5.12: 세포 사멸 분석: 세포 독성 능력의 크롬 방출 분석

절차 개요

세포 사멸 측정을 위한 일반적인 ^51Cr방출 분석법은 다음 단계를 포함합니다:

1. 먼저, 표적 셀은 Na₂^[51Cr]O_4로표지된다. 이것은 분석기의 이펙터 세포와 구별됩니다.
2. 표적 세포가 라벨링하는 동안, 이펙터 셀이 수집되고, 직렬 희석 기술을 이용하여, 이펙터 세포의 감소적 적정은 라운드 하단 96-tassay 플레이트에서 생성된다.
3. 표적 세포 라벨링의 끝에서, 세포는 먼저 세척되고 그 후 고정된 수의 세포가 이미 일련의 이펙터 세포 희석제를 포함하는 분석 판에 첨가된다.
4. 다음으로, 표적 이펙터 세포 혼합은 표적 세포와 충분한 세포 상호 작용을 허용하고 세포 용액을 중재하기 위해 정의된 기간 동안 배양된다.
5. 마지막으로, 문화 슈퍼 나일체는 수확하고 튜브로 수집됩니다. ⁵¹Cr 양은 감마 카운터를 사용하여 양화됩니다.
6. 결국, 데이터는 수집되어 대상 셀의 "백분율 특정 셀 용해"를 계산하는 데 사용됩니다.

1. ⁵¹Cr로 대상 셀 라벨링

1. 시작하려면, 표적 세포(여기-인간 흑색종 세포주 WM793)를 단일 세포 현탁액으로 준비한다.
2. 이렇게하려면 먼저 조직 배양플라스크에서 미디어를 제거하십시오.
3. 그런 다음, 1X PBS의 5mL로 세포를 씻는다.
4. -2 분 동안 접시에 트립신 1 mL을 추가하여 세포를 트립시인화합니다.
5. 플라스크를 부드럽게 눌러 플라스크 표면에서 세포를 느슨하게 합니다.
6. 플라스크에 RPMI 미디어 5mL을 추가하고 미디어를 위아래로 파이프하여 세포를 분리합니다.
7. 세포 현탁액을 15mL 원칼 튜브로 수집하고 1200 rpm에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상체를 장식합니다.
8. 펠릿에 10mL의 미디어를 추가하고 미디어를 위아래로 부드럽게 파이프하여 세포를 현탁액으로 가져옵니다.
9. 혈종계를 사용하여 세포 농도를 결정합니다.
10. 새로운 15 mL 원문 튜브로 1x10⁶ 세포를 전송합니다.
11. 1200 rpm에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리하고 상체를 데칭합니다.
12. 튜브를 잠시 소용돌이쳐 소량의 중간 체적으로 세포 펠릿을 다시 일시 적으로 돌보냅니다.
13. WM793 대상 셀 서스펜션에 ⁵¹Cr의 100 μCi를 직접 추가합니다.
    참고: 특정 방사능에 대한 전용 실험실 공간이 설정되어야 합니다. 또한 모든 단계에서 ⁵¹Cr을 안전하게 보관하고 사용하기위한 충분한 납 차폐뿐만 아니라 ⁵¹Cr이있는 샘플이 보관되는 위치를 나타내는 적절한 사이니지가 있어야합니다. 팬케이크 프로브가 장착된 가이거 카운터도 필요한데, 오염 가능성을 조사하기 위해.
14. 튜브가 이제 방사능임을 나타내기 위해 작은 방사성 테이프를 튜브에 추가합니다.
15. 튜브를 납 쉴드가 있는 37°C 인큐베이터에 놓고 1시간 동안 배양합니다. 크롬의 표적 세포 섭취량을 증가시키기 위해 15-20 분마다 튜브를 쓸어 넘깁니다.
16. 인큐베이션 기간 후, FBS의 5mL로 대상 세포를 세척하여 초과 ⁵¹Cr을 제거하십시오.
17. 5 분 동안 1200 rpm에서 세포를 원심 분리합니다. 방사능 FBS는 적절한 폐기물 용기로 세척합니다.
18. 펠릿을 다시 중단하고 FBS로 두 번째로 세척하십시오. 가이거 카운터를 사용하여 통합 방사능펠릿을 확인하십시오.
19. 10mL 완전 배지에서 펠릿을 다시 중단하여¹⁰⁵ 셀/mL의 세포 농도를 달성한다.
    참고: ⁵¹Cr 라벨링 후 셀 카운팅 단계는 안전상의 이유로 주로 여기에서 생략됩니다. WM793 세포 농도가 ⁵¹Cr 라벨링 이전과 동일하다고 가정할 수 있다.

