5.7: 면역 형광 현미경 검사법: 파라핀이 내장 된 조직 절편의 면역 형광 염색

1. 셋업

1. 일반적인 염색 프로토콜에는 다음 단계가 포함됩니다.
   1. 일련의 등급에 따라 슬라이드의 조직 섹션을 다시 수화합니다.
   2. 조직에 항체의 비 특이적 결합을 차단하고 배경 형광을 줄이는 데 도움이 되는 차단 버퍼로 조직 섹션을 배양합니다.
   3. 차단 버퍼를 제거하고 1 차 항체에서 섹션을 배양, 이 시간에 항체는 펩티드 표적을 결합합니다.
   4. 1 차적인 항체를 제거하고 세척 완충제에서 광범위하게 섹션을 세척합니다.
   5. 1차 항체에 결합을 허용하기 위해 이차 항체로 섹션을 배양하고, 1차 항체가 플루오로포어로 직접 표지되지 않고 이차 항체가 요구된다.
   6. 슬라이드에서 이차 항체를 세척합니다.
   7. 슬라이드를 장착 미디어에 장착하고 형광 현미경에 시각화하기 전에 건조할 수 있습니다.
2. 슬라이드 홀더(유리 또는 플라스틱), 항아리, 파이펫, PAP 펜, 습한 챔버, 커버 슬립 및 DAPI장착 미디어 등 다음과 같은 항목이 필요합니다.
3. 자일렌은 슬라이드의 재수화에 사용됩니다. 자일렌은 위험하며 장갑과 실험실 코트를 포함한 적절한 PPE와 함께 연기 후드에 사용해야합니다.
4. 버퍼, 솔루션 및 시약용 레시피
   1. 등급에 따라 에탄올
      에탄올 - 160 mL 200 증거 EtOH 및 40mL ddH₂O
      에탄올 - 140mL 200 증거 EtOH 및 60mL ddH₂O
   2. 항원 회수 용액
      10mM 나트륨 구연산염, pH 6.0
   3. 차단 버퍼
      이차 항체가 만들어진 호스트 동물로부터 100 μL 세럼
      900 μL 1X PBS
      참고: 이것은 10 개의 섹션에 대한 볼륨입니다. 필요에 따라 섹션당 약 100μL 버퍼의 체적을 조정합니다.
   4. 워시 버퍼(1X PBS)

