면역 조직 화학 및 면역 세포 화학: 광학 현미경을 통한 조직 이미징
1. 면역 세포 화학을위한 세포의 준비
- 24웰 배양판의 우물에 세포 현탁액의 0.5mL을 추가하여 챔버 슬라이드 또는 챔버 커버립에 관심의 종자 세포.
참고: 일부 세포는 폴리 리신으로 처리된 커버립과 같은 처리된 커버립에 성장을 요구할 수 있습니다. 최적의 치료 조건은 사용되는 세포 유형에 따라 사용자가 결정해야합니다. - 플레이트를 가습 된 CO2 인큐베이터에 넣고 세포가 50-70 % 컨할 때까지 37 ° C에서 성장할 수 있도록합니다.
- 세포가 최적의 합류성에 도달하면 각 우물에서 배양 매체를 제거하고 4 % PFA (1X PBS에서 희석)의 0.5 mL로 배양하여 세포를 수정하고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
- 1x PBS 1mL로 고정을 제거하고 우물을 세 번 씻으시면 됩니다.
- 다음으로, 각각 의 0.5mL의 0.1% 트리톤-X-100을 각각 웰에 첨가하여 세포를 충마화하고 실온에서 15분 동안 배양한다.
- 투과화 버퍼를 흡습하고 1X PBS의 1mL로 세 번 우물을 씻으세요.
- 커버립의 세포가 이제 고정되고 투과됩니다. 다음 면역조직화학 예에 대해 입증된 염색 절차로 진행- 조직 섹션 슬라이드에 직접 보다는 오히려 24 웰 플레이트의 우물 내에서 배큐어가 수행되어야 한다는 것을 제외하고는.
2. 스테인닝을 위한 포르말린 고정 파라핀 임베디드 섹션 준비
- 준비된 포르말린 고정, 파라핀 내장 조직 섹션을 가져옵니다.
분리
- 슬라이드를 100% 자일렌에 2회 2회 담가 5분 동안 담가 두십시오.
리하이드레이션
- 슬라이드를 100% 에탄올2번으로 2회 담가 3분 씩 담가.
- 슬라이드를 95% 에탄올로 3분 동안 담가 두십시오.
- 슬라이드를 70% 에탄올로 3분 동안 담가 두십시오.
- 슬라이드를 50% 에탄올에 3분 동안 담가 두십시오.
내인성 페록시다제 활동 차단
- 100mL에서 0.3% H2 O2의 슬라이드를 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 1X PBS로 2회 2회 5분 동안 세척합니다.
항원 회수
- IHC 구연산 버퍼(pH 6)에 슬라이드를 담그고 20분 동안 끓입니다.
- 티슈 슬라이드는 이제 염색할 준비가 되었습니다.
3. 염색을 위한 신선 냉동, OTC 임베디드 섹션 준비
- 5mm의 신선한 절연 조직을 금형에 넣고 섹션이 완전히 덮일 때까지 OCT를 추가하십시오.
- 완전히 얼어 붙을 때까지 조직 블록을 액체 질소에 천천히 담급합니다. 이제 샘플은 최대 1년 동안 -80°C에 저장할 수 있습니다.
- 일단 단면에 대 한 준비, 냉동 된 조직 블록을 극저온으로 전송 하 고 전체 설정 -20°C에 올 수 있도록.
- 저온을 사용하여 5-10 μm 두께의 조직 섹션을 자르고 브러시를 사용하여 IHC 호환 유리 슬라이드에 직접 섹션을 배치합니다.
- 실온에서 밤새 건조 슬라이드를 허용합니다. 슬라이드는 -80°C에 저장할 수도 있습니다.
- 슬라이드를 4% PFA의 250mL로 실온에서 15분 동안 담그고 염색하기 전에 슬라이드를 수정합니다. 최적의 고정 방법은 사용자가 결정해야 합니다.
- 슬라이드를 1X PBS 250mL로 2회 2회 5분 동안 담급다.
- 내인성 과산화제 활성을 차단하기 위해 실온에서 30분 동안 0.3% H2O2의 250mL로 슬라이드를 침수합니다.
- 슬라이드를 1X PBS 250mL로 2회 2회 5분 동안 담급다.
- 이제 슬라이드가 염색할 준비가 되었습니다.
4화 염색
- 장벽 펜을 사용하여 소수성 장벽으로 조직을 동그라미.
블로킹
- 파이펫을 사용하여 100 μL의 블로킹 버퍼(1X PBS로 희석된 말 혈청)를 실온에서 1시간 동안 섹션 위에 놓습니다.