2. 이펙터 셀 준비

1. 인간 또는 마우스 T 세포 및 NK 세포와 같은 다양한 이펙터 셀을 사용할 수 있다. 이 예에서, 표준 밀도 그라데이션 원심분리(5x10^6의농도)에 의해 전혈에서 분리된 PBMC가 사용되었다.
2. 시작하려면 96웰의 둥근 바닥 플레이트의 행 하나(여기 행 A, 표 1 참조)의모든 웰에 100 μL의 조직 배양 배지를 추가합니다. 여기서, 이펙터 세포가 첨가되지 않으며, 대상 세포로부터 "최소/자발적 ⁵¹Cr 방출"을 결정하기 위한 '공백'으로 작용할 것이다.

표 1: ⁵¹Cr 방출 분석 레이아웃: 행 A-대상 셀(104셀/100 μL)은 미디어만으로 배양됩니다("최소/자발적 ⁵¹Cr 릴리스"를 결정하기 위한 '공백'을 생성합니다). 다른 이펙터를 포함하는 행 B - C- 우물 : 대상 셀 (E:T) 비율, 50:1에서 1.5:1에 이르기까지. 행 H-표적 셀(104셀/100 μL)은 1% NP-40(NP-40은 표적 세포를 lyses하여 "최대 또는 총 ^51Cr방출")을 생성한다. 모든 E:T 비율은 모든 실험 조건에 대해 삼중에서 테스트됩니다. 열 1-3- 자극되지 않은 PBMC 및 열 4-6- CpG 자극 PBMC.

3. 다음으로, PBMC의 2X 직렬 셀 희석(각 실험 조건에 대한 삼중분리)을 생성하여 5x10^내지 15,625세포/100 μL에 이르는 이펙터 세포 농도를 얻습니다(여기 행 B내지 G).
   참고: 이 예에서 시작 효과자: 대상 셀(E: T) 비율은 50:1입니다. 그러나, 이 비율은 실험적인 세부사항에 따라 조정될 수 있다.
4. 이러한 웰에 이펙터 셀을 추가하지 않음으로써 마지막 행(여기 행 H)을 비워 둡니다. 이 행은 "총 카운트/분, 또는 (c.p.m) 또는 "최대 ⁵¹Cr 릴리스"를 생성하는 데 사용됩니다.
5. 대상 셀을 추가할 준비가 될 때까지 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣습니다.

