완료되면 이미지가 다리에 혈액 관류의 수준을 나타내는 아르 색상의 범위를 보여주기 시작합니다. 색상은 더 나은 동물 사이의 데이터를 비교하기 위해 특정 재관류 범위로 설정할 수 있습니다. </li><li> 데이터 수집이 완료되면 파일을 저장합니다. </li><li> 그런 다음 복구 케이지에 동물을 반환 정신 때까지 지속적으로 동물을 모니터링합니다. </li><li> 데이터를 분석하려면, 어떤 배경 잡음을 빼야하는 분석 소프트웨어에서 임계값 조정을 사용합니다. 0.2의 임계값은 일반적으로 합리적인 가치입니다. 각 hindlimb 영역을 커버 2의 관심 지역, 또는 로아를 선택합니다. 랜드마크의 다양한 손발과 동물 사이의 투자 수익 (ROI)을 표준화하는 데 사용할 수 있습니다. 그런 다음 투자 수익 (ROI)의 의미 재관류와 다양성을 결정합니다. 허혈성 사지 및 제어 사지 사이의 재관류 차이 및 재관류 비율은 다음을 쉽게 확인할 수 있습니다. </li><li> 이 절차는 시간이 지남에 따라 hindlimb 재관류의 변화에​​ 따라 반복 수 있습니다. 원하는 시점에서, 동물은 조직 기능과 재관류 이미지 데이터에 대한 비교 평가 euthanized 수 있습니다. </li></ol> 3. 대표 결과 : hindlimb vasculature의 해부 그림 1 2에 표시됩니다. 대퇴 동맥 explantation 후 hindlimb의 대표 다이어그램 그림 2에 표시됩니다. 그림 3과 같이 hindlimb에 국소 빈혈의 유도를 확인하려면, 레이저 도플러 재관류 이미지 분석, 제어 사지 비교, 허혈성 사지에 혈액의 흐름에서 극적인 감소를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_26_9/figure1_1035.png" alt="그림 1" width="600" height="406" /> 그림 1. hindlimb의 vasculature의 해부학. 별표 hindlimb 국소 빈혈의 유도에 대한 결합의 위치를​​ 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_7/Niiyama_HLI_Fig2.png" alt="이미지 2" width="600" height="450" /> 그림 2. 대퇴 동맥의 제거 후 근위 및 말초 사이트에있는 대퇴 동맥의 결합 후 hindlimb의 해부를 보여주는 대표 다이어그램. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_8/Niiyama_HLI_Fig3.png" alt="그림 3" width="600" height="256" /> 왼쪽 hindlimb (화살표로 표시)에 국소 빈혈의 유도 전후 혈액 흐름을 보여주는 그림 3. 레이저 도플러 이미지.

<ol><li>Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+non-invasive+tracking+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+for+treatment+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCook%2C+MJ+%22The+anatomy+of+the+laboratory+mouse%22">The anatomy of the laboratory mouse</a>. , Academic Press. New York. (1976).</li>
<li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li>
<li>Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+trait+locus+%28LSq-1%29+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117, 1207-1215 (2008).</li>
</ol>