- 파이펫을 사용하여 차단 버퍼를 제거합니다.
1차 항체 배양
- 100 μL 희석 1 차 항체 용액 (마우스 항인간 사이클린 D1 희석 1:100 차단 버퍼)로 둘러싸인 조직을 실온에서 30 분 동안 배양합니다.
- 각 슬라이드에서 1 차 항체를 배출하고 슬라이드를 각각 5 분 동안 1X PBS2 번 세척하십시오.
이차 항체 배양
- 실온에서 30분 동안 희석된 바이오티니컬이차항체(생체개질형 말 항마우스 IgG 희석 1:200)의 100μL로 샘플을 배양한다.
- 단면을 배출하여 이차 항체를 제거하고 각각 5분 동안 1X PBS2번으로 세척합니다.
색상 개발
- HRP를 이용한 시각화: 아비딘-비오틴 복합체(ABC) 시약100μL을 추가하고 실온에서 30분 동안 어둠 속에서 섹션을 배양합니다.
참고: 형광 태그 항체는 또한 적당한 현미경을 사용하여 이용되고 시각화될 수 있습니다. - 슬라이드를 1X PBS로 2회 2회 5분 동안 세척합니다.
- 최대 5분 동안 DAB의 100 μL에서 섹션을 배양하여 슬라이드를 개발합니다.
- 실온에서 5분 동안 증류수(dH2O)를 추가하여 개발을 중단하십시오.
카운터스테인닝(원하는 경우)
- 해리스 헤마톡슬린 솔루션(또는 0.1M 아세테이트(pH 4.2)의 0.5% 메틸 그린에서 10분 간 슬라이드를 잠깐 담가주세요.
- dH2O로 슬라이드를 각각 5분 동안 두 번 세척하여 카운터스테인을 헹구십시오.
탈수
- 슬라이드를 95% 에탄올2번으로 2회 5분 씩 담가두십시오.
- 슬라이드를 100% 에탄올2번으로 2회 담가 5분 동안 담가 두십시오.
- 슬라이드를 100% 자일렌에 2회 2회 담가 5분 동안 담가 두십시오.
- 종이 타월로 슬라이드를 블롯합니다.
마운팅 및 커버슬립 애플리케이션
- 슬라이드에 오가노 리모네 산과 같은 마운팅 미디어를 한 방울 더 하고 섹션 위에 커버슬립을 놓습니다.
현미경 분석
- 분석을 위해 적절한 현미경으로 얼룩진 부분을 관찰하십시오. 여기서 표준 광 현미경은 관찰을 위해 사용되었고, 장착된 디지털 카메라가 이미징에 사용되었다.
출처: 마이클 S. 리1 과 토냐 J. 웹1
1 미생물학 및 면역학학과, 메릴랜드 의과 대학 및 말린과 스튜어트 그린바움 종합 암 센터, 볼티모어, 메릴랜드 21201
면역히스토화학(IHC) 및 면역세포화학(ICC)은 항체를 이용한 특정 항원들의 발현 및 국소화를 시각화하는 데 사용되는 기술이다. IHC의 첫번째 간행된 사용은 알버트 쿤스가 Pneumococcus에 감염된 마우스에서 조직 단면도에 있는 폐렴구균 항원의 존재를 구상하기 위하여 기술을 이용한 1941년에 이었습니다 (1). 이름, 면역 조직 화학, IHC에 사용되는 조직 섹션을 참조하여 항체 및 "히스토-"를 참조하여 뿌리 "면역-"에서 유래된다. 면역 세포화학의 뿌리 "사이토-"는 ICC와 IHC 의 주요 차이점을 강조합니다. IHC는 전체 조직의 섹션을 사용하는 반면, ICC는 조직에서 분리되거나 배양에서 자란 세포를 사용합니다. 사용된 샘플의 차이는 샘플 준비가 기술적으로 IHC와 ICC 간에 다르다는 것을 의미하지만, 그렇지 않으면 ICC와 IHC의 프로토콜은 동일하며 용어가 자주 상호 교환적으로 사용되는 것을 발견할 것입니다.