3. 분석지에 ⁵¹Cr 라벨 WM793 대상 셀 추가

1. 인큐베이션 기간 이후에는 인큐베이터에서 표적 세포를 제거하고 5mL의 FBS로 세척하여 초과 ⁵¹Cr을 제거합니다.
2. 지정된 원심분리기를 사용하여 5분 동안 1200 rpm에서 세포를 원심분리합니다.
3. FBS 세척(방사성 상수)을 적절한 폐기물 용기에 제거합니다.
4. FBS의 신선한 5mL에서 펠릿을 다시 중단하여 세척 단계를 반복합니다.
5. 원심 분리는 5 분 동안 1200 rpm에서 세포를 다시 분리합니다.
6. 마지막으로, 완전한 매체의 10 mL에서 펠릿을 다시 중단합니다.
7. ⁵¹Cr 라벨WM793 셀 서스펜션(10⁵ 셀/mL)을 일회용 시약 저장소에 붓습니다.
8. 그런 다음, 다중 채널 파이펫을 사용하여, 96 웰 이펙터 세포 판의 각 웰에, 이러한 표지 대상 셀의 100 μL을 추가합니다.
9. 다음으로, 1% NP-40(물)의 100 μL을 이펙터 세포가 없는 우물행에 추가합니다(여기 행 H). 1% NP-40은 표적 셀을 lyse 것이며, 따라서 이러한 우물은 "총 카운트/분, 또는 (c. p.m) 또는 최대 ⁵¹Cr 방출을 결정하는 컨트롤 역할을 합니다.
10. 플레이트의 양쪽에 작은 가스 투과 성 테이프를 추가하여 플레이트에 뚜껑을 고정하고 ⁵¹Cr이 포함되어 있음을 나타내기 위해 뚜껑에 방사성 테이프 조각을 배치합니다.
11. 간단히, 원심 분리판에서 1200 rpm. 하나의 실험 플레이트만 사용 중인 경우 원심분리기에 밸런스 플레이트를 추가합니다.
    참고: 방사성 샘플을 처리하기 위해 표시된 원심분리기를 사용하는 것이 중요합니다.
12. 원심분리기에서 접시를 제거합니다.
13. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 작은 납 차폐물로 배치하여 추가 안전을 위해 플레이트 위에 차폐합니다. 대상 세포 용해를 허용하기 위해 16 h에 대한 인큐베이션.
    참고: 잠복기는 사용된 이펙터 세포 및 사용된 살인의 잠재적인 기계장치에 따라 4에서 18h까지 다양할 수 있습니다.

4. 수퍼네티츠 수확

1. 인큐베이션 기간이 끝나면 플레이트 가장자리 주변의 테이프를 조심스럽게 제거하고 뚜껑을 제거합니다.
2. 다음으로, 각 면 플러그에 대해 작은 필터 디스크가 제자리에 있는지 확인하여 접시에 수확 프레임을 배치합니다. 이렇게 하면 셀 프리 상수의 수집이 보장됩니다.
3. 이제 면 플러그를 우물에 천천히 부드럽게 누릅니다.
4. 약 10초 후에 면 플러그의 압력을 해제한 다음 면 플러그를 튜브 스트립으로 옮습니다.
5. 이러한 각 튜브를 보조 FACS 튜브에 넣습니다.
6. 마지막으로, FACS 튜브를 감마 카운터에 로드하고 샘플을 실행하여 각 조건에서 방출되는 ⁵¹Cr의 양을 양량화합니다. 샘플은 일반적으로 1분 동안 측정되므로 "카운트/분"을 쉽게 측정할 수 있습니다.
7. 조심스럽게 튜브가 카운터에 로드된 순서를 기록합니다.

5. 데이터 분석

1. 여기서, 자극받지 않은 PBMC는 처음 3개의 열에 추가되었고, CpG 자극 된 PBMC (CpG ODN, (1 μg/mL)를 24 시간 동안 열4-6에 첨가하였다. 표 2를 참조하십시오.

표 2: ⁵¹Cr 릴리스 분석 데이터: '분당 카운트' / 'c. p.m' 데이터 값, 평균 c. p. p.m 값, 계산퍼센트 별 리시스 값.

2. 수집된 데이터(분당 카운트, 즉 .c.p.m)는 샘플이 원래 플레이트에 배치된 것과 동일한 방식으로 스프레드시트의 셀에 입력하였다.
3. 첫째, 삼중기의 평균이 계산되었습니다. 표 2 - C3에서 P3까지, 자극되지 않은 PBMC 및 세포 I6 ~P6, CpG 자극 된 PBMC용.
4. 평균이 결정되면 각 조건에 대한 특정 용해의 백분율은 다음 수식을 사용하여 계산되었습니다.
   
