Name: Amperometric 전극 제작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 배우세요 탄소섬유 전극 제작 방법을 통해 카테콜아민 방출을 검출하는 전기생리학 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 신경과학 및 생물공학 연구에 필수적인 단세포 수준 신경전달물질 측정 도구를 제공합니다.

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우리는이 프로토콜은 원래 설계되었습니다 그의 실험실에서, 시카고 대학에서 박사 아론 P. 폭스 감사 및 프로토콜의 발전을 위해 윌리엄 로덴 (세인트 루이스 대학). 우리는 화이트홀 재단과 지원을위한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 감사합니다.

1 부 : 탄소 섬유 준비 <ol><li> 모세관 피펫의 ~ 1.25은 X 길이 길이의 탄소 섬유의 번들 (우리가 7μm 직경을 사용) 잘라요. </li><li> 비등하여 사이징을 제거 ~ 100 용기에 아세톤의 ML 30 분 이상 뜨거운, 끓는 아세톤에 섬유를 추가합니다. </li><li> 따뜻한 아세톤에서 섬유를 제거하고, 신선한 아세톤의 50-100 ML과 깨끗한 비커로 전송할 수 있습니다. </li><li> 오픈 150mm 페트리 접시에있는 번들을 배치하고 airdry 하룻밤에 의해 건조 섬유. </li></ol> 2 부 : 불타는 연마 유리 모세관 튜브 <ol><li> 포셉와 함께 중앙에 튜브를 들고 약 flame.Rotate 튜브에 끝을 노출하여 (우리가 오랫동안 마이크로 혈소판 모세관 튜브, 외경 1.5mm, 내경 1.3mm, 7.5cm 사용) 각각의 모세관 발사 - 폴란드어 3 회 불꽃 동안. </li><li> 튜브를 반전하고 다시 3 번 회전, 불꽃에 반대 끝을 놓으십시오. </li><li> 유리 접시에 불을 광택 튜브를 삽입하고는 탄소 섬유로 가득 준비 때까지 오븐에 전송할 수 있습니다. </li></ol> 파트 3 : 모세관에 탄소 섬유를 스레딩 <ol><li> 마카 외 의해 설명과 유사. (2008)와 Mundroff 및 와이트먼 (2002)는, 필터가있는 진공에 연결된 플라스틱 튜브를 사용하여 유리관에 섬유를 빨아. </li><li> 튜브 섬유 밖의 scalpel.Leave ¼ 인치를 사용하여 섬유를 잘라. </li></ol> 부 4 : 전극 풀러에서 피펫 섬유 이겠지 <ol><li> 전극 풀러 (우리가 Narishige 일본 모델 PP - 830를 사용)에 모세관을 장소와 장소에 모세관를 잡아 손잡이를 조이십시오. </li><li> 두 최적의 풀러 설정에서 설정 내고 실행할 수있는 스위치를 조작. </li><li> 피펫이 절반으로 뽑아되면, 가위를 사용하여 중앙에 노출된 광섬유를 절단하여 두 반쪽을 분리. </li><li> 각 전극 절반을 제거하고 섬유만이 8분의 1 인치는 튜브의 외부 왼쪽되도록 가위로 유리 seal.Trim에게 섬유를 깰 수있는 튀어나온 섬유에서 가져옵니다. </li><li> 반복 섬유 전극 행진 16에 대한 때까지 1-4 단계를 반복합니다. </li></ol> 제 5 부 : 에폭시 - 유리 인감 만들기 <ol><li> 55 세트 뜨거운 접시에 에폭시의 미리 만들어진 나누어지는를 가열 ° C 퓸 후드 6 분. </li><li> 에폭시 테이프를 사용하여 번들로, 랩에게 뽑아 전극 ~ 16 가열되는 동안. </li><li> Epon 수지, 6 분 동안 가열 후, 뜨거운 Epon 수지 (14 %, W / V)에 0.7 g xof MPDA를 추가합니다. 믹스는 병을 소용돌이 치는하여. </li><li> 에폭시 충분한 양의가 모세관 작용을 통해 유리 도움말을 입력합니다 20 초에 대한 뜨거운 에폭시 경화제의 플러스 solution.After에 전극의 묶음을 찍어. </li><li> 슬롯이있는 종이에 번들, 장소의 전극을 취소하고 오븐에서 트레이를 장소는 100로 설정 ° F. </li><li> 최소 48 시간 후, 에폭시와 함께 기입 밟았다 팁을 가지고, 각 전극을 검사 마분지 홀더에 장소를 백업하고 다시 하나 이상의 섬유, etc.After가 없었 해부 microscope.Discard 전극 아래의 각 전극을 검토 oven.Electrodes는 대개 제조 후 약 1 달 동안 좋다에. </li></ol> 파트 6 : 탄소 섬유를 절단 <ol><li> 플레이스 탄소 섬유는 테플론 테이프 유리 슬라이드에 신중 전극. </li><li> 해부 현미경 팁을 시각화. </li><li> 세포에 대한 탄소 섬유의 배치에 대한 평면 깨끗한 표면을 떠날 수있는 탄소 섬유에 걸쳐 수직으로 잘라 깨끗한 메스 블레이드를 사용합니다. </li></ol>