IHC와 ICC 모두에서, 각각 과산화제 또는 로다민과 같은 화학적 또는 형광 태그를 가진 항체는, 항원에 태그된 항체의 특정 결합을 통해 관심있는 어떤 항원든물의 분포를 시각화하기 위하여 이용된다. IHC의 경우, 조직의 얇은 조각은 염색되기 전에 조직의 구조를 유지하기 위해 슬라이드에 고정되어 전체 조직의 맥락에서 항원의 시각화를 허용한다(도 1). ICC의 경우, 세포는 염색되기 전에 슬라이드에 고르게 분포되어 개별 세포 내에서 항원 분포의 시각화를 허용하지만 특정 조직의 구조 내에는 허용되지 않습니다. 두 프로토콜 간의 유사성으로 인해 이 프로토콜은 IHC에 중점을 두어 IHC와 관련된 샘플 준비의 추가 복잡성을 해결합니다.
그림 1: IHC 프로토콜의 개요입니다. 마우스에서 해부된 파라핀 임베디드 조직을 위한 IHC 프로토콜의 시각적 윤곽선입니다. 이 프로토콜은 생체 분해된 이차 항체 및 스트레파비딘-HRP를 사용하여 항체 결합의 위치를 시각화합니다. 형광 태그 항체와 같은 다른 옵션도 가능합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
IHC를 수행할 때 첫 번째 주요 결정은 염색 과정 전반에 걸쳐 조직의 구조를 유지하기 위해 조직 섹션을 준비하는 방법입니다. 두 가지 주요 선택은 파라핀 임베디드 조직의 포르말린 고정 섹션 또는 냉동 조직의 신선한 부분입니다. 어떤 다운스트림 분석이 수행될지에 따라 사용할 방법에 대한 간단한 대답은 없습니다. 파라핀 임베디드 조직의 포르말린 고정은 일반적으로 IHC 외부의 후속 분석약에 대한 단백질 기능을 보존할 수 있는 신선한 조직을 동결하는 동안 최적의 이미징을 위한 조직 형태를 더 잘 보존하는 것으로 생각됩니다. 또한, 신선한 냉동 조직 섹션은 유전자 발현 분석(2)에 더 적합한 것으로 나타났다. 세 번째 고려 사항은 관심있는 항원용 항체가 고정 또는 냉동 조직 섹션에 적합한지 여부이며, 일부 항체는 특정 유형의 단면에만 최적화되어 있고 다른 사람을 위해 작동하지 않을 수 있기 때문에. 마지막으로, 신선한 냉동 샘플을 -80°C로 유지해야 하고 고정 된 섹션이 실온에서 훨씬 더 오래 보관 할 수 있지만 1 년 이상 지속되지 않을 수 있기 때문에 조직 섹션을 저장하는 데 얼마나 걸리는지 결정해야합니다. 이들은 파라핀 임베디드 조직의 포르말린 고정 섹션 또는 냉동 조직의 신선한 부분을 사용할지 여부를 결정하기위한 주요 고려 사항 중 일부입니다. 궁극적으로, 하나는 충분 한 조직이 있는 경우, 그것은 단지 둘 다의 일부를 가지고 하는 것이 가장 좋을 수 있습니다.
본 실험에서, 우리는 림프종 발달의 자발적인 마우스 모델에서 확대된 비장에서 사이클린 D1 발현이 증가했는지 여부를 결정하기 위해 착수했다. 비장 조직 샘플은 림프종을 가지고 있지 않은 야생 형 마우스, 트랜스 제닉 마우스 또는 자발적으로 림프종을 개발한 형질 전환 마우스로부터 먼저 분리되었습니다. 비장 조직 샘플은 파라포름알데히드에 고정되었고, 파라핀에 내장되어, 절제되고, 마우스 항시클린 D1 1차 항체를 이용하여 염색하고, 말 항마우스 이차 항체를 거쳐 3,3-디아미노벤지딘(DAB)을 사용하여 개발하였다. 그 후 해리스 헤마톡슬린 솔루션에 섹션이 반소된 다음 섹션은 20배 배율로 이미지화되었습니다.
시약
파라핀 임베디드 섹션
- 4% 파라포름알데히드 (PFA)
- 에탄올 (무수성 변성, 조직학 등급 100%, 95%, 80%, 75%, 50%). 이중 증류수(ddH2O)를 사용하여 100% 스톡에서 희석할 수 있습니다.
- 자일렌 (동음이의)
- IHC 호환 유리 슬라이드는 조직 섹션이 전체 절차에 걸쳐 부착 된 상태로 유지되도록합니다. IHC 호환 유리 슬라이드는 특수 코팅을 가지고 있으며 여러 소매 업체에서 쉽게 사용할 수 있습니다. ICC를 수행하는 경우 챔버 슬라이드를 사용합니다. 챔버 슬라이드는 세포가 슬라이드에 부착하고 적절한 합류에 도달 할 때까지 챔버에서 세포를 시드하고 인큐베이터에 배치 할 수 있도록, 챔버를 제거하고 염색은 IHC와 같은 방식으로 진행 할 수 있습니다.