   
5. 특정 용해의 백분율은 각 조건에 대해 계산되었다 (표 2 - 세포 J4 O4, 자극되지 않은 PBMC및 O7에 대한, 자극되지 않은 PBMC에 대한).

이 비디오에서는 크롬 방출 분석을 수행하고 효과기 세포의 세포 독성 가능성을 측정하는 방법을 관찰합니다.

면역 세포는 면역 반응의 필수적인 부분인 암이나 바이러스에 감염된 세포와 같이 잠재적으로 해로운 세포를 신체에서 식별하고 제거하는 역할을 합니다. T세포 및 NK 세포와 같은 여러 면역 세포는 표적 세포를 식별하고 해당 표적 세포의 단백질 분해, 용해 및 사멸을 유도하는 단백질을 분비하는 능력인 세포 독성 전위(cytotoxic potential)로 알려진 특성을 가지고 있습니다. 세포독성 전위를 정량화하는 것은 면역 세포 활성화 및 효능을 측정하는 데 중요하며, 크롬 방출 분석은 이러한 목적으로 일반적으로 사용됩니다.

이 방법을 통해 사용자는 다양한 조건에서 특정 유형의 면역 세포에 의해 유발된 cytoxicity를 비교할 수 있으며, 이는 암 면역 요법 및 면역 관련 질병을 연구하는 데 유용합니다. 우선, 암세포와 같은 표적 세포는 세포가 흡수하는 방사성 동위원소인 크롬 51로 배양됩니다. 다음으로, 이러한 무선 표지된 세포는 두 세포 유형 간의 상호 작용을 촉진하기 위해 둥근 바닥, 96웰 플레이트에서 효과기 세포라고도 하는 분리된 면역 세포와 공동 배양됩니다.

분석의 전반적인 설정에는 적절한 대조군과 함께 면역 세포의 농도가 다른 특정 수의 표적 세포를 배양하는 것이 포함됩니다. 공동 배양을 통해 effector 세포가 표적 세포에서 세포사멸 및 용해를 유도할 수 있으며, 그 결과 세포 내 크롬 51이 상층액으로 방출됩니다. 그런 다음 사전 최적화된 시점에 방출된 크롬을 포함하는 상등액이 모든 웰에서 수확됩니다. 방사성을 띤 크롬 51은 자발적으로 방사성 붕괴를 겪어 감마선을 방출합니다. 분석 플레이트에 있는 모든 웰의 상등액에서 나온 감마선 수치는 표적 세포의 용해에 대한 정량화 가능한 출력을 나타냅니다. 이는 감마 계수기를 사용하여 측정한 다음 면역 세포의 세포 독성 가능성을 결정하는 데 사용됩니다.

먼저, 표적 세포인 이 예시의 인간 흑색종 세포주 WM793을 단일 세포 현탁액으로 준비합니다. 이를 위해 먼저 조직 배양 플라스크에서 배지를 제거하고 5ml의 1X PBS로 세포를 세척합니다. PBS를 디캔팅한 다음 약 2분 동안 플레이트에 트립신 1ml를 추가합니다. 플라스크를 부드럽게 두드려 플라스크 표면에서 세포를 느슨하게 한 다음 플라스크에 5ml의 RPMI 매체를 추가합니다. 배지를 위아래로 피펫팅하여 세포를 수집하고 이 현탁액을 15ml 원추형 튜브에 추가합니다.

