Amperometric 전극 제작

본 프로토콜에서는 탄소 섬유 전극을 제작하는 방법을 설명합니다. 먼저, 사이징(sizing)을 제거한 탄소 섬유를 유리 모세관에 채웁니다. 그다음, 섬유가 채워진 모세관 어셈블리를 당겨 두 개의 전극으로 분리하고 섬유를 절단합니다.

그 다음, 전극들을 에폭시에 담글 수 있도록 배치합니다. 광섬유를 전극 내에 밀봉하기 위해, 광섬유 전극들을 랙에 거치하여 가열로에 보관합니다. 이렇게 준비된 전극들은 이후 탄소 섬유와 압력 측정법을 통해 단일 세포 내 소낭으로부터 방출되는 카테콜아민을 검출하는 데 사용됩니다.

성공적인 기록에서는 기록 트레이스 상에 낮은 노이즈와 뚜렷하게 구별되는 상향 스파이크가 나타납니다. 안녕하세요, 저는 세인트루이스 대학교 의과대학 약리학 및 생리학과 Amy Harkins 박사님 연구실의 Carrie Pike입니다. 단일 세포로부터의 카테콜아민 방출을 측정하는 파이로메트리(pyrometry)에 사용할 저노이즈 탄소 섬유 전극을 제작하는 과정을 보여드리겠습니다.

전극 제작을 위한 탄소 섬유 준비부터 시작하겠습니다. 먼저, 흄 후드 내에서 탄소 섬유 다발을 모세관 피펫 길이의 약 1.25배 길이로 자릅니다. 용기에 아세톤 약 100 milliliters를 넣고 끓인 후, 끓는 아세톤에 섬유를 30분 이상 넣어 사이징(sizing) 성분을 제거합니다.

가열한 acetone에서 섬유를 꺼낸 후, 신선한 acetone 50~100 mL가 담긴 깨끗한 비커로 옮깁니다. 섬유를 다시 한번 알루미늄 호일에 옮기면 후드 밖으로 가지고 나갈 수 있습니다. 섬유 다발을 150 mm 오픈 페트리 접시에 올려놓고 탄소 섬유를 하룻밤 동안 자연 건조하여 말립니다.

탄소 섬유가 준비되었으므로, 이제 유리 모세관의 화염 연마(fire polish)를 위한 준비 과정을 진행합니다. 길이는 7.5 cm, 외경은 1.5 mm, 내경은 1.3 mm인 마이크로 헤마토크리트 유리 모세관을 사용하십시오. 튜브의 중앙 부분을 잡고 한쪽 끝을 화염에 노출시킵니다.

튜브를 불꽃 속에 둔 상태에서 약 3회 회전시킵니다. 튜브를 뒤집어 반대쪽 끝을 불꽃에 넣고 다시 3회 회전시킵니다. 이제 모세관 튜브의 양쪽 끝 모두 화염 연마(fire polished)되었습니다.

화염 연마 튜브를 유리 접시에 담아 오븐으로 옮기고, 탄소 섬유를 채울 준비가 될 때까지 보관하십시오. 모세관 튜브에 탄소 섬유를 넣기 전, 반드시 보호 마스크를 착용하십시오. 그다음 필터가 연결된 진공 플라스틱 튜브를 사용하여 유리 튜브 안으로 섬유를 흡입하십시오.

다음으로, 메스를 사용하여 섬유를 절단합니다. 튜브의 양 끝단에서 섬유가 약 1/4인치 정도 남도록 하십시오. 이제 나사산이 있는 탄소 섬유가 피펫 섬유 전극을 당길 수 있는 준비 상태가 되었습니다.

모세관을 전극 폴에 넣고 노브를 조여 모세관을 고정합니다. 다음으로, 폴을 최적 설정으로 맞추고 스위치를 조작하여 양극을 작동시킵니다. 피펫이 절반으로 당겨지면, 중앙의 베어 파이버를 절단하여 두 부분으로 분리합니다.