- 파라핀
- 과산화수소 0.3% (H 2 O2)/메탄올:준비하려면 1mL 30% H2O2 ~ 99mL 메탄올을 추가합니다. -20°C에 보관
- 항원 검색 버퍼: IHC 구연산 버퍼 pH 6.0
신선한 냉동 섹션
- 최적의 절삭 온도(10월) 포함 화합물
- 최적의 고정: -20°C로 냉각된 PFA 또는 아세톤 4%
얼룩
- 버퍼 차단: 사용자가 결정해야 합니다. 한 가지 예는 1X PBS로 희석된 말 혈청입니다.
- 희석 된 1 차 항체 : 제조 업체 사양 참조
- 희석 된 바이오티니드 이차 항체 : 제조업체 사양 참조
- 희석 된 아비딘 - 고추냉이 Peroxidase (HRP): 과산화제 시각화에 대해서만. 제조업체 사양을 참조하십시오.
- DAB 또는 다른 호환 기판
- 카운터스테인(선택 사항)
- 에탄올 (무수성 변성, 조직학 등급 100% 및 95%)
- 자일렌 (동음이의)
- 오가노/리모네 산
1. 면역 세포 화학을위한 세포의 준비
- 24웰 배양판의 우물에 세포 현탁액의 0.5mL을 추가하여 챔버 슬라이드 또는 챔버 커버립에 관심의 종자 세포.
참고: 일부 세포는 폴리 리신으로 처리된 커버립과 같은 처리된 커버립에 성장을 요구할 수 있습니다. 최적의 치료 조건은 사용되는 세포 유형에 따라 사용자가 결정해야합니다. - 플레이트를 가습 된 CO2 인큐베이터에 넣고 세포가 50-70 % 컨할 때까지 37 ° C에서 성장할 수 있도록합니다.
- 세포가 최적의 합류성에 도달하면 각 우물에서 배양 매체를 제거하고 4 % PFA (1X PBS에서 희석)의 0.5 mL로 배양하여 세포를 수정하고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
- 1x PBS 1mL로 고정을 제거하고 우물을 세 번 씻으시면 됩니다.
- 다음으로, 각각 의 0.5mL의 0.1% 트리톤-X-100을 각각 웰에 첨가하여 세포를 충마화하고 실온에서 15분 동안 배양한다.
- 투과화 버퍼를 흡습하고 1X PBS의 1mL로 세 번 우물을 씻으세요.
- 커버립의 세포가 이제 고정되고 투과됩니다. 다음 면역조직화학 예에 대해 입증된 염색 절차로 진행- 조직 섹션 슬라이드에 직접 보다는 오히려 24 웰 플레이트의 우물 내에서 배큐어가 수행되어야 한다는 것을 제외하고는.
2. 스테인닝을 위한 포르말린 고정 파라핀 임베디드 섹션 준비
- 준비된 포르말린 고정, 파라핀 내장 조직 섹션을 가져옵니다.
분리
- 슬라이드를 100% 자일렌에 2회 2회 담가 5분 동안 담가 두십시오.
리하이드레이션
- 슬라이드를 100% 에탄올2번으로 2회 담가 3분 씩 담가.
- 슬라이드를 95% 에탄올로 3분 동안 담가 두십시오.
- 슬라이드를 70% 에탄올로 3분 동안 담가 두십시오.
- 슬라이드를 50% 에탄올에 3분 동안 담가 두십시오.
내인성 페록시다제 활동 차단
- 100mL에서 0.3% H2 O2의 슬라이드를 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 1X PBS로 2회 2회 5분 동안 세척합니다.
항원 회수
- IHC 구연산 버퍼(pH 6)에 슬라이드를 담그고 20분 동안 끓입니다.
- 티슈 슬라이드는 이제 염색할 준비가 되었습니다.
3. 염색을 위한 신선 냉동, OTC 임베디드 섹션 준비
- 5mm의 신선한 절연 조직을 금형에 넣고 섹션이 완전히 덮일 때까지 OCT를 추가하십시오.
- 완전히 얼어 붙을 때까지 조직 블록을 액체 질소에 천천히 담급합니다. 이제 샘플은 최대 1년 동안 -80°C에 저장할 수 있습니다.