계획 및 hindlimb 국소 빈혈 모델을 수행하는 동안 고려해야 할 다양성의 일부 소스가 있습니다. 첫째, 국소 빈혈의 수준은 사이드 지점의와 관련하여 결합의 위치에 따라 다를 수 있습니다. 따라서 모델의 일관성을 위해, 동물 동맥 내고 같은 수준을 받아야한다. 허혈성 회복 다양성의 또 다른 원본이 세 동물 (80~10개월 세)보다 빠르고보다 완벽한 복구 속도를 가지고 젊은 동물 (6~8주 세)와 함께, 동물의 연령과 관련이로 hemodynamic (예에 의해 평가 레이저 도플러 재관류) 또는 기능 (예 : 러닝 머신 테스트) 측정합니다. 그룹 사이에 큰 차이가 치료 개입과 함께 관찰 수 있기 때문에 하나 angiogenic 에이전트를 평가되는 연구는, 기존의 동물을 사용하는 것이 바람직있을 수 있습니다. 반대로 하나가 안티 angiogenic 요인을 평가하고있는 연구, 그것은 효과가 크기 3 극대화하기 위해 어린 동물을 사용하는 것이 바람직있을 수 있습니다. 올바르게 수행할 경우, 출혈, 감염, 또는 사망 등과 같은 최소한의 합병증이있을 것입니다. 출혈은 대퇴 정맥 또는 다른 선박, 멸균 면봉과 적당한 압력의 사고로 장애가 발생하면 출혈이 멈출 때까지 작은 주걱이나 거즈가 출혈의 사이트에 적용해야 날붙이. 감염의 징후를 보여주는 동물은 안티 - infective 에이전트로 치료해야합니다. 중요한 진물을 전시 동물 beeuthanized해야 할 수도 있습니다. 이 합병증은 나이가 동물보다 일반적인 있으며, 이러한 BALB C 마우스 4와 같은 몇 가지 변종, 인치 또한, hindlimb의 국소 빈혈 모델은 중간 고통에 온화 발생할 수 있습니다. 통증 치료를 위해 필요한만큼 따라서 같은 buprenorphine 또는 carprofen과 같은 진통제는 IACUC의 권고에 따라 관리되어야합니다. 결론적으로, 우리는 hindlimb 국소 빈혈의 murine 모델 PAD 공부를위한 간단하고 재현성 방법을 증명하고있다. 레이저 도플러 영상 분석 hindlimb의 국소 빈혈 모델은 혈관 pathologies를 공부 및 치료 후보를 평가하기위한 훌륭한 시스템입니다.

<table><tbody><tr><td>수술 도구</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Constix 면봉</td><td>도구</td><td>Contec</td><td>SC-4</td><td></td></tr><tr><td>Betadine (포비돈-요오드)</td><td>시약</td><td>PDI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 알코올</td><td>시약</td><td>Kendall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-0 실크 봉합사</td><td>도구</td><td>Genzyme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-0 vicryl 봉합사</td><td>도구</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전동 면도기</td><td>도구</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전기 소작기</td><td>도구</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Doppler 및 PeriScan PIM 3 시스템</td><td>장비</td><td>Perimed</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hindlimb 국소 빈혈의 murine 모델

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

미국에서는, 말초 동맥 질환 (PAD)는 만 10 개인에 영향을, 또한 세계적으로 유행이다. 증상 완화 의료 치료가 제한됩니다. 수술이나 endovascular 개입 어떤 개인 유용하지만 장기적인 결과는 종종 실망입니다. 그 결과, PAD를 치료하는 새로운 치료법을 개발하기위한 필요가있다. murine hindlimb의 국소 빈혈 준비는 PAD의 모델, 새로운 치료법을 테스트하는 데 유용합니다. 이러한 관상이나 대뇌 동맥 내고 같은 조직 국소 빈혈의 다른 모델에 비해, 대퇴 동맥 내고는 허혈성 조직의 간단한 모델을 제공합니다. 이 모델의 다른 장점은 대퇴 동맥과 낮은 사망률에 대한 접근의 용이성입니다. 이 비디오에서는, 우리는 일방적 hindimb의 국소 빈혈의 murine 모델에 대한 방법론을 보여줍니다. 모델을 생성하고 평가하기위한 구체적인 자료와 절차는 레이저 도플러 영상으로 사지 재관류의 평가를 포함하여 설명한다. 이 프로토콜은 또한 황 외 의해 증명 세포. 1의 이식과 비침습 추적 이용하실 수 있습니다.

일방적 hindlimb의 국소 빈혈의 유도에 대한 수술은 레이저 도플러 재관류 이미징에 의해 국소 빈혈의 확인과 증명합니다.

