면역 조직 화학 및 면역 세포 화학: 광학 현미경을 통한 조직 이미징

1. 면역 세포 화학을위한 세포의 준비

1. 24웰 배양판의 우물에 세포 현탁액의 0.5mL을 추가하여 챔버 슬라이드 또는 챔버 커버립에 관심의 종자 세포.
   참고: 일부 세포는 폴리 리신으로 처리된 커버립과 같은 처리된 커버립에 성장을 요구할 수 있습니다. 최적의 치료 조건은 사용되는 세포 유형에 따라 사용자가 결정해야합니다.
2. 플레이트를 가습 된 CO₂ 인큐베이터에 넣고 세포가 50-70 % 컨할 때까지 37 ° C에서 성장할 수 있도록합니다.
3. 세포가 최적의 합류성에 도달하면 각 우물에서 배양 매체를 제거하고 4 % PFA (1X PBS에서 희석)의 0.5 mL로 배양하여 세포를 수정하고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
4. 1x PBS 1mL로 고정을 제거하고 우물을 세 번 씻으시면 됩니다.
5. 다음으로, 각각 의 0.5mL의 0.1% 트리톤-X-100을 각각 웰에 첨가하여 세포를 충마화하고 실온에서 15분 동안 배양한다.
6. 투과화 버퍼를 흡습하고 1X PBS의 1mL로 세 번 우물을 씻으세요.
7. 커버립의 세포가 이제 고정되고 투과됩니다. 다음 면역조직화학 예에 대해 입증된 염색 절차로 진행- 조직 섹션 슬라이드에 직접 보다는 오히려 24 웰 플레이트의 우물 내에서 배큐어가 수행되어야 한다는 것을 제외하고는.

2. 스테인닝을 위한 포르말린 고정 파라핀 임베디드 섹션 준비

1. 준비된 포르말린 고정, 파라핀 내장 조직 섹션을 가져옵니다.

분리

2. 슬라이드를 100% 자일렌에 2회 2회 담가 5분 동안 담가 두십시오.

리하이드레이션

3. 슬라이드를 100% 에탄올2번으로 2회 담가 3분 씩 담가.
4. 슬라이드를 95% 에탄올로 3분 동안 담가 두십시오.
5. 슬라이드를 70% 에탄올로 3분 동안 담가 두십시오.
6. 슬라이드를 50% 에탄올에 3분 동안 담가 두십시오.

내인성 페록시다제 활동 차단

7. 100mL에서 0.3% H_{2 O2의} 슬라이드를 실온에서 30분 동안 배양합니다.
8. 슬라이드를 1X PBS로 2회 2회 5분 동안 세척합니다.

항원 회수

9. IHC 구연산 버퍼(pH 6)에 슬라이드를 담그고 20분 동안 끓입니다.
10. 티슈 슬라이드는 이제 염색할 준비가 되었습니다.

3. 염색을 위한 신선 냉동, OTC 임베디드 섹션 준비

1. 5mm의 신선한 절연 조직을 금형에 넣고 섹션이 완전히 덮일 때까지 OCT를 추가하십시오.
2. 완전히 얼어 붙을 때까지 조직 블록을 액체 질소에 천천히 담급합니다. 이제 샘플은 최대 1년 동안 -80°C에 저장할 수 있습니다.
3. 일단 단면에 대 한 준비, 냉동 된 조직 블록을 극저온으로 전송 하 고 전체 설정 -20°C에 올 수 있도록.
4. 저온을 사용하여 5-10 μm 두께의 조직 섹션을 자르고 브러시를 사용하여 IHC 호환 유리 슬라이드에 직접 섹션을 배치합니다.
5. 실온에서 밤새 건조 슬라이드를 허용합니다. 슬라이드는 -80°C에 저장할 수도 있습니다.
6. 슬라이드를 4% PFA의 250mL로 실온에서 15분 동안 담그고 염색하기 전에 슬라이드를 수정합니다. 최적의 고정 방법은 사용자가 결정해야 합니다.
7. 슬라이드를 1X PBS 250mL로 2회 2회 5분 동안 담급다.
8. 내인성 과산화제 활성을 차단하기 위해 실온에서 30분 동안 0.3% H₂O_2의 250mL로 슬라이드를 침수합니다.
9. 슬라이드를 1X PBS 250mL로 2회 2회 5분 동안 담급다.
10. 이제 슬라이드가 염색할 준비가 되었습니다.

4화 염색

1. 장벽 펜을 사용하여 소수성 장벽으로 조직을 동그라미.

블로킹

2. 파이펫을 사용하여 100 μL의 블로킹 버퍼(1X PBS로 희석된 말 혈청)를 실온에서 1시간 동안 섹션 위에 놓습니다.
3. 파이펫을 사용하여 차단 버퍼를 제거합니다.

1차 항체 배양

4. 100 μL 희석 1 차 항체 용액 (마우스 항인간 사이클린 D1 희석 1:100 차단 버퍼)로 둘러싸인 조직을 실온에서 30 분 동안 배양합니다.
5. 각 슬라이드에서 1 차 항체를 배출하고 슬라이드를 각각 5 분 동안 1X PBS2 번 세척하십시오.

이차 항체 배양

6. 실온에서 30분 동안 희석된 바이오티니컬이차항체(생체개질형 말 항마우스 IgG 희석 1:200)의 100μL로 샘플을 배양한다.
7. 단면을 배출하여 이차 항체를 제거하고 각각 5분 동안 1X PBS2번으로 세척합니다.

색상 개발

8. HRP를 이용한 시각화: 아비딘-비오틴 복합체(ABC) 시약100μL을 추가하고 실온에서 30분 동안 어둠 속에서 섹션을 배양합니다.
   참고: 형광 태그 항체는 또한 적당한 현미경을 사용하여 이용되고 시각화될 수 있습니다.
9. 슬라이드를 1X PBS로 2회 2회 5분 동안 세척합니다.
10. 최대 5분 동안 DAB의 100 μL에서 섹션을 배양하여 슬라이드를 개발합니다.
11. 실온에서 5분 동안 증류수(dH₂O)를 추가하여 개발을 중단하십시오.

카운터스테인닝(원하는 경우)

12. 해리스 헤마톡슬린 솔루션(또는 0.1M 아세테이트(pH 4.2)의 0.5% 메틸 그린에서 10분 간 슬라이드를 잠깐 담가주세요.
13. dH₂O로 슬라이드를 각각 5분 동안 두 번 세척하여 카운터스테인을 헹구십시오.

탈수

14. 슬라이드를 95% 에탄올2번으로 2회 5분 씩 담가두십시오.
15. 슬라이드를 100% 에탄올2번으로 2회 담가 5분 동안 담가 두십시오.
16. 슬라이드를 100% 자일렌에 2회 2회 담가 5분 동안 담가 두십시오.
17. 종이 타월로 슬라이드를 블롯합니다.

마운팅 및 커버슬립 애플리케이션

18. 슬라이드에 오가노 리모네 산과 같은 마운팅 미디어를 한 방울 더 하고 섹션 위에 커버슬립을 놓습니다.

현미경 분석

19. 분석을 위해 적절한 현미경으로 얼룩진 부분을 관찰하십시오. 여기서 표준 광 현미경은 관찰을 위해 사용되었고, 장착된 디지털 카메라가 이미징에 사용되었다.