2. 프로토콜

1. 자일렌과 에탄올로 재수화
   1. 슬라이드 홀더에 슬라이드를 배치한 다음 슬라이드를 100% 자일렌 이소머 솔루션에 잠수하여 슬라이드가 완전히 솔루션으로 덮여 있는지 확인합니다.
   2. 100% 자일렌 이소마에서 3분 동안 인큐베이션 슬라이드. 총 3개의 개별 인큐베이션을 두 번 반복합니다. 오염을 최소화하기 위해 새로운 솔루션으로 전송하기 전에 종이 타월로 슬라이드 랙을 닦아야 합니다.
      참고: 이러한 인큐베이션은 세 개의 별도 용기에서 수행되는 것이 좋습니다.
   3. 인큐베이트 슬라이드는 100% EtOH에서 2분 동안 슬라이드합니다. 총 3개의 개별 인큐베이션을 두 번 반복합니다.
      참고: 이러한 인큐베이션은 세 개의 별도 용기에서 수행되는 것이 좋습니다.
   4. 인큐베이트 슬라이드는 95% EtOH에서 2분 동안 슬라이드합니다.
   5. 인큐베이트 슬라이드는 80% EtOH에서 2분 동안 슬라이드를 합니다.
   6. 인큐베이트 슬라이드는 70% EtOH에서 2분 동안 슬라이드를 합니다.
   7. 1X PBS에서 5분 동안 인큐베이션 슬라이드를 사용할 수 있습니다.
2. (선택 사항) 1차 항체에 의해 인식되는 에피토프를 마스크를 풀기 위한 항원 회수
   참고 1: 이 절차는 사용되는 항체에 크게 의존하며 항원 회수에 대한 요구 사항을 결정하기 위해 초기 최적화 절차를 수행하는 것이 좋습니다.
   참고 2: 이 절차는 아래에 표시된 F4/80 염색으로 수행되지 않았습니다. 항원 회수에 대한 요구 사항은 각각의 새로운 항체에 최적화되어야 합니다.
   1. 내열 플라스틱 또는 유리 슬라이드 홀더에 슬라이드를 배치하고 랙이 슬라이드로 채워져 열 분포를 보장합니다. 랙의 슬롯보다 샘플수가 적은 경우 빈 슬라이드를 사용할 수 있습니다.
   2. 2L 비커 - 10mL 항원 마스킹 스톡에서 990mL 물에 1000mL의 항원 미마스킹 용액1000mL에 랙을 놓습니다.
   3. 총 20분 동안 높은 전자레인지에 전자레인지를 돌리면 슬라이드가 물로 덮여 있는지 확인합니다.
   4. 비커에서 20 분 동안 슬라이드를 식힙니다.
   5. ddH₂O가 들어 있는 슬라이드 홀더에서 슬라이드 랙을 5분 씩 세척합니다. 매번 신선한 ddH₂O를 사용하여 총 3개의 개별 배큐어에 대해 두 번 반복합니다. 슬라이드는 세척 할 때마다 동일한 슬라이드 홀더로 세척 할 수 있습니다.
   6. 1X PBS에서 5분 동안 인큐베이션 슬라이드를 사용할 수 있습니다.
3. 파프 펜으로 원을 그리는 섹션입니다. 이렇게 하면 조직 섹션을 커버하는 데 필요한 최소한의 버퍼를 사용할 수 있습니다. 조직 섹션이 건조하지 않도록 하십시오.
4. 각 섹션에 차단 버퍼를 추가합니다. 단면을 커버하는 데 필요한 버퍼의 양은 섹션의 크기에 따라 다르지만 25-500 μL범위일 수 있습니다.
   참고: 차단 버퍼의 선택은 사용되는 항체에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 이차 항체가 제기된 숙주 동물로부터의 10% 혈청은 이차 항체의 비특이적 결합을 감소시키는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 정상적인 염소 혈청은 염소에서 이차 항체가 제기된 경우 사용될 수 있다). 차단 버퍼의 최적화는 각 1차 항체에 대해 수행되어야 한다. F4/80을 가진 유방 종양 단면을 염색하기 위하여, PBS에서 10% 정상 염소 혈청의 0.1 ml를 이용하였다.
5. 실온에서 1시간 또는 최대 24시간 동안 가습 챔버에서 버퍼를 차단하는 섹션을 배양합니다. 가습 챔버는 단면이 건조하지 않도록 합니다.
6. 슬라이드에서 차단 버퍼를 제거합니다. 또는 파이펫 끝으로 단면을 만지지 않도록 주의하지만 파이펫을 사용하여 차단 버퍼를 제거할 수 있습니다.
7. 버퍼차단에서 1차 항체를 희석시다.
   참고: 올바른 희석은 각 항체 및 샘플 유형에 대해 결정되어야 합니다. 최적화에는 최적의 염색을 식별하기 위해 일련의 희석을 수행하는 것이 포함됩니다. F4/80을 가진 유방 종양 단면도를 염색하기 위하여는, 조직 단면도는 PBS에 있는 1% 일반적인 염소 혈청에서 0.1 mL 쥐 항F4/80 항체 희석1:100에서 4°C에서 하룻밤 에 배양되었습니다.
8. 각 섹션에 1 차 항체를 추가하고 4 °C에서 최대 16 시간 (하룻밤) 가습 챔버에서 배양하십시오. 1 차 적인 항체 없이 버퍼를 차단에 적어도 하나의 섹션을 두고 대조군 역할을, 이차 항체에 의해 비 특이적 결합을 식별하는 데 도움이 됩니다.
9. 1차 항체 또는 블로킹 버퍼를 단면도에서 빼내고 슬라이드랙에 슬라이드를 배치하고 1배 PBS로 슬라이드 홀더에 배치하여 PBS로 섹션을 세척합니다. 매번 10분 동안 3회 세척합니다.
10. 이차 항체를 희석 1:200 에 차단 버퍼. 희석은 이차 항체에 따라 최적화될 수 있다.
11. 이차 항체를 대조군을 포함한 모든 섹션에 추가하고 빛으로부터 보호되는 가습 챔버에서 1시간 동안 배양한다.
12. 이차 항체를 단면도에서 배출하고, PBS에서 매번 10분 동안 3회 세척한다.
13. 슬라이드에 DAPI가 포함된 장착 용지 2-3 방울을 추가하고 샘플에 커버슬립을 배치합니다. 장착 매체가 신속한 건조형 미디어가 아닌 경우, 누출을 방지하고 시료를 장기적으로 유지하기 위해 용융 파라핀 왁스 또는 손톱 광택으로 슬라이드의 가장자리를 밀봉해야 할 수도 있다.
14. 슬라이드가 어둠 속에서 밤새 건조되도록 하고 형광 현미경을 사용하여 섹션을 이미지화하십시오.