- 일단 단면에 대 한 준비, 냉동 된 조직 블록을 극저온으로 전송 하 고 전체 설정 -20°C에 올 수 있도록.
- 저온을 사용하여 5-10 μm 두께의 조직 섹션을 자르고 브러시를 사용하여 IHC 호환 유리 슬라이드에 직접 섹션을 배치합니다.
- 실온에서 밤새 건조 슬라이드를 허용합니다. 슬라이드는 -80°C에 저장할 수도 있습니다.
- 슬라이드를 4% PFA의 250mL로 실온에서 15분 동안 담그고 염색하기 전에 슬라이드를 수정합니다. 최적의 고정 방법은 사용자가 결정해야 합니다.
- 슬라이드를 1X PBS 250mL로 2회 2회 5분 동안 담급다.
- 내인성 과산화제 활성을 차단하기 위해 실온에서 30분 동안 0.3% H2O2의 250mL로 슬라이드를 침수합니다.
- 슬라이드를 1X PBS 250mL로 2회 2회 5분 동안 담급다.
- 이제 슬라이드가 염색할 준비가 되었습니다.
4화 염색
- 장벽 펜을 사용하여 소수성 장벽으로 조직을 동그라미.
블로킹
- 파이펫을 사용하여 100 μL의 블로킹 버퍼(1X PBS로 희석된 말 혈청)를 실온에서 1시간 동안 섹션 위에 놓습니다.
- 파이펫을 사용하여 차단 버퍼를 제거합니다.
1차 항체 배양
- 100 μL 희석 1 차 항체 용액 (마우스 항인간 사이클린 D1 희석 1:100 차단 버퍼)로 둘러싸인 조직을 실온에서 30 분 동안 배양합니다.
- 각 슬라이드에서 1 차 항체를 배출하고 슬라이드를 각각 5 분 동안 1X PBS2 번 세척하십시오.
이차 항체 배양
- 실온에서 30분 동안 희석된 바이오티니컬이차항체(생체개질형 말 항마우스 IgG 희석 1:200)의 100μL로 샘플을 배양한다.
- 단면을 배출하여 이차 항체를 제거하고 각각 5분 동안 1X PBS2번으로 세척합니다.
색상 개발
- HRP를 이용한 시각화: 아비딘-비오틴 복합체(ABC) 시약100μL을 추가하고 실온에서 30분 동안 어둠 속에서 섹션을 배양합니다.
참고: 형광 태그 항체는 또한 적당한 현미경을 사용하여 이용되고 시각화될 수 있습니다. - 슬라이드를 1X PBS로 2회 2회 5분 동안 세척합니다.
- 최대 5분 동안 DAB의 100 μL에서 섹션을 배양하여 슬라이드를 개발합니다.
- 실온에서 5분 동안 증류수(dH2O)를 추가하여 개발을 중단하십시오.
카운터스테인닝(원하는 경우)
- 해리스 헤마톡슬린 솔루션(또는 0.1M 아세테이트(pH 4.2)의 0.5% 메틸 그린에서 10분 간 슬라이드를 잠깐 담가주세요.
- dH2O로 슬라이드를 각각 5분 동안 두 번 세척하여 카운터스테인을 헹구십시오.
탈수
- 슬라이드를 95% 에탄올2번으로 2회 5분 씩 담가두십시오.
- 슬라이드를 100% 에탄올2번으로 2회 담가 5분 동안 담가 두십시오.
- 슬라이드를 100% 자일렌에 2회 2회 담가 5분 동안 담가 두십시오.
- 종이 타월로 슬라이드를 블롯합니다.
마운팅 및 커버슬립 애플리케이션
- 슬라이드에 오가노 리모네 산과 같은 마운팅 미디어를 한 방울 더 하고 섹션 위에 커버슬립을 놓습니다.
현미경 분석
- 분석을 위해 적절한 현미경으로 얼룩진 부분을 관찰하십시오. 여기서 표준 광 현미경은 관찰을 위해 사용되었고, 장착된 디지털 카메라가 이미징에 사용되었다.
면역세포화학(Immunocytochemistry)과 면역조직화학(immunohistochemistry)은 각각 배양된 세포와 조직에서 관심 단백질에 대한 염색 방법입니다. 두 관련 기술의 기본 원리는 검출 시스템으로 태그가 지정된 특정 항체를 사용하여 단백질을 식별 및 시각화하고 세포와 조직 내 위치와 상대 수준을 결정하는 것입니다. 두 실험의 프로세스는 샘플 준비로 시작됩니다.
