6.2: 생물학적 시료의 SEM 이미징

1. 샘플 준비

1. 장갑을 착용하고 샘플을 처리 할 때 오염을 방지하기 위해 예방 조치를 취하십시오.
2. 슬라이드의 샘플이 건조되고 시료에 오염이 없는지 확인하십시오. 이는 SEM이 표면 특성화를 측정하고 이러한 결함으로 인해 신호를 심각하게 방해할 수 있기 때문입니다.
3. 샘플이 표준 유리 슬라이드에 로드되는 경우, 다이아몬드 팁 유리 커터로 슬라이드를 직선으로 채점하여 샘플의 크기를 줄이고 유리가 파손될 때까지 점수가 높은 라인을 부드럽게 밀어냅니다.
4. 시료에 따라 동일한 원소 조성물을 갖지 않는 코팅을 선택하십시오(EDS가 수신한 신호를 방해합니다). 이 데모를 위해 금 팔라듐 코팅이 사용됩니다.
5. 스퍼터 코터를 지시대로 사용하십시오. 장비가 적절한 커버리지를 가진 얇은 코팅을 위해 약 40 s의 샘플을 스퍼터로 보도록하십시오.
6. 전도성 양면 탄소 테이프를 사용하여 샘플을 SEM 스텁에 장착합니다. 이 테이프는 또한 비 전도성 슬라이드에 장착된 경우 샘플을 접지하기 위해 스퍼터처리된 슬라이드의 맨 위로 스테이지에서 배치되어야 합니다. 전도성 실버 페인트의 얇은 층은 또한 단계로 샘플의 전도도를 증가시키는 데 사용할 수 있습니다.
7. 스텁을 무대에 설치하고 측면의 나사를 조입니다.

2. 이미징 절차

1. 스테이지를 챔버에 로드합니다. 문을 닫고 밀봉합니다. 그런 다음 "전송" 버튼을 눌러 로딩 챔버에서 진공으로 의 통로를 엽니다.
2. 전송 버튼이 깜박이는 것을 멈추고 내부 문이 열리면 금속 막대에 나사를 넣고 샘플을 챔버로 밀어 진공 챔버로 샘플을 이동할 수 있습니다.
3. 막대를 풀고 로드를 하중 챔버에 완전히 고정하고 "저장"을 눌러 진공 챔버에서 하중 챔버를 닫습니다. 이제 샘플이 로드되고 나머지 프로세스가 컴퓨터 워크스테이션에서 수행됩니다.
4. 컨트롤러를 사용하여 스테이지 탐색 패널을 열어 시야에 들어올릴 때까지 스테이지를 이동합니다.
5. 작업 거리가 5-10mm가 될 때까지 샘플을 수직으로 이동합니다. z 방향으로 스테이지를 이동할 때 챔버 카메라를 켜서 샘플이 전자 총에 가까이 가지 않도록 하십시오.
6. 여분의 높은 장력(EHT) 빔을 켭니다. 잠시 동안 해제된 경우 열을 열어야 할 수도 있습니다.
7. 검출기 옵션에서 SE2 신호를 선택합니다.
8. 초기 이미징에 대해 약 5kV의 kV 설정을 사용한 다음 20-30kV로 증가하여 백 스캐터 모드를 사용하여 더 많은 신호를 볼 수 있습니다. 샘플이 코팅되지 않은 경우 keV를 낮게 유지하여 이미지에 너무 많은 충전 아티팩트를 방지하고 샘플 손상을 방지하십시오.
9. 명확한 이미지가 없는 경우 구조가 표시될 때까지 초점, 밝기 및 대비 노브를 돌립니다. 이는 구체화를 위한 참조입니다.
10. 이미지가 표시될 때까지 거친 모드에서 포커스 노브를 돌립니다. 그런 다음 최고의 초점을 찾기 위해 미세로 전환합니다.
11. 단계 탐색(z 방향이 아님)과 배율을 사용하여 이미지를 저장할 영역을 찾습니다.
12. 스캔 속도를 줄이고 평균 줄을 켜면 더 나은 이미지를 확보하여 저장을 위해 더 나은 이미지를 얻습니다.
13. 오른쪽 단추를 클릭하고 파일 위치에 저장하여 이미지를 저장합니다.
14. BSD를 삽입하고 스테이지를 샘플이 초점을 맞춘 z 위치로 다시 이동합니다.
15. 더 높은 원자 수를 나타내는 대비 영역을 찾는 동안 8-11 단계를 반복합니다.
16. 완료되면 BSD를 제거합니다.
17. 샘플을 제거할 준비가 되면 "교환"버튼을 누를 수 있습니다.
18. 샘플을 다시 로드 챔버로 이동한 다음 "통풍구"를 "저장"합니다.