Hindlimb 국소 빈혈의 Murine 모델

미국에서는 약 1,000만 명이 말초동맥질환(PAD)을 앓고 있으며, 이는 전 세계적으로도 널리 퍼져 있습니다. ...에 대한 약물 요법은

미국에서 말초 동맥 질환(PAD)은 약 1,000만 명에게 영향을 미치며, 특히 흡연자, 당뇨병 환자 및 70세 이상의 고령자에게서 빈번하게 발생합니다. 본 수술의 전반적인 목표는 대퇴 동맥의 근위부와 원위부 분절을 결찰하여 후지 허혈을 유도하는 것입니다. 시술은 마우스의 마취, 제모 및 수술대 위에 배측으로 위치시키는 것으로 시작합니다.그 다음 무릎에서 내측 허벅지 방향으로 피부를 절개하여 하부의 대퇴동맥을 노출시킵니다. 이어서 대퇴동맥을 대퇴정맥으로부터 조심스럽게 분리합니다. 원위부 결찰 부위와 근위부 결찰 부위에 각각 이중 매듭을 만듭니다.그 다음 대퇴동맥 분절을 절제합니다. 절개 부위를 봉합사로 폐쇄하고 동물이 마취에서 회복되도록 합니다. 후지 허혈 유도를 확인하기 위해 마취된 마우스를 앙와위로 배치합니다.그런 다음 레이저 도플러로 양쪽 뒷다리를 스캔합니다. 이후 이미지를 저장하고 관류 상태를 평가합니다. 안녕하세요, 저는 John Cook입니다.저는 스탠퍼드 대학교 심혈관 의학 분과에서 의학 교수로 재직 중입니다. 저희 연구실은 혈관 신생과 혈관 재생에 관심을 두고 연구하고 있습니다. 이번 영상에서는 저의 박사후 연구원인 Nan Wong 박사와 Hir Niyama 박사가 말초 동맥 질환의 중요한 모델이며, 저희 연구실에서 성장 인자와 세포 치료가 혈관 신생에 미치는 영향을 평가하기 위해 자주 사용하는 생쥐 뒷다리 허혈 모델 제작법을 소개해 드릴 것입니다.본 실험실에서는 혈관 재생을 위한 줄기세포 유래 혈관 내피 세포의 효과를 연구하기 위해 이러한 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 수술에 필요한 수술 도구로는 미세 끝 핀셋, 포인트 핀셋, 스프링 가위, 수술용 가위, 니들 홀더 및 리트랙터가 있습니다.시판 제품보다 크기가 작기 때문에 종이클립을 사용하여 리트랙터를 직접 제작합니다. 수술 전 핫비드 멸균기로 이 도구들을 멸균하며, 이번 수술에는 소작 도구와 멸균된 미세 끝 면봉도 필요합니다. 도구 준비가 완료되면, 100% 산소에 1~3% isoflurane이 포함되고 유량이 1 L/min인 마취 유도 챔버에 마우스를 넣습니다.마우스가 외부 자극에 반응하지 않을 때까지 유도 챔버에 둡니다. 그 후 동물을 유도 챔버에서 꺼냅니다. 이어서 동물을 수술 전 테이블 위에 앙와위(supine position)로 눕히고 isoflurane을 지속적으로 공급합니다.전기 면도기를 사용하여 뒷다리의 털을 제거합니다. 제모 크림을 도포하여 털을 완전히 제거합니다. 마우스의 제모가 끝나면 뒷다리를 펴고 테이프로 고정합니다.뒷다리를 고정한 후, 베타딘과 알코올 스크럽을 세 번 번갈아 가며 피부를 닦아냅니다. 미세 핀셋과 수술용 가위를 사용하여, PBS로 적신 끝이 뾰족한 면봉을 이용해 무릎에서 내측 허벅지 방향으로 약 1 cm 길이의 피부 절개를 수행합니다.허벅지 근육 주위의 피하 지방 조직을 부드럽게 털어냅니다. 다음으로, 소작기를 횡방향으로 적용하여 피하 지방 조직을 절개함으로써 하층의 대퇴동맥을 노출시킵니다. 이어서, 리트랙터를 사용하여 상처 부위를 벌려 하지 혈관계를 더 잘 관찰할 수 있도록 합니다.미세 핀셋과 끝이 뾰족한 면봉을 사용하여 막성 대퇴초를 조심스럽게 뚫어 신경혈관다발을 노출시킵니다. 그 다음, 깨끗한 미세 핀셋과 면봉 세트를 사용하여 서혜부 근처의 근위부 위치에서 대퇴동맥을 대퇴정맥 및 신경으로부터 박리하여 분리합니다. 박리가 완료되면 대퇴동맥의 근위단 아래로 7-0 실크 봉합사를 통과시킵니다.이중 매듭을 사용하여 근위부 대퇴동맥을 폐쇄합니다. 두 번째 결찰사와 절단될 중간 분절을 위한 길이를 확보하기 위해, 혈관의 가능한 근위부 상처 부위에 결찰사를 배치합니다. 무릎에 가까운 원위부 위치에서 대퇴동맥을 대퇴정맥으로부터 분리합니다.슬개 동맥 근위부의 대퇴 동맥 원위단 아래로 7-0 봉합사를 통과시킵니다. 이중 매듭을 사용하여 혈관을 폐쇄합니다. 첫 번째 매듭 세트의 바로 근위부에서 두 번째 이중 매듭 세트로 대퇴 동맥 원위부를 폐쇄합니다.이 두 번째 봉합사 세트는 절단 과정 중 동맥을 잡는 데 사용됩니다. 마찬가지로, 고정 목적으로 첫 번째 매듭 세트 바로 원위부에서 두 번째 이중 매듭 세트로 근위측 대퇴 동맥을 폐쇄합니다. 미세 끝 면봉과 스프링 가위를 사용하여 원위부 및 근위부 매듭 사이의 대퇴 동맥 분절을 절단합니다.대퇴정맥 벽을 찌르지 않도록 주의하십시오. 