가위를 사용하여 각 전극의 절반을 제거하고, 돌출된 섬유를 당겨 유리 씰을 깨뜨립니다. 가위로 섬유를 다듬어 튜브 외부로 섬유가 1/8인치만 남도록 합니다.

이 단계를 약 16회 반복하십시오. 전극을 에폭시 유리로 밀봉하기 전에 파이버 전극을 당겨 만듭니다. 먼저, 55 °C로 설정된 핫플레이트 위에서 미리 소분해 둔 에폭시를 6분 동안 가열하십시오. 에폭시가 가열되는 동안 흄 후드 내에서 당겨진 전극 약 16개를 하나로 묶으십시오.

에폭시를 6분 동안 가열한 후, 테이프를 사용하여 뜨거운 에폭시에 경화제 0.7 g을 첨가합니다. 바이알을 회전시켜 이를 혼합합니다. 전극 묶음을 뜨거운 에폭시 및 경화제 혼합액에 담급니다.

에폭시가 모세관 현상을 통해 유리 팁 내부로 충분히 들어갈 수 있도록, 번들을 각각 약 5초 동안 두 번씩 담급니다. 번들을 풀어서 슬롯이 있는 카드보드 홀더 위에 전극을 배치합니다. 이 트레이를 100 degrees Fahrenheit로 설정된 오븐에 넣습니다.

최소 48시간 후에 해부 현미경으로 각 전극을 검사하십시오. 에폭시가 제대로 채워지지 않은 전극은 폐기하십시오. 스매시 팁(smash tip)을 준비하십시오.

섬유가 두 개 이상이거나 다른 이유로 사용할 수 없는 경우가 있습니다. 각 전극을 검사한 후, 전극을 다시 카드보드 홀더에 놓고 오븐에 넣으십시오. 전극은 일반적으로 제작 후 약 한 달 동안 사용 가능하며, 세포의 온도 측정(pyrometry)에 사용하기 전에는 탄소 섬유를 절단해야 합니다.

탄소 섬유를 절단하려면, 테플론 테이프가 부착된 유리 슬라이드 위에 탄소 섬유 전극을 조심스럽게 놓으십시오. 해부 현미경으로 팁 부분을 관찰하십시오. 다음으로, 깨끗한 메스 날을 사용하여 탄소 섬유를 수직으로 절단하여, 탄소 섬유를 세포에 접촉시킬 때 평평하고 깨끗한 표면이 되도록 합니다.

기록 직전에 수행합니다. 충전용 주사기를 사용하여 모세관을 3 M potassium chloride로 채우고, 파이버 반대쪽 끝을 반드시 건조시키십시오. 이는 과량의 염을 제거하기 위함입니다.

전극을 전극 홀더의 염화은(silver, silver chloride) 펠릿 위에 놓습니다. 이를 파이로메트리 헤드 스테이지에 전기적으로 연결합니다. 전극이 안정적으로 유지되도록 전극 홀더를 조입니다.

전극을 세포 옆에 배치하고 RO 메트릭 이벤트 기록을 진행하십시오. 본 프로토콜에서는 tric 전극을 제작하고 절단하는 방법을 설명합니다. tric 기록 동안 탄소 섬유 전극이 분비 세포의 표면에 배치됩니다.

엑소사이토시스(Exocytotic) 활성은 tric spikes로 관찰되며, 이는 카테콜아민의 산화 후 전자 이동으로 인해 발생하는 전기화학적 전류를 나타냅니다. EmPro 메트릭 전극을 제작하고 절단하는 과정을 숙달하면, 시중에서 판매되는 많은 전극보다 노이즈 수준을 크게 개선할 수 있습니다. 방금 이 절차를 수행할 때 파라메트릭 탄소 섬유 전극을 제작하는 방법을 보여드렸습니다.

일관성 있고 노이즈가 적은 전극을 제작하기 위해서는 프로토콜의 세부 사항에 세심한 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.