3. 데이터 분석 및 결과

1. 염색된 단면도는 형광 현미경을 사용하여 분석됩니다. 이미지 캡처 및 분석의 구체적인 세부 사항은 현미경의 사양과 분석을 수행하는 데 사용되는 소프트웨어에 따라 달라집니다. 일반적으로 이미지를 단일 색상 이미지로 촬영하고 겹쳐서 여러 색 이미지를 생성할 수 있습니다. 백분율 양성 세포는 긍정적으로 얼룩진 세포의 수를 계산하고 단면 내의 DAPI 염색 세포의 총 수로 나누어 정량화될 수 있다. 유방 종양 섹션의 F4/80 염색의 경우, 소프트웨어 라이카 응용 프로그램 제품군을 사용하여 버전 3.8, 획득 탭 및 이미지 오버레이 획득 모드에서 DAPI 와 RFP가 모두 활성화되었습니다. 노출, 게인 및 감마(DAPI와 RFP의 경우 각각 944.2ms, 1.0x 및 1.08)에 대해 각각 20.0ms, 1.0배, 1.53을 조정했습니다.이 실험마다 다릅니다. 오버레이 획득 버튼은 DAPI 및 RFP 노출의 오버레이 이미지를 만드는 데 사용되었습니다.
2. 아래이미지(그림 1)는대식세포 및 기타 골수성 세포에 대한 항원을 검출하는 F4/80으로 염색된 종양 섹션의 예를 보여 주며. 단면도는 DAPI 함유 마운팅 미디어를 사용하여 장착되었고 핵은 파란색으로 나타났다.

세포 내 단백질의 기능은 주로 세포 내 단백질의 적절한 국소화에 달려 있습니다. 면역형광 현미경 검사는 형광 염료를 사용하여 세포 내부의 단백질을 시각화할 수 있는 방법입니다. 형광 염료는 형광단(fluorophore)으로, 여기(excitation)라는 과정을 통해 특정 파장의 빛 에너지를 흡수한 다음 즉시 방출(emission)이라고 하는 다른 파장에서 에너지를 방출하는 분자입니다.

형광 염료는 표적 특이적 항체에 접합되어 면역염색을 통해 배양된 세포 또는 조직에 도입됩니다. 이 1차 항체가 관심 단백질에 결합하면 단백질이 형광 염료로 표지됩니다. 또는 형광 염료를 1차 항체 대신 2차 항체에 접합할 수 있으며, 2차 항체는 단백질 1차 항체 복합체에 결합하여 표적을 표지할 수 있습니다. 그 후, 형광 표지를 보존하기 위해 시료를 퇴색 방지 장착 매체에 밀봉한 다음 형광 현미경에서 이미징할 준비가 됩니다.