리트랙터를 제거하고 5-0 퀼 봉합사(quil sutures)를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다. 봉합이 완료되면 동물을 회복 케이지로 옮기고 깨어날 때까지 관찰하십시오. 동물이 1시간 동안 회복한 후, 레이저 도플러 혈류 측정(laser doppler blood perfusion)을 진행하십시오.허혈 유도를 확인하는 단계입니다. 레이저 도플러 관류 단계를 시작하려면, 100% 산소에 1~3% isoflurane이 포함된 마취 유도 챔버에 마우스의 유량을 분당 1L로 설정하여 넣습니다. 마우스가 외부 자극에 반응하지 않을 때까지 유도 챔버에 둡니다.그런 다음 동물을 유도 챔버에서 꺼내어 isof fluorine이 지속적으로 흐르는 수술 전 테이블 위에 놓습니다. 그다음 전기 면도기로 뒷다리의 털을 제거하고, 필요한 경우 제모 크림을 사용하여 마무리합니다. 제모 후에는 iso fluorine이 지속적으로 흐르는 상태에서 동물을 37 °C로 가열된 표면 위에 5분 동안 둡니다.5분 후, 동물을 지속적인 isoflurane 흐름이 연결된 녹색 천과 같이 빛 반사가 없는 빛 흡수 표면에 배와 닿게 눕힙니다(supine position). 뒷다리를 폅니다. 다음으로, 레이저 도플러 이미저와 데이터 수집 소프트웨어를 켜고 소프트웨어를 초기화합니다.시야(field of view)의 크기와 해상도를 지정하십시오. 동물 간에 시야와 픽셀 밀도를 일정하게 유지하는 것이 가장 좋습니다. 향후 분석을 용이하게 하기 위해 새 파일을 여십시오.시작 버튼을 눌러 이미지 데이터 획득을 시작합니다. 안내 메시지가 나타나면 이미지 촬영 장치와 동물 사이의 거리를 지정하십시오. 레이저가 시야(field of view)의 경계를 표시한 후 데이터 획득을 시작합니다.데이터 획득이 완료되면, 다리로 유입되는 혈류량 수준을 나타내는 다양한 색상이 이미지에 표시되기 시작합니다. 색상은 특정 혈류량 범위로 설정할 수 있습니다. 데이터 획득이 완료된 후 동물 간의 데이터를 더 잘 비교하려면 파일을 저장한 다음, 동물을 회복 케이지로 옮기고 깨어날 때까지 지속적으로 모니터링하십시오.데이터를 분석하려면 분석 소프트웨어의 임계값 조정을 사용하여 배경 노이즈를 제거하십시오. 일반적으로 0.2의 임계값이 적절합니다. 각 뒷다리 영역을 포함하는 두 개의 관심 영역(ROI)을 선택하십시오.다양한 랜드마크를 사용하여 사지와 동물 간의 ROI를 표준화한 다음, ROI 내의 평균 관류량과 변동성을 결정할 수 있습니다. 그러면 허혈성 사지와 대조군 사지 사이의 관류량 차이 및 관류 비율을 쉽게 결정할 수 있습니다. 이 절차를 반복하여 뒷다리 관류량의 변화를 추적할 수 있습니다.원하는 시점에 도달하면, 조직 기능을 평가하기 위해 동물을 안락사시킬 수 있습니다. 관류 영상 데이터와 비교하여, 대퇴동맥 결찰 후 뒷다리의 대표적인 도식도가 여기에 제시되어 있습니다. 봉합사는 근위 및 원위 결찰 부위의 위치를 나타냅니다.수술을 세심하게 수행하면 출혈이 최소화되며, 1시간 이내에 수술을 완료할 수 있습니다. 다음은 레이저 도플러 관류 영상 분석 결과입니다. 왼쪽 영상은 허혈 유도 전 양쪽 사지의 관류 상태를 보여줍니다.오른쪽 이미지는 양쪽 다리의 혈류량을 보여줍니다. 왼쪽 뒷다리에 허혈 유도를 수행한 후의 모습입니다. 이미지의 색상 강도는 혈류의 양을 나타냅니다.대조군 다리와 비교했을 때, 허혈성 다리는 색상이 매우 적게 나타나며 이는 혈류량이 급격히 감소했음을 시사합니다. 이 데이터를 사용하여 소프트웨어는 허혈성 다리와 대조군 다리의 평균 관류량을 정량화함으로써 관류 차이와 관류 비율을 결정할 수 있습니다. 따라서 이러한 결과는 뒷다리에 허혈이 유도되었음을 확인시켜 줍니다.지금까지 마우스 모델에서 일측성 후지 허혈을 유도하는 방법과 레이저 도플러 혈류 측정법을 통해 허혈 유도를 확인하는 방법을 살펴보았습니다. 레이저 도플러 영상 분석을 이용한 후지 허혈 모델은 혈관 병리를 연구하고 치료 후보 물질을 평가하는 데 매우 우수한 시스템입니다. 이 절차 이후에는 세포 이식 및 비침습적 추적이 가능하며, 이에 대한 내용은 Huang 등이 제작한 다른 JoVE 영상에서 시연되었습니다.이 절차를 수행할 때, 스프링 가위로 대퇴동맥을 절제하는 과정에서 대퇴정맥 벽을 뚫지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 또한, 중증 허혈 모델의 일관성을 위해 실험에 사용되는 모든 동물의 결찰 부위를 동일하게 설정하십시오. 이상입니다.시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

