3: cDNA 말단의 신속 증폭

1. 3'RACE에 대한 실험 설정

1. 관심 유전자(유전자 특이적 프라이머 1, GSP-1)에 대한 5' 특정 프라이머를 설계한다. 특이성을 도입하는 유일한 프라이머이기 때문에 매우 구체적이어야 합니다. 따라서, 상대적으로 긴 프라이머가 바람직할 것이다(55-65°C에서 24개의 뉴클레오티드, Tm의 전형적인 길이).
2. 두 번째 중첩 프라이머(GSP-2)를 설계하는 것은, 즉 프라이머는 GSP-1의 3'에 위치해야 한다. 이 단계는 선택 사항이지만 중첩 된 프라이머로 두 번째 PCR을 수행하면 관심 유전자에 대한 PCR의 수율 및 특이성을 증가시게됩니다. dSmad2 cDN을 증폭시키는 데 사용되는 프라이머는 표 2에 나열됩니다.

2. cDNA 합성

1. 제조자의 프로토콜에 따라 RNA 추출 방법 또는 키트를 사용하여 샘플에서 RNA를 추출한다. 게놈 DNA의 증폭을 피하기 위해 DNase로 샘플을 치료하십시오. 우리의 예에서, 우리는 10 전체 성인 파리에서 RNA를 추출했습니다.
2. 마이크로볼륨 분광계를 사용하여 RNA 농도를 측정하고 필요한 경우 RNase 프리 워터로 최대 100 ng/μl으로 조정합니다.
3. RACE에 권장되는 키트를 사용하여 역전사(RT) 반응으로 cDNA를 준비합니다. 샘플당 다음 시약으로 마스터 믹스를 준비합니다.
   - 4 μl 역 전사 버퍼 (5x)
   - 2 μl 올리고 (dT)₂₀ 프라이머 (20 데옥시티닌으로 구성된 올리고)
   - 10 μl RNA (최대 1 μg)
   - 3 μl ddH₂O
   - 1 μl 역 전사제
   - 합계 : 20 μl
4. 42ºC에서 90 분 동안 반응을 배양하십시오. 역 전사를 생략하는 네거티브 제어를 포함한다.
5. 5 분 동안 85ºC에서 배양하여 역 전사를 비활성화합니다.
6. 효율적인 PCR을 위해 DNA 수준을 희석시키기 위해 80 μl TE 버퍼를 추가하여 총 부피를 100 μl로 가져옵니다.

3. cDNA 단편 증폭

1. 고충실도(HF) Taq 폴리머라제를 사용하여 1라운드 증폭 PCR 믹스를 준비하십시오.
   - 4 μl 5x HF 타크 폴리머라제 버퍼
   - 0.4 μl dNTP 믹스 (각 10mMM)
   - 1 μl GSP1 프라이머 (10 μM)
   - 1 μl 올리고 (dT)20 프라이머 (10 μM)
   - 1 μl cDNA 템플릿
   - 0.2 μl HF 타크 DNA 폴리머라제
   - 12.4 μl ddH2O
   - 합계 : 20 μl
2. PCR1 프로그램(표 1)을 사용하여 PCR을 실행합니다. RT 없이 원래 RNA 제품을 템플릿으로 사용하여 음의 대조를 포함한다. 또한, '프라이머 없음' 컨트롤이 포함될 수 있다.
3. 선택 사항: 중첩된 PCR을 통해 특이성과 cDNA 제품의 양을 증가시합니다. PCR 제품의 1 μl을 희석하고 TE 버퍼에서 음수 제어 1:20을 희석합니다. 두 번째 PCR 반응에 대한 템플릿으로 사용하십시오.
   - 4 μl 5x HF 타크 폴리머라제 버퍼
   - 0.4 μl dNTP 믹스 (각 10mMM)
   - 1 μl GSP2 프라이머 (10 μM)
   - 1 μl 올리고 (dT)₂₀ 프라이머 (10 μM)
   - 1 μl PCR 제품 템플릿
   - 0.2 μl HF 타크 DNA 폴리머라제
   - 12.4 μl ddH2O
   - 합계 : 20 μl
4. PCR2 프로그램을 사용하여 두 번째 PCR 실행(표 1)

4. cDNA 단편 의 격리

1. 에티듐 브로마이드 또는 대체 DNA 얼룩을 사용하여 1-2% 아가로즈 젤을 TAE 버퍼로 준비합니다.
2. 샘플 5 μl을 6x 젤 로딩 버퍼 1μl과 혼합합니다.
3. 시료와 1kb DNA 사다리를 마커로 적재하고 젤을 120 V에서 약 45분 동안 또는 염료 전면이 겔 아래로 내려가는 방식의 ~75%가 될 때까지 젤을 실행합니다. 샘플이 젤이 부족하지 않도록 하십시오.
4. UV 램프 아래에서 젤 밴드를 확인합니다. 제품의 추가 처리를 위해, 낮은 강도 UV를 사용하여 증폭 된 밴드를 찾아 메스를 사용하여 젤에서 잘라.
5. 동결 짜기 또는 키트와 같은 방법을 사용하여 젤에서 DNA를 정화합니다.
6. 정제된 cDNA 조각을 -20ºC에 저장하거나 시퀀싱 또는 복제와 같은 추가 응용 프로그램에 즉시 사용하십시오.