주사 전자 현미경 또는 SEM은 종종 나노 규모의 생물학적 물질을 이미지화하는 데 사용됩니다. 빛을 사용하여 샘플을 이미지화하는 광학 현미경은 생물학적 샘플을 비파괴적으로 이미지화하는 데 많이 사용되지만 해상도와 피사계 심도가 제한되어 있으므로 1나노미터까지 더 높은 해상도를 달성하기 위해 SEM이 사용됩니다.

SEM에서 전자 빔은 일련의 콘덴서 렌즈를 통해 집중된 다음 샘플에 부딪힙니다. 빔이 샘플에 부딪히면 표면의 전자가 산란되어 검출기에 의해 측정됩니다.

이 비디오에서는 SEM의 작동 방식에 대해 논의하고, 실험실에서 생물학적 샘플을 이미징하는 방법을 시연하고, 마지막으로 민감한 샘플을 이미징하는 데 사용되는 몇 가지 기술을 소개합니다.

주사 전자 현미경은 필라멘트 음극이 장착된 전자총에 의해 생성되는 고에너지 전자빔을 사용합니다. 생성된 전자는 양극으로 추진된 다음 대물 렌즈에 들어가기 전에 콘덴서 렌즈를 사용하여 초점을 맞춥니다. 대물 렌즈는 샘플에 빔의 초점을 맞추도록 보정되며, 여기서 표면을 가로질러 래스터 스캔됩니다. 샘플의 원자와 전자의 상호 작용은 샘플의 지형, 원소 조성 및 결정도를 연구하는 데 사용됩니다. 입사 전자빔이 표면에 부딪히면 2차 및 후방 산란 전자를 방출합니다. 2차 전자는 표면에 가까운 샘플에서 방출되어 지형 정보를 제공하는 저에너지 전자입니다.

반면에 후방 산란 전자는 입사 빔의 반대 방향으로 반사됩니다. 상호 작용 강도는 원자량이 증가함에 따라 증가하여 사용자가 조성 차이를 구별할 수 있습니다. SEM은 고진공을 사용하기 때문에 SEM으로 생물학적 샘플을 이미징하려면 특별한 고려가 필요하므로 일반적으로 수분 함량이 높은 생물학적 샘플을 먼저 건조해야 합니다. 이는 민감한 샘플, 특히 세포의 구조를 붕괴시킬 수 있습니다. 따라서 세포는 고정제로 처리되고 헹궈진 다음 점점 더 많은 양의 에탄올로 세척되어 천천히 탈수됩니다.

이 시연에 사용된 콜라겐-하이드록시아파타이트 조직 골격과 같은 단단한 생물학적 물질의 경우, 샘플을 고진공 상태에서 며칠에 걸쳐 건조시킵니다.

마지막으로, 일반적인 SEM 이미징에는 전도성 표면이 필요하기 때문에 생물학적 샘플은 이미징 전에 얇은 금속 층으로 스퍼터 코팅되는 경우가 많습니다. SEM의 작동 방식과 이미징을 위해 생물학적 샘플을 준비하는 방법에 대해 논의했으므로 이제 콜라겐-하이드록시아파타이트 조직 골격을 준비하고 이미징하는 방법을 살펴보겠습니다.

먼저 전도성 탄소 테이프를 사용하여 생체 재료 샘플을 SEM 스터브에 장착하고 샘플이 건조하고 표면에 오염이 없는지 확인합니다.

그런 다음 장착된 샘플을 스퍼터 코팅기의 챔버에 놓고 챔버를 펌핑하여 아래로 펌핑한 다음 약 40초 동안 샘플을 스퍼터 코팅하여 적절한 적용 범위를 가진 4-6나노미터 두께의 얇은 금속(이 경우 금) 코팅을 달성합니다. 코팅이 완료되면 샘플을 제거하고 전도성 테이프를 사용하여 스텁을 샘플 상단에 연결하면 이제 전도성 금속으로 코팅됩니다.