척수 허혈 재관류 손상의 기전 이해의 부족은 고위험 대동맥 연산 다음 마비를 방지하기 위해 상기 부속 장치를 방해했다. 따라서, 동물 모델의 개발이 필수적이다. 이 원고는 쥐 모델에서 흉부 대동맥 폐색 다음 재현 하체 마비를 보여줍니다.

척수 허혈 - 재관류의 생쥐 모델에서 흉부 대동맥 폐색에 의해 재생산 할 하반신 마비

우리는 재현성을 높이기 위해 좌전 하행 동맥 (LAD)에 결찰의 위치에서 더 명확 수 있습니다 마우스 모델에서 심근 경색 (MI)을 시뮬레이션하기 위해 실험 허혈 / 재관류 (I / R) 손상을 유발하는 수술 방법을 소개합니다 마우스에있는 MI 실험.

왼쪽 앞쪽에 내림차순 동맥의 결찰을 통해 심근 허혈 - 재관류 손상의 생쥐 모델

마우스에서 뒷다리 허혈의 외과적 유도는 혈관 신생을 검사하는 데 유용하지만, 현저한 허혈 유발 조직 괴사를 나타내는 특정 근친 마우스 균주에서는 손상됩니다. 점진적인 동맥 폐색의 유도를 통해 이 문제를 회피하기 위해 아메로이드 수축기를 사용하여 아급성 사지 허혈을 유도하는 방법이 설명되어 있습니다.