일반적으로 새로운 mRNA의 경우 전체 염기서열의 일부만 알려져 있습니다. mRNA 말단에서 누락된 뉴클레오티드 염기서열은 RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)라고 하는 PCR 기반 방법을 사용하여 측정할 수 있습니다.

진핵생물에서 성숙한 mRNA는 양쪽 말단에 독특한 구조적 특징을 가지고 있습니다. 5-프라임 말단에서 대부분은 5-프라임에서 5-프라임 트리포스페이트 연결을 통해 mRNA에 연결된 메틸화된 구아노신 잔기를 가지고 있습니다. 이것은 5 프라임 캡이라고도 합니다. 쓰리 프라임 말단에서 대부분의 진핵생물은 폴리(A) 꼬리라고 하는 20-250개의 아데닐레이트 잔기의 꼬리를 가지고 있습니다.

이제 작은 분절의 뉴클레오티드 염기서열이 mRNA 내 어느 곳에서나 알려져 있는 경우, 3-프라임 말단까지의 염기서열은 유전자 특이적 프라이머와 3-프라임 말단에서 폴리(A) 꼬리에 어닐링되는 비특이적 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있습니다. RACE 기술의 이러한 하위 집합을 3-프라임 RACE라고 하며, 이를 통해 전사체 변이체 및 다양한 3-프라임 UTR(Untranslated Regions)을 검출할 수 있습니다.

5 프라임 말단의 서열은 유사하게 증폭 될 수 있습니다. 이를 위해 폴리(A) 꼬리가 먼저 5프라임 끝에 부착됩니다. 그런 다음, 추가된 꼬리에 어닐링하는 비특이적 올리고(dT) 프라이머와 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 5-프라임 말단까지의 염기서열을 증폭할 수 있습니다. RACE의 이 하위 집합은 5 프라임 RACE로 알려져 있으며 차동 5 프라임 스플라이스 변형 및 대체 5 프라임 UTR을 찾는 데 사용됩니다.

주어진 유전자에 의해 암호화된 다른 전사체를 식별하기 위해 three-prime RACE를 수행하기 위해 RNA는 먼저 관심 유기체 또는 조직에서 분리됩니다. 다음으로, cDNA는 올리고(dT) 프라이머와 RNA 주형에서 상보적 DNA를 생성하는 역전사 효소를 활용하는 역전사 반응을 통해 분리된 mRNA에서 합성됩니다. 다음으로, 생성된 cDNA 풀에서 비특이적 올리고(dT) 프라이머와 유전자 특이적 프라이머를 활용하여 PCR을 통해 타겟 cDNA의 알려지지 않은 3 프라임 말단을 확장하고 PCR 반응 중에 증폭합니다.

그러나, non-specific primer의 일반적인 특성과 유전자 특이적 primer에 의한 무작위 mispriming으로 인해 off-target cDNA에 어닐링되어 증폭될 수 있습니다. 이 문제를 극복하기 위해, PCR의 두 번째 라운드는 중첩된 프라이머를 사용하여 수행되며, 이는 첫 번째 프라이머 세트의 다운스트림에 결합합니다. 이 두 번째 프라이머 세트는 관심 있는 cDNA를 추가로 증폭하지만 비특이적 산물은 증폭하지 않아 반응의 특이성과 수율을 높입니다.

마지막으로, PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 분리되며, 이는 크기에 따라 표적 유전자의 서로 다른 전사체를 분리하여 뚜렷한 띠를 생성합니다. 그런 다음 관심 밴드를 절제하고 정제한 다음 최종적으로 염기서열을 분석하여 전사체의 완전한 염기서열을 얻을 수 있습니다.