세포의 단백질 또는 항원 위치를 구체적으로 시각화하는 면역세포화학의 경우 세 가지 단계가 포함됩니다. 첫 번째 단계는 도금으로, 일반적으로 배양 플레이트의 웰에서 커버 슬립 또는 슬라이드의 성장 배지에서 세포를 배양하는 것을 수반합니다. 그 다음에는 파라포름알데히드와 같은 침전 또는 가교제를 세포에 첨가하여 단백질의 구조적 무결성을 보존하고 효소 활성으로 인해 단백질이 분해되는 것을 방지하는 고정이 이루어집니다. 마지막 단계는 투과화(perceabilization)로, 세포막이 염색을 위해 투과할 수 있도록 세제를 첨가하는 것입니다.
대응법에서는 면역조직화학, 단백질 또는 항원이 조직에서 시각화되고 시료 준비는 5단계로 이루어집니다. 첫째, 전체 조직이 일반적으로 파라포름알데히드로 고정됩니다. 그런 다음 파라핀 블록에 조직을 삽입한 다음 마이크로톰이라는 기계를 사용하여 이 블록을 절단하여 조직을 슬라이드에 놓을 수 있는 얇은 조각으로 자릅니다. 다음으로, 슬라이드는 탈파라핀화(deparaffinization) 또는 조직 절편 주위에서 파라핀을 제거합니다. 그런 다음 선택적 항원 회수 단계를 수행할 수 있습니다. 이는 열이나 효소를 사용하여 고정 중에 가교된 에피토프의 가면을 벗겨 항체 결합에 사용할 수 있도록 할 수 있습니다. 적절한 검체 전처리 후, 표적 특이적 1차 항체를 세포 또는 조직 검체에 추가합니다. 이 1차 항체는 관심 단백질에 결합해야 합니다. 다음으로, 2차 항체가 추가되어 1차 항체를 검출하고 결합합니다. 이 2차 항체는 HRP라는 효소에 접합되거나 결합할 수 있습니다. 특정 기질인 DAB가 첨가되면 HRP는 이를 불용성 갈색 침전물로 변환합니다. 이 갈색 염색은 표적 단백질의 위치를 표시합니다. 슬라이드는 또한 헤마톡실린(hematoxylin)으로 염색되어 있는데, 이는 핵을 파란색으로 표시하고 세포 내 국소화를 결정하기 위한 공간 기준점을 제공합니다. 그 후, 장착 매체를 슬라이드에 추가한 다음 착색된 샘플을 밀봉하고 보존하기 위해 커버 슬립을 추가합니다. 마지막으로, 슬라이드는 광학 현미경에서 이미지화할 수 있습니다.
이 비디오에서는 도금된 세포와 조직 절편에 대한 시료 전처리 기법을 관찰한 후 조직 절편을 면역 염색하는 방법을 관찰합니다.
먼저, 관심 세포를 커버 슬립에 장착해야 합니다. 이를 위해 조직 배양 후드에서 작업하면서 개별 커버슬립을 24웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 그런 다음 새시를 닫고 자외선을 켜서 커버슬립을 최소 15분 동안 살균합니다. 다음으로 자외선을 끕니다. 10cm 접시에서 관심 세포를 들어 올리려면 배지를 흡인하고 PBS로 잠시 세척한 다음 2분 동안 세포에 트립신을 추가합니다. 그런 다음 플레이트의 측면을 두드려 세포가 분리되었는지 확인하고 배지로 트립신을 중화합니다. 다음으로 0을 추가합니다. 5mL의 세포 현탁액을 각 웰에 넣고 커버슬립을 덮어야 합니다. 플레이트를 가습된 CO2 인큐베이터에 넣고 세포가 섭씨 37도에서 50-70% 합류할 때까지 성장하도록 합니다.
세포가 최적의 포화도에 도달하면 각 웰에서 배양 배지를 흡인하고 에서 배양하여 세포를 고정합니다. 5% 파라포름알데히드 5mL를 실온에서 1X PBS에 20분 동안 희석합니다. 고정제를 제거한 후 각 커버슬립에 1mL의 1X PBS를 추가하여 세포를 헹굽니다. 즉시 PBS를 흡입한 다음 헹굼을 2회 더 반복하여 총 3회 세척합니다.