급성 및 아 급성 쥐 뒷다리 국소 빈혈하는 방법

우리는 실리콘으로 코팅된 봉합사를 사용하여 중대뇌동맥의 폐색에 의해 유도된 뇌졸중의 마우스 모델을 설명합니다. 이 프로토콜은 영구적인 폐색 또는 일시적인 허혈을 유도한 후 재관류를 유도하는 데 적용할 수 있습니다.

경색 지역의 중간 동맥 폐색 기술 및 시각화를 사용하여 마우스의 허혈성 뇌졸중 및 허혈 - 재관류 유도

우리는 고 지 혈 증 및 당뇨병을 가진 토끼에 있는 말 초 허 혈을 유도 하기 위하여 이용 된 외과 절차를 기술 합니다. 이 수술은 환자의 말 초 동맥 질환에서 경험 하는 조건에 대 한 전 임상 모델 역할. 혈관 조 영 법은 또한 관류의 도입 된 허 혈 및 회수의 정도를 측정 하는 수단으로 서 기술 된다.

당뇨병 토끼에서의 뒷 사지의 전 임상 모델

여기에서, 중요한 뒷다리 허혈 실험 모형은 혈관 신생 치료의 효과를 평가하기 위하여 기능적, 적학 및 분자 시험의 건전지에 선행됩니다.

힌들보 리 허 혈의 뮤린 모델에서 치료 혈관 신생 평가

여기서 우리는 마우스에서 좌측 전방 의 관상 동맥의 영구적 인 결찰을 달성하는 방법을 보여주는 외과 적 절차를 설명합니다. 이 모형은 심근 경색의 병리생리학 및 수반되는 생물학 프로세스를 조사하기 위하여 높은 관련성입니다.

왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥의 영구 결찰을 사용하는 뮤린 심근 경색 모델

이 문서는 작은 절개를 가진 마우스에 있는 심각한 허혈을 확립하기 위하여 능률적인 외과 접근을 보여줍니다. 이 방법은 실험실 업그레이드없이 대부분의 연구 그룹에 의해 적용 될 수있다.

ApoE에서 뒷다리 허혈의 변형 된 수술 모델-/- 소형 절개를 사용하여 마우스

여기서는 미세 조작을 통해 좌측 전방 하행 관상동맥의 정밀 결찰에 의해 마우스에서 심근경색 또는 심근 허혈 재관류 손상을 유도할 수 있는 간단하고 재현 가능한 방법을 설명합니다.

마우스의 심근경색 및 심근 허혈-재관류 손상 유도

본 프로토콜은 FVB 마우스에서 뒷다리 괴저(hindlimb gangrene)를 유도하기 위해 대퇴골 동맥 및 정맥 전기응고와 산화질소 합성효소 억제제의 투여를 결합한 말초 동맥 질환의 독특하고 임상적으로 관련된 모델을 기술한다. 심장 내 DiI 관류는 풋패드 혈관 구조의 고해상도, 입체 영상화에 사용됩니다.

Murine Hindlimb Gangrene 모델에서 발판 혈관 구조의 고해상도 입체 이미징

설치류에서 널리 사용되는 장 허혈 재관류 손상(IRI) 수술 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 시술은 상장간막 동맥의 폐색과 혈류의 회복을 포함합니다. 이 모델은 수의학 및 인간 의학 모두에서 장내 IRI의 폐색 원인을 조사하는 연구에 유용합니다.

상장간막 동맥의 폐색을 통한 장 허혈-재관류 손상의 설치류 모델

학습하세요 쥐 후지 동맥 결찰을 통한 일측성 후지 허혈 유도 방법과 레이저 도플러 관류 영상 확인 기법을. 이 모델은 말초동맥질환 및 혈관 재생 연구에 필수적입니다.

Hindlimb 국소 빈혈의 Murine 모델

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