형광 현미경에는 강력한 광원이 장착되어 있습니다. 광선은 먼저 여기 필터를 통과하여 여기 파장의 빛만 통과할 수 있습니다. 그런 다음 여기광은 dichroic mirror 또는 beam splitter라고 하는 특수 미러에 도달하며, 이 미러는 excitation 파장을 대물렌즈를 향해 선택적으로 반사하도록 설계되었습니다. 그런 다음 렌즈는 샘플의 작은 영역에 빛의 초점을 맞춥니다. 샘플에 도달하면 빛은 형광단을 여기시킨 다음 다른 파장으로 빛 에너지를 방출합니다. 이 빛은 대물 렌즈를 통해 이색성 거울로 다시 전달됩니다. 방출 파장은 여기 파장과 다르기 때문에 이색성 거울은 방출광이 통과할 수 있도록 합니다. 그런 다음 방출 필터라고 하는 두 번째 필터를 통과하여 존재할 수 있는 다른 파장의 빛을 제거합니다. 그 후, 광선은 이제 접안렌즈나 카메라에 도달하여 특정 형광단에서 방출된 빛으로 생성된 확대된 이미지를 나타냅니다. 이 이미지는 세포 내에서 관심 단백질의 위치를 나타냅니다.

DNA 결합 형광 염료는 세포 내 참조 지점으로 핵을 라벨링하기 위해 면역 염색과 함께 자주 사용됩니다. 서로 다른 excitation emission 파장을 가진 여러 개의 서로 다른 형광단을 동일한 샘플 내의 다른 단백질에 사용하여 단백질의 국소화를 비교할 수 있습니다.

이 동영상은 조직 샘플에서 관심 단백질을 면역형광 염색한 후 형광 현미경에서 샘플을 이미징하는 절차를 보여줍니다.

염색 과정을 시작하기 전에 포매 과정에서 탈수된 부분을 다시 수화해야 합니다. 이렇게하려면 먼저 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣은 다음 슬라이드를 100 % Xlene 이성질체에 완전히 담그십시오. 슬라이드를 3분 동안 배양합니다. 그런 다음 용기에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월로 여분의 자일렌을 닦아낸 다음 새 용기에 담긴 새 자일렌 욕조에 3분 더 넣습니다. 새 자일렌이 든 새 용기에서 매번 이 배양을 반복하고 새 용기로 옮기기 전에 종이 타월로 슬라이드를 닦아내면 총 3번의 배양을 합니다. 다음으로, 100% 에탄올로 시작하여 2분 동안 일련의 등급이 매겨진 에탄올 용액에서 절편을 배양합니다. 종이 타월로 슬라이드 랙을 닦아내고 슬라이드를 100% 에탄올이 담긴 새 용기에 2분 더 옮깁니다. 세척 과정을 계속하고, 종이 타월로 과도한 에탄올을 닦고, 지정된 시간 동안 표시된 에탄올 농도에 따라 슬라이드를 새 수조로 옮깁니다. 최종 에탄올 세척 후 여분의 용액을 털어내고 1X PBS에서 슬라이드를 5분 동안 배양합니다.

염색 과정을 시작하려면 먼저 PAP 펜으로 절편에 동그라미를 쳐 완충액이 덮어야 하는 최소 영역을 식별합니다. 슬라이드에 섹션이 명확하게 표시되면 각 슬라이드에 100마이크로리터의 차단 버퍼를 추가하여 전체 섹션 표면을 덮도록 합니다. 조직을 차단 버퍼로 덮은 후 슬라이드를 가습실에 놓습니다. 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 배양하도록 둡니다.

원하는 배양 시간에 따라 슬라이드에서 배출하여 차단 버퍼를 제거합니다. 다음으로, 1차 항체를 차단 완충액에 희석합니다. 1:100 희석의 경우 1.5ml 원심분리 튜브에 990마이크로리터의 차단 버퍼를 추가한 다음 동일한 튜브에 1차 항체 10마이크로리터를 추가합니다. 하나의 슬라이드에 대조군으로 레이블을 지정한 다음 100마이크로리터의 차단 버퍼를 추가합니다. 이 대조군은 2차 항체의 비특이적 결합을 식별하는 데 도움이 됩니다. 이제 100마이크로리터의 1차 항체 완충액을 나머지 슬라이드에 추가합니다. 어둠 속에서 섭씨 4도의 가습실에서 밤새 섹션을 배양합니다.