튜브를 1200RPM으로 5분 동안 원심분리기에 놓습니다. 다음으로, 세포 펠릿을 방해하지 않도록 튜브에서 매체를 제거합니다. 튜브 바닥을 부드럽게 튕겨 세포 펠릿을 파괴하고 튜브에 10ml의 배지를 추가합니다. 그런 다음 배지를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 현탁액으로 만듭니다. 다음으로, 혈구계를 사용하여 세포 농도를 측정하고 원래 세포 현탁액 2ml를 새로운 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 튜브를 원심분리기에 넣고 5분 동안 1200RPM으로 셀을 펠릿화합니다. 원심분리 후 튜브의 여분의 매체를 폐기물 용기에 붓습니다. 튜브를 잠시 와류로 돌려 세포 펠릿을 남겨진 소량의 배지에 재현탁시킵니다.

다음으로, 이 특정 방사능 전용 실험실 공간으로 이동하여 Chromium 51을 사용할 준비를 합니다. 모든 단계에서 Chromium 51의 안전한 보관 및 사용을 위한 충분한 납 차폐가 있어야 하며, Chromium 51이 함유된 샘플이 보관되는 위치를 나타내는 적절한 표지판이 있어야 합니다. 팬케이크 프로브가 장착된 가이거 계수기도 오염 가능성이 있는 공간에서 사용하기 위해 필요합니다.

방사능의 적절한 사용을 위해 설정되면 Chromium 51 100마이크로큐리를 표적 세포 현탁액에 직접 첨가합니다. 그런 다음 튜브에 작은 방사성 테이프 조각을 추가하여 샘플과 튜브가 이제 방사성임을 나타냅니다. 납 보호막이 있는 섭씨 37도의 인큐베이터에 튜브를 놓고 15-20분마다 튜브를 튕기면서 한 시간 동안 배양합니다.

타겟 세포가 라벨링되는 동안 effector 세포의 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 이 예에서 인간 말초 혈액 단핵 세포(PDMC)는 표준 밀도 구배 원심분리를 통해 전혈에서 5 곱하기 10에서 6까지의 농도로 분리되었습니다. 이 effector cell suspension을 일회용 시약 저장소로 옮긴 다음 이 현탁액 200μl를 96well 둥근 바닥 플레이트에 있는 B열의 각 well에 추가합니다. 다음으로, 플레이트의 C열에서 G행까지의 각 웰에 100마이크로리터의 RPMI를 추가합니다.

이제 먼저 B행의 웰에서 100마이크로리터의 세포를 제거하고 이를 C행에 추가하여 다양한 효과기 세포 수를 갖도록 PBMC의 연속 희석을 시작합니다. 그런 다음, 100마이크로리터의 세포를 C행에서 D행으로 이동시켜 효과기 세포를 추가로 희석합니다. 연속 희석을 계속합니다. G 행에 도달하면 우물에서 100 마이크로 리터를 이동하여 해당 행의 각 우물에 100 마이크로 리터의 최종 부피를 남겨 둡니다. 다음으로, 100마이크로리터의 조직 배양 배지를 A열의 웰에 추가하여 이 열에 effector 세포를 추가해서는 안 되므로 표적 세포에서 Chromium 51의 자연 방출에 대한 제어 역할을 합니다. 그런 다음 타겟 세포를 추가할 준비가 될 때까지 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다.

배양 기간이 끝나면 인큐베이터에서 표적 세포를 제거하고 FBS 5ml로 세척하여 과도한 Chromium 51을 제거합니다. 그런 다음 튜브를 지정된 원심분리기에 넣고 1200rpm으로 5분 동안 회전합니다. 방사성 FBS 세척제를 적절한 폐기물 용기에 넣고 펠릿을 5ml의 새 FBS에 재현탁하여 세척 단계를 반복합니다. 튜브를 지정된 원심분리기에 넣고 1200rpm에서 5분 동안 셀을 다시 회전시킵니다. 두 번째 세척을 제거하고 가이거 계수기를 사용하여 펠릿에 방사능이 포함되어 있는지 확인합니다. 마지막으로, 펠릿을 10ml의 완전한 배지에 재현탁하고 Chromium 51 라벨이 붙은 표적 세포 현탁액을 일회용 시약 저장소에 붓습니다. 그런 다음 100마이크로리터의 라벨링된 표적 세포를 96웰 효과기 세포 플레이트의 모든 웰에 추가합니다. 다음으로, 물 중 100마이크로리터의 1% NP-40을 H 열의 우물에 추가하여 각 행의 모든 대상 세포를 용해합니다. 이 웰은 분당 총 개수 또는 cpm을 결정하기 위한 제어로 사용됩니다.