<ol><li>Mundorf, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amperometry+and+cyclic+voltammetry+with+carbon+fiber+microelectrodes+at+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protocols+in+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells.</a> Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).</li>
<li>Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+practices+in+single-cell+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Good practices in single-cell amperometry.</a> Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).</li>
</ol>

이 프로토콜은 amperometric 전극을 생성하고 절단하는 방법을 설명합니다. amperometric 녹음하는 동안, 탄소 섬유 전극은 분비 세포의 표면에 대해 배치됩니다. Exocytotic 활동 catecholamines의 산화 후 전자의 양도로 인한 전기 전류를 나타냅니다 amperometric 스파이크로 관찰됩니다. 연습이 만들고 amperometric 전극을 가공으로 소음이 크게 상용 전극의 많은 이상 향상시킬 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>에폭시 경화제 1,3-phenylene-diamene 플레이크</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P23954-100G04 716AJ</td><td>분주액은 데시케이터에 보관하며 빛에 노출되지 않도록 해야 합니다.</td></tr><tr><td>탄소 섬유</td><td>재료</td><td>Goodfellow</td><td>C005725</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 헤마토크릿 모세관</td><td>재료</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9836768</td><td></td></tr><tr><td>에폭시 수지</td><td>시약</td><td>Miller-Stephenson</td><td>Epon Resin 828</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>전극 풀러</td><td>장비</td><td>Narishige International</td><td>PP-830</td><td>1차 풀링 = 24.8 degrees C; 2차 풀링 = 62.7 degrees C</td></tr><tr><td>오븐</td><td>장비</td><td></td><td></td><td>100 degrees F로 설정.</td></tr><tr><td>가열판</td><td>장비</td><td></td><td></td><td>55 degrees C로 설정</td></tr></tbody></table>

amperometric 전극 제작

Fabrication of Amperometric Electrodes

탄소 섬유 전극 amperometry 측정 단일 세포의 vesicles에서 카테 릴리스의 검출을위한 열쇠입니다. 여기, 우리는 낮은 잡음 (&lt;0.5 PA) 전극을 생성하는 데 필요한 기술을 설명합니다. 기술은 이전의 연구 (1,2)에 의해 출판 설명에서 수정되었습니다. 전극은 탄소 섬유를 준비하고 섬유 대기음하는 필터와 진공을 사용하여 각각의 모세관에 개별적으로 그들을 스레딩에 의해 만들어집니다. 다음, 섬유와 모세관은 미세 뾰족한 끝 두 개의 반쪽 각을 만들고, 전극 풀러에 의해 가져온 것입니다. 전극은 에폭시 - 유리 밀봉을 만드는 경화제와 혼합 뜨거운 액체 에폭시에 담근 수 있습니다. 마지막으로, 전극은 에폭시를 치료하기 위해 오븐에 배치됩니다. 전극주의 처리들은 지속적으로 손상없이되는 것을 보장하기 위해 중요합니다. 이 프로토콜은 단일 세포에서 녹음 amperometric 전극을 조작하고 절단하는 방법을 보여줍니다.