하룻밤 배양 후 챔버에서 절편을 제거하고 각 슬라이드에서 1차 항체를 배출하고 대조군에서 차단 버퍼를 배출합니다. 슬라이드를 슬라이드 랙에 넣은 다음 1X PBS에서 각각 10분씩 세 번 세척합니다. 슬라이드가 1X PBS에서 세척되는 동안 2차 항체를 차단 버퍼로 희석합니다. 1:200 희석의 경우 1.5ml 튜브에 995마이크로리터의 차단 버퍼를 추가한 다음 동일한 튜브에 5마이크로리터의 2차 항체를 추가합니다. 대조군을 포함한 모든 절편에 2차 항체를 추가하고 빛으로부터 보호되는 가습 챔버에서 1시간 동안 배양합니다. 타이머가 울리면 인큐베이터에서 슬라이드를 제거합니다. 섹션에서 2차 항체를 배출합니다. 2차 항체가 제거되면 슬라이드를 슬라이드 랙에 넣은 다음 빛을 차단하여 10분 동안 슬라이드를 1X PBS에 완전히 담그십시오. 각 세탁에 대해 새로운 1X PBS를 사용하여 이 세척을 세 번 반복합니다. 세척 후 각 슬라이드에 DAPI가 포함된 장착 매체 2-3방울을 추가하고 샘플에 유리 커버슬립을 놓습니다. 형광등을 사용하여 단면을 이미징하기 전에 어두운 곳에서 슬라이드를 밤새 건조시킵니다.

이미징 중 이미지 캡처의 세부 사항은 사용 가능한 특정 현미경 및 소프트웨어에 따라 달라집니다. 그러나 이 특정 예에서는 소프트웨어 Leica Application Suite, 버전 3. 도 8은 분석을 수행하는 데 사용됩니다. 이 프로그램을 사용하여 획득 탭을 클릭하고 이미지 오버레이 획득 모드에서 DAPI와 RFP를 모두 활성화합니다. 다음으로, 소프트웨어에서 정의한 기본 설정을 사용하여 초기를 취한 다음 노출 시간과 게인을 수정하여 밝기를 최적화하여 DAPI 및 RFP 모두에 대한 노출, 게인 및 감마를 조정한 다음 샘플의 이미지 채도 및 광표백을 방지하기 위해 최소한의 최적 설정이 바람직하다는 점을 염두에 두고 조정합니다. 감마를 수정하여 이미지의 어두운 영역을 최적화할 수 있습니다.

설정이 조정되면 오버레이 획득 버튼을 눌러 DAPI 및 RFP 노출의 오버레이 이미지를 생성합니다. 시연된 기술을 사용하여 캡처한 이 예시 이미지는 항체 F4/80으로 염색된 마우스 유방 종양 절편을 보여주며, 이 항체는 대식세포 및 기타 골수성 세포에서 빨간색으로 표시된 항원을 검출합니다. DAPI가 함유된 마운팅 미디어(mounting media)가 사용되었기 때문에 핵은 파란색으로 표시됩니다. 이미징 데이터는 조직 섹션 내 단백질의 강도 및 국소화에 관한 정보를 제공합니다.

예를 들어, F4/80으로 염색된 종양의 이미지에서 이 항원의 세포 표면 염색이 관찰됩니다. 이러한 데이터는 또한 조직 섹션 내에서 특정 세포 집단의 빈도에 관한 정보를 제공할 수 있습니다. 이는 여기에 빨간색으로 표시된 양성 염색 세포의 수를 세고, 이를 파란색으로 표시된 총 세포 개체군과 비교하고, 다음 방정식을 사용하여 빈도를 계산하여 정량화할 수 있습니다.