이제 각 웰에 0.1X PBS에 0.5mL의 0.1% Triton X-100을 첨가하여 세포를 투과화합니다. 접시를 실온에 15분 동안 그대로 두십시오. 투과화 완충액을 흡인하고 각 웰에 1X PBS 1mL를 추가하여 세포를 헹굽니다. 즉시 PBS를 흡입하고 헹굼을 2회 더 반복하여 총 3회 세척합니다. 이제 커버슬립의 세포가 고정되고 투과화되었으므로 다음 면역조직화학 예에 대해 입증된 염색 절차를 진행하지만, 인큐베이션은 조직 단면 슬라이드에서 직접 수행되지 않고 24웰 플레이트의 웰 내에서 수행되어야 합니다.
시작하려면 준비된 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직 절편을 구합니다. 슬라이드를 슬라이드 랙에 넣은 다음 250mL의 100% 자일렌에 완전히 담궈 파라핀을 제거합니다. 슬라이드가 자일렌에서 5분 동안 배양되도록 합니다. 그런 다음 용기에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월로 닦아낸 다음 새 용기에 담긴 새 자일렌 욕조에 5분 더 넣습니다.
다음으로, 100% 에탄올로 시작하는 일련의 등급이 매겨진 에탄올 용액으로 섹션을 3분 동안 재수화합니다. 종이 타월로 슬라이드 랙을 닦아내고 슬라이드를 100% 에탄올이 담긴 새 용기에 3분 더 옮깁니다. 이 세척 과정을 계속하고, 종이 타월로 말리고, 지정된 시간 동안 표시된 에탄올 농도에 따라 슬라이드를 새 수조로 옮깁니다. 최종 에탄올 세척 후 종이 타월로 랙을 닦아내고 내인성 과산화효소 활성을 차단하기 위해 실온에서 30분 동안 100mL의 .3% 과산화수소에 슬라이드를 배양합니다. 250mL의 1X PBS로 슬라이드를 5분 동안 세척합니다. 신선한 1X PBS 용기에 5분 더 세탁을 반복합니다.
다음으로, pH 6.0에서 250mL의 IHC 시트레이트 완충액에 슬라이드를 담그고 20분 동안 끓여서 항원 회수를 수행합니다. 그런 다음 염색 프로토콜로 진행합니다.
IHC에 대한 염색 과정을 시작하려면 소수성 펜으로 섹션을 동그라미로 표시하여 버퍼가 커버해야 하는 최소 영역을 식별합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 블로킹 버퍼(이 실험에서는 1X PBS로 희석된 말 혈청)를 섹션 위에 놓습니다. 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 차단 버퍼를 제거합니다.
다음으로, 1X PBS에서 희석된 990마이크로리터의 말 혈청을 1에 첨가하여 1:100 희석으로 1차 항체와 차단 완충액을 희석합니다. 5 mL Eppendorf tube, 10 microlit의 1차 항체. 각 섹션에 100마이크로리터의 희석된 1차 항체를 추가하고 실온에서 30분 동안 슬라이드를 배양합니다. 타이머가 울리면 각 슬라이드에서 1차 항체를 배출한 후 250mL의 1X PBS로 5분 동안 세척합니다. 신선한 1X PBS를 사용하여 이 세척을 한 번 더 반복합니다.
슬라이드를 1X PBS에서 세척하는 동안 1.5mL 튜브에 995마이크로리터의 차단 버퍼를 첨가한 다음 5마이크로리터의 2차 항체(이 경우 비오틴화된 말 항마우스 IGG)를 추가하여 2차 항체를 1:200 희석으로 희석합니다. 희석된 2차 항체 100마이크로리터를 각 절편에 첨가한 후 실온에서 30분 동안 슬라이드를 배양합니다. 30분 후, 단면에서 2차 항체를 배출하여 제거한 다음 250mL의 1X PBS로 슬라이드를 5분 동안 세척합니다. 신선한 1X PBS를 사용하여 이 세척을 반복합니다.
이제 100마이크로리터의 avidin-biotin 복합 시약을 추가하고 실온에서 30분 동안 어두운 곳에서 절편을 배양합니다. 그런 다음 250mL의 1X PBS에 5분 동안 담가 슬라이드를 세척합니다. 이전 세척 단계와 유사하게 신선한 1X PBS를 사용하여 이 세척을 한 번 더 반복합니다. 다음으로, 최대 5분 동안 100마이크로리터의 DAB에서 섹션을 배양하여 슬라이드를 현상합니다. 절편을 250mL의 증류수에 5분 동안 담궈 현상을 중지합니다.