이 프로토콜은 탄소 섬유 전극을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 전극은 이후 탄소 섬유 amperometry와 vesicles에서 카테 릴리스를 감지하는 데 사용됩니다.

Amperometric 전극 제작

탄소 섬유 전극은 암페로메트리 측정을 통해 단일 세포 내 소포에서 방출되는 카테콜아민을 검출하는 데 매우 중요합니다. 본 영상에서는 ...

본 프로토콜에서는 탄소 섬유 전극을 제작하는 방법을 설명합니다. 먼저, 사이징(sizing)을 제거한 탄소 섬유를 유리 모세관에 채웁니다. 그다음, 섬유가 채워진 모세관 어셈블리를 당겨 두 개의 전극으로 분리하고 섬유를 절단합니다.그 다음, 전극들을 에폭시에 담글 수 있도록 배치합니다. 광섬유를 전극 내에 밀봉하기 위해, 광섬유 전극들을 랙에 거치하여 가열로에 보관합니다. 이렇게 준비된 전극들은 이후 탄소 섬유와 압력 측정법을 통해 단일 세포 내 소낭으로부터 방출되는 카테콜아민을 검출하는 데 사용됩니다.성공적인 기록에서는 기록 트레이스 상에 낮은 노이즈와 뚜렷하게 구별되는 상향 스파이크가 나타납니다. 안녕하세요, 저는 세인트루이스 대학교 의과대학 약리학 및 생리학과 Amy Harkins 박사님 연구실의 Carrie Pike입니다. 단일 세포로부터의 카테콜아민 방출을 측정하는 파이로메트리(pyrometry)에 사용할 저노이즈 탄소 섬유 전극을 제작하는 과정을 보여드리겠습니다.전극 제작을 위한 탄소 섬유 준비부터 시작하겠습니다. 먼저, 흄 후드 내에서 탄소 섬유 다발을 모세관 피펫 길이의 약 1.25배 길이로 자릅니다. 용기에 아세톤 약 100 milliliters를 넣고 끓인 후, 끓는 아세톤에 섬유를 30분 이상 넣어 사이징(sizing) 성분을 제거합니다.가열한 acetone에서 섬유를 꺼낸 후, 신선한 acetone 50~100 mL가 담긴 깨끗한 비커로 옮깁니다. 섬유를 다시 한번 알루미늄 호일에 옮기면 후드 밖으로 가지고 나갈 수 있습니다. 섬유 다발을 150 mm 오픈 페트리 접시에 올려놓고 탄소 섬유를 하룻밤 동안 자연 건조하여 말립니다.탄소 섬유가 준비되었으므로, 이제 유리 모세관의 화염 연마(fire polish)를 위한 준비 과정을 진행합니다. 길이는 7.5 cm, 외경은 1.5 mm, 내경은 1.3 mm인 마이크로 헤마토크리트 유리 모세관을 사용하십시오. 튜브의 중앙 부분을 잡고 한쪽 끝을 화염에 노출시킵니다.튜브를 불꽃 속에 둔 상태에서 약 3회 회전시킵니다. 튜브를 뒤집어 반대쪽 끝을 불꽃에 넣고 다시 3회 회전시킵니다. 이제 모세관 튜브의 양쪽 끝 모두 화염 연마(fire polished)되었습니다.화염 연마 튜브를 유리 접시에 담아 오븐으로 옮기고, 탄소 섬유를 채울 준비가 될 때까지 보관하십시오. 모세관 튜브에 탄소 섬유를 넣기 전, 반드시 보호 마스크를 착용하십시오. 그다음 필터가 연결된 진공 플라스틱 튜브를 사용하여 유리 튜브 안으로 섬유를 흡입하십시오.다음으로, 메스를 사용하여 섬유를 절단합니다. 튜브의 양 끝단에서 섬유가 약 1/4인치 정도 남도록 하십시오. 이제 나사산이 있는 탄소 섬유가 피펫 섬유 전극을 당길 수 있는 준비 상태가 되었습니다.모세관을 전극 폴에 넣고 노브를 조여 모세관을 고정합니다. 다음으로, 폴을 최적 설정으로 맞추고 스위치를 조작하여 양극을 작동시킵니다. 