이제 접시가 준비되었으므로 접시의 양쪽에 작은 테이프 조각을 추가하여 뚜껑을 고정하고 뚜껑에 방사성 테이프를 붙여 크롬 51이 포함되어 있음을 나타냅니다. 그런 다음 방사성 샘플을 처리하도록 표시된 원심분리기에 플레이트를 놓습니다. 실험용 플레이트를 하나만 사용하는 경우 원심분리기에 밸런스 플레이트를 추가합니다. 원심분리기를 1200rpm으로 설정하고 플레이트의 속도를 높입니다. 속도에 도달하면 기계를 멈춥니다. 원심분리기에서 플레이트를 제거합니다. 그런 다음 추가 안전을 위해 플레이트 위에 작은 납 차폐 조각이 있는 섭씨 37도의 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 표적 세포가 용해될 수 있도록 16시간 동안 배양합니다.

배양 기간이 끝나면 접시 가장자리 주위의 테이프를 조심스럽게 제거하고 뚜껑을 제거합니다. 다음으로, 수확 프레임을 접시에 놓고 각 면 플러그에 작은 필터 디스크가 제자리에 있는지 확인합니다. 이제 면 마개를 우물에 천천히 부드럽게 누르십시오. 약 10초 후 면 플러그의 압력을 풀고 면 플러그를 튜브 스트립으로 옮깁니다. 이러한 각 튜브를 보조 FACS 튜브에 넣습니다. 마지막으로, FACS 튜브를 감마 카운터에 로드하고 샘플을 실행하여 각 조건에서 방출된 크롬 51의 양을 정량화합니다. 튜브가 카운터에 적재된 순서를 주의 깊게 기록하십시오.

여기서, 자극되지 않은 PBMC는 처음 3개 레인에 추가되었고, CPG 자극된 PMBC는 4-6개 레인에 추가되었습니다. 이 예에서는 샘플이 원래 플레이트에 배치된 것과 동일한 방식으로 스프레드시트의 셀에 분당 개수를 입력하고 삼중의 평균을 계산했습니다. 예를 들어 첫 번째 조건의 경우 셀 A1, A2 및 A3의 평균이 I3 셀에서 구해졌습니다. 평균이 결정되면 이 공식을 사용하여 각 조건에 대한 특정 용해의 백분율을 계산할 수 있습니다. 예를 들어, 표적 세포에 대한 effector 세포의 비율이 50:1인 자극되지 않은 세포에 대한 특이적 용해 퍼센트를 계산하기 위해 이 예에서 1164.67인 자발적 CPM을 실험 CPM 1129에서 뺍니다. 67. 그런 다음 이 숫자를 최대 CPM과 자발적 CPM의 차이로 나눈 다음 100을 곱하여 백분율 특이적 용해를 제공할 수 있습니다. 그런 다음 각 조건에 대해 계산됩니다. 그런 다음 이러한 데이터를 그래프로 표시하여 자극되지 않은 PBMC와 CPG 자극 PBMC 모두에 대한 백분율 특정 용해와 E 대 T 비율의 비교를 표시할 수 있습니다. 이 예에서 CPG로 자극된 효과기 세포는 표적 세포에 대한 효과기 세포의 비율이 증가함에 따라 표적 세포를 더 효과적으로 죽였습니다. 이러한 증가는 자극되지 않은 PBMC에서 관찰되지 않았으며, 이는 CPG 자극이 관찰된 표적 세포 용해의 증가에 필요함을 나타냅니다.