이제 원하는 경우 슬라이드를 카운터 염색할 수 있습니다. 이렇게하려면 슬라이드를 Harris Hematoxylin 용액 250mL에 잠시 담그십시오. 250mL의 증류수로 슬라이드를 5분 동안 세척하여 카운터 스테인을 헹굽니다. 신선한 증류수를 사용하여 이 세척을 1회 더 반복합니다. 다음으로 섹션을 탈수합니다. 이렇게하려면 먼저 슬라이드를 95 % 에탄올에서 5 분 동안 배양합니다. 종이 타월로 슬라이드를 닦고 신선한 95% 에탄올이 담긴 새 용기에 5분 더 옮깁니다. 세척하고, 종이 타월로 닦고, 표시된 용액에 따라 슬라이드를 새 수조로 옮기는 과정을 각각 5분 동안 계속합니다.
최종 배양 후 종이 타월로 슬라이드를 닦은 다음 Organo-Limonene Mount와 같은 장착 매체 한 방울을 슬라이드에 추가합니다. 이제 기포가 갇히지 않도록 주의하면서 섹션 위에 커버슬립을 놓습니다. 이제 분석을 위해 현미경으로 슬라이드를 관찰할 준비가 되었습니다.
얼룩진 부분을 관찰하려면 표준 광학 현미경을 사용하여 얼룩을 시각화하고 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 캡처합니다. IHC의 이 특별한 보기에서는, 림프종에 있는 Dyclin D1 표정 공부를 위해 야생형 및 자발적, 이중 형질전환 또는 DTG 쥐의 비장 조직을 비교합니다. 조직은 파라핀 매립, 절편 및 항사이클린 D1 항체로 염색하고 20X 배율로 이미지화했습니다. Cyclin D1 발현 세포는 파란색 조직 배경에 대해 적갈색으로 표시됩니다. 다양한 마우스의 이미지 중 염색 강도를 비교하면 비확대된 비장은 마우스 유전자형에 관계없이 상대적으로 적은 양의 Cyclin D1 발현을 갖습니다. 대조적으로, DTG 마우스의 확대된 비장은 적갈색 염색이 증가하여 이 마우스 모델에서 암 발생과 Cyclin D1 발현 사이의 상관관계를 나타냅니다.
IHC와 ICC는 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 예를 들어, IHC의 한 가지 사용은 종양 발달의 자발적인 마우스 모델에서 종양 발생의 발현을 검사하는 것입니다. 도 2에서,우리는 림프종 발달의 자발적인 마우스 모델에서 확대된 비장에서 사이클린 D1 발현이 증가했는지 여부를 결정하기 위해 착수했다. 비장 조직 샘플은 파라포름알데히드에 고정되었고, 파라핀에 내장되어, 단면화되고, 항시클린 D1 항체(차단 완충제에서 1:200 희석)를 사용하여 염색한 다음, 단면도를 20X 배율로 배양하였다. 세포 D1 발현 세포는 청색 조직 배경에 대하여 적갈색 색으로 표시됩니다. 이러한 결과는 사이클린 D1 발현이 확대된 비장에서 증가하여 이 모델에서 암 발달과 사이클린 D1 발현 사이의 상관관계를 나타내는 것으로 내다볼 수 있다.
면역히스토화학(IHC) 및 면역세포화학(ICC)은 항체를 이용한 특정 항원들의 발현 및 국소화를 시각화하는 데 사용되는 기술이다. 조직은 조직 형태를 유지하고 슬라이드에 배치 얇은 섹션으로 먼저 잘라. 항체는 그 때 추가되고 관심있는 항원을 묶고 현미경의 밑에 그(것)들을 시각화할 수 있는 특정 꼬리표를 갖춰줍니다. 따라서, 이러한 기본 개념을 통해 조직 구조의 맥락에서 항원 분포를 시각화하고 연구할 수 있다. 그러나 가장 중요한 개념은 기본이지만 이러한 기술의 복잡성과 유용성을 모두 증가시키는 여러 가지 접근 방식과 변형이 개발되었습니다. 이 논문은 IHC와 ICC의 기본 개념, 이러한 기술을 사용할 때 고려해야 할 주요 결정, 그리고 상세한 단계별 프로토콜을 다루었습니다. IHC와 ICC에 의해 생성 된 이미지는 일반적으로 최종 제품이며, 다른 조건 사이의 얼룩의 양이나 분포의 명백한 차이를 강조하는 것으로 게시 할 수 있습니다.
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Chapters in this video
0:01
Concepts
3:39
Preparation of Cells for Immunocytochemistry
6:20
Preparation of Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Sections for Staining
8:11
Staining
12:11
Results
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