피펫이 절반으로 당겨지면, 중앙의 베어 파이버를 절단하여 두 부분으로 분리합니다.가위를 사용하여 각 전극의 절반을 제거하고, 돌출된 섬유를 당겨 유리 씰을 깨뜨립니다. 가위로 섬유를 다듬어 튜브 외부로 섬유가 1/8인치만 남도록 합니다.이 단계를 약 16회 반복하십시오. 전극을 에폭시 유리로 밀봉하기 전에 파이버 전극을 당겨 만듭니다. 먼저, 55 °C로 설정된 핫플레이트 위에서 미리 소분해 둔 에폭시를 6분 동안 가열하십시오. 에폭시가 가열되는 동안 흄 후드 내에서 당겨진 전극 약 16개를 하나로 묶으십시오.에폭시를 6분 동안 가열한 후, 테이프를 사용하여 뜨거운 에폭시에 경화제 0.7 g을 첨가합니다. 바이알을 회전시켜 이를 혼합합니다. 전극 묶음을 뜨거운 에폭시 및 경화제 혼합액에 담급니다.에폭시가 모세관 현상을 통해 유리 팁 내부로 충분히 들어갈 수 있도록, 번들을 각각 약 5초 동안 두 번씩 담급니다. 번들을 풀어서 슬롯이 있는 카드보드 홀더 위에 전극을 배치합니다. 이 트레이를 100 degrees Fahrenheit로 설정된 오븐에 넣습니다.최소 48시간 후에 해부 현미경으로 각 전극을 검사하십시오. 에폭시가 제대로 채워지지 않은 전극은 폐기하십시오. 스매시 팁(smash tip)을 준비하십시오.섬유가 두 개 이상이거나 다른 이유로 사용할 수 없는 경우가 있습니다. 각 전극을 검사한 후, 전극을 다시 카드보드 홀더에 놓고 오븐에 넣으십시오. 전극은 일반적으로 제작 후 약 한 달 동안 사용 가능하며, 세포의 온도 측정(pyrometry)에 사용하기 전에는 탄소 섬유를 절단해야 합니다.탄소 섬유를 절단하려면, 테플론 테이프가 부착된 유리 슬라이드 위에 탄소 섬유 전극을 조심스럽게 놓으십시오. 해부 현미경으로 팁 부분을 관찰하십시오. 다음으로, 깨끗한 메스 날을 사용하여 탄소 섬유를 수직으로 절단하여, 탄소 섬유를 세포에 접촉시킬 때 평평하고 깨끗한 표면이 되도록 합니다.기록 직전에 수행합니다. 충전용 주사기를 사용하여 모세관을 3 M potassium chloride로 채우고, 파이버 반대쪽 끝을 반드시 건조시키십시오. 이는 과량의 염을 제거하기 위함입니다.전극을 전극 홀더의 염화은(silver, silver chloride) 펠릿 위에 놓습니다. 이를 파이로메트리 헤드 스테이지에 전기적으로 연결합니다. 전극이 안정적으로 유지되도록 전극 홀더를 조입니다.전극을 세포 옆에 배치하고 RO 메트릭 이벤트 기록을 진행하십시오. 본 프로토콜에서는 tric 전극을 제작하고 절단하는 방법을 설명합니다. tric 기록 동안 탄소 섬유 전극이 분비 세포의 표면에 배치됩니다.엑소사이토시스(Exocytotic) 활성은 tric spikes로 관찰되며, 이는 카테콜아민의 산화 후 전자 이동으로 인해 발생하는 전기화학적 전류를 나타냅니다. EmPro 메트릭 전극을 제작하고 절단하는 과정을 숙달하면, 시중에서 판매되는 많은 전극보다 노이즈 수준을 크게 개선할 수 있습니다. 방금 이 절차를 수행할 때 파라메트릭 탄소 섬유 전극을 제작하는 방법을 보여드렸습니다.일관성 있고 노이즈가 적은 전극을 제작하기 위해서는 프로토콜의 세부 사항에 세심한 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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