이 비디오에서는 Drosophila dSmad2 유전자에 의해 인코딩된 다양한 전사체를 식별하고 분리하는 three-prime RACE 기술을 시연합니다.

cDNA의 합성 및 증폭을 시작하기 전에 프라이머 설계 소프트웨어를 사용하여 관심 유전자(이 예에서는 dSmad2)에 대한 5-프라임 특이적 프라이머를 만듭니다. 프라이머가 매우 특이적이도록 하려면 약 24개의 뉴클레오티드가 있어야 하고 Tm이 섭씨 55도에서 65도 사이여야 합니다. 다음으로, 첫 번째 프라이머의 3-프라임에 위치한 두 번째 중첩 프라이머를 설계하며, 이는 타겟 염기서열에 특이적입니다.

먼저 시중에서 판매되는 RNA 추출 키트를 사용하여 10마리의 전체 성충 파리에서 RNA를 추출합니다. RNA가 추출되면 펠릿을 뉴클레아제가 없는 물 20마이크로리터에 재현탁합니다. 50마이크로리터 반응의 경우, 각 샘플 튜브에 5마이크로리터의 반응 버퍼를 추가하고 24마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가하여 반응 부피를 높입니다. 그런 다음 1마이크로리터의 DNase I을 첨가하여 게놈 DNA의 증폭을 방지합니다. 마지막으로 섭씨 37도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.

DNase 처리 후 각 튜브에 1마이크로리터의 25밀리몰 EDTA로 효소를 비활성화합니다. 샘플을 스핀 컬럼에 추가하여 RNA를 정제합니다. 다음으로, 마이크로볼륨 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 농도를 마이크로리터당 100나노그램으로 조정합니다.

이제 역전사 반응을 위한 마스터 믹스를 준비합니다. 테스트 DNA 샘플 외에도 해당 튜브에서 역전사 효소를 생략하여 하나의 음성 대조군을 포함합니다. 섭씨 42도에서 90분 동안 반응을 배양합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 85도에서 5분 동안 배양하여 역전사 효소를 비활성화합니다. 다음으로, 각 튜브에 80마이크로리터의 TE 버퍼를 추가하여 총 반응 값을 100마이크로리터로 만들어 DNA 수준을 희석합니다.

이제 cDNA가 합성되었으므로 PCR을 통해 관심 유전자를 증폭합니다. 이를 위해 먼저 1차 증폭 PCR 믹스를 준비합니다. cDNA 템플릿 외에도, 비역전사 산물의 템플릿을 사용하는 negative control 반응과 no-primer control로 유전자 특이적 프라이머가 없는 반응을 포함합니다.

반응이 준비되면 가열된 뚜껑이 장착된 열순환기에서 PCR 증폭을 수행합니다. 다음으로, 19 μl의 TE 완충액에 1 μlit의 PCR 산물을 첨가하여 생성물 1 내지 20을 희석한다. 이러한 희석된 생성물을 사용하여 2차 증폭 PCR 믹스를 준비합니다. 그런 다음 열순환기를 사용하여 두 번째 PCR을 실행합니다.

PCR 단편을 분리하려면 TAE 완충액 100ml당 아가로스 1g을 첨가하여 1% 아가로스 겔을 준비합니다. 혼합물을 전자레인지에서 2분 동안 녹인 다음 SYBR Safe stain 또는 ethidium bromide를 첨가합니다. 용융된 혼합물을 젤 트레이에 붓고 굳히십시오.

겔이 굳는 동안 6X Loading Dye 1 마이크로 리터 방울을 샘플 수에 해당하는 파라 필름 조각에 피펫으로 넣습니다. 각 액적에 5마이크로리터의 샘플을 추가합니다. 이제 1 kilobase DNA ladder와 함께 샘플을 겔에 로드합니다. 120볼트에서 약 45분 동안 또는 염료 앞면이 젤 아래의 75%가 될 때까지 젤을 실행합니다.

젤이 작동을 마치면 UV 투과광 장치 아래의 젤 밴드를 확인합니다. 밴드를 찾아 메스를 사용하여 잘라냅니다. 시판되는 스핀 컬럼 키트를 사용하여 cDNA 단편을 정제합니다. 정제가 완료되면 cDNA 단편은 섭씨 영하 20도에서 보관하거나 추가 분석을 위해 즉시 사용할 수 있습니다.

이 실험에 앞서, 초파리 dSmad2에 대한 두 개의 전사체가 초파리 게놈 데이터베이스인 FlyBase에 주석을 달았습니다. 이 유전자의 예상되는 스플라이싱에 기초하여, 두 개의 산물은 three-prime RACE 프로토콜에 의해 식별되어야 합니다.

그러나 이 실험의 결과는 dSmad2에 대한 세 가지 다른 전사체를 보여줍니다. 예측된 산물 중 하나의 전사체가 우세하고 다른 하나는 더 낮은 수준으로 발현됩니다. 또한, 750 염기쌍에서 볼 수 있는, 이전에 설명되지 않았던 더 작은 생성물이 검출되었다.