마지막으로 SEM 스테이지에 스텁을 장착하고 측면의 나사를 조입니다. 이제 샘플을 SEM으로 이미지화할 준비가 되었습니다. 먼저 스테이지를 SEM 챔버에 로드하고 도어를 밀봉한 다음 전송 버튼을 눌러 로딩 챔버에서 진공으로 가는 통로를 엽니다. 내부 도어가 열리면 금속 막대를 스테이지에 나사로 고정하고 샘플을 진공 챔버로 밀어 넣은 다음 금속 막대의 나사를 풀고 로드 챔버로 완전히 집어넣은 다음 스토어를 눌러 진공 챔버를 닫습니다.

이제 SEM을 사용하여 샘플을 이미지화해 보겠습니다.

먼저 컨트롤러를 사용하여 스테이지를 이동하고 샘플을 시야로 이동한 다음 작동 거리가 5-10mm가 될 때까지 샘플을 수직으로 이동합니다. 전자 빔을 켜고 2차 전자에 대한 검출기를 선택하고 빔을 처음에는 5킬로전자 볼트로 설정한 다음 필요에 따라 최대 20-30킬로전자 볼트까지 증가시킵니다. 이미지가 선명하지 않으면 선명한 이미지가 나타날 때까지 초점, 밝기 및 대비 노브를 돌립니다.

스테이지 탐색과 X 및 Y 방향을 사용하여 샘플에서 새 지점을 찾은 다음 원하는 특징이 보일 때까지 배율을 높입니다. 필요에 따라 초점, 대비 및 밝기를 조정하여 이미지 품질을 개선합니다. 더 나은 이미지를 얻기 위해 스캔 속도를 줄이고 라인 평균을 켠 다음 이미지를 저장해야 할 수도 있습니다.

SEM 이미지는 25미크론 미만의 섬유질 특징을 가진 고도의 3차원 및 다공성 구조를 보여줍니다. 이러한 특징은 광학 현미경을 사용하여 시각화하기 어려운데, 광학 현미경은 피사계 심도가 훨씬 낮기 때문입니다.

SEM을 사용한 생물학적 구조의 이미징과 관련된 많은 문제가 있으며, 여기에는 구조 붕괴 또는 고에너지 전자빔으로 인한 손상이 포함됩니다. 이제 일반적인 SEM 기법이 이러한 유형의 민감한 샘플에 어떻게 적용되는지 살펴보겠습니다. 이러한 어린 식물 조직과 같은 섬세한 생물학적 구조 또는 수분 함량이 높은 구조는 이미징 전에 고정 과정을 통해 처리해야 합니다.

이 꽃 분열 줄기는 즉시 갓 준비된 포르말린/아세트산 고착 용액으로 처리되었습니다. 고정 조직을 에탄올에서 해부하여 메쉬 용기에 넣고 70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올의 에탄올 계열을 통해 탈수했습니다. 마지막으로, 식물 조직을 임계점 건조기를 사용하여 건조시키고 장착한 후 얇은 금속 코팅으로 스퍼터링했습니다.

SEM 이미징 후, 처리되지 않은 구조는 건조 공정에 의해 심하게 손상되고 구조가 상당히 붕괴된 반면, 고정된 구조는 원래 구조를 유지한 것이 분명합니다. 또는 세포 및 기타 수분 함량이 높은 표본을 환경 SEM 또는 ESEM을 사용하여 이미지화할 수 있습니다. ESEM은 기존 SEM과 마찬가지로 샘플 위에 래스터 스캔된 고에너지 전자빔을 사용하지만, 챔버 내에서 기체 환경을 유지하여 습식 또는 코팅되지 않은 샘플의 이미징을 가능하게 합니다.

이것은 두 개의 구멍을 사용하여 전자총이 들어있는 고진공 챔버를 표본 챔버에서 분리하여 수행됩니다. 전자빔은 가스 분자에 의한 산란으로 인해 상당한 손실을 입지만 일반적으로 이미징에 충분히 높은 에너지입니다. 여기에서 세포는 실리콘 칩에서 성장하고, 양자점으로 기능화되고, 글루타르알데히드 고정 프로토콜을 사용하여 고정되었습니다. 세포는 물에서 이미지화되었으며 세포 표면에서 볼 수 있는 개별 양자 점과 함께 세포의 붕괴되지 않은 구조를 보여줍니다.

SEM을 사용한 생체 재료 시각화에 대한 JoVE의 소개를 시청했습니다. 이제 SEM이 어떻게 작동하는지, 생물학적 샘플이 어떻게 준비되고 이미지화되는지, 그리고 민감한 구조에 대한 기술의 몇 가지 응용 분야를 이해해야 합니다.

시청해 주셔서 감사합니다!