cDNA 말단의 신속 증폭

1. 3'RACE에 대한 실험 설정

1. 관심 유전자(유전자 특이적 프라이머 1, GSP-1)에 대한 5' 특정 프라이머를 설계한다. 특이성을 도입하는 유일한 프라이머이기 때문에 매우 구체적이어야 합니다. 따라서, 상대적으로 긴 프라이머가 바람직할 것이다(55-65°C에서 24개의 뉴클레오티드, Tm의 전형적인 길이).
2. 두 번째 중첩 프라이머(GSP-2)를 설계하는 것은, 즉 프라이머는 GSP-1의 3'에 위치해야 한다. 이 단계는 선택 사항이지만 중첩 된 프라이머로 두 번째 PCR을 수행하면 관심 유전자에 대한 PCR의 수율 및 특이성을 증가시게됩니다. dSmad2 cDN을 증폭시키는 데 사용되는 프라이머는 표 2에 나열됩니다.

2. cDNA 합성

1. 제조자의 프로토콜에 따라 RNA 추출 방법 또는 키트를 사용하여 샘플에서 RNA를 추출한다. 게놈 DNA의 증폭을 피하기 위해 DNase로 샘플을 치료하십시오. 우리의 예에서, 우리는 10 전체 성인 파리에서 RNA를 추출했습니다.
2. 마이크로볼륨 분광계를 사용하여 RNA 농도를 측정하고 필요한 경우 RNase 프리 워터로 최대 100 ng/μl으로 조정합니다.
3. RACE에 권장되는 키트를 사용하여 역전사(RT) 반응으로 cDNA를 준비합니다. 샘플당 다음 시약으로 마스터 믹스를 준비합니다.
   - 4 μl 역 전사 버퍼 (5x)
   - 2 μl 올리고 (dT)₂₀ 프라이머 (20 데옥시티닌으로 구성된 올리고)
   - 10 μl RNA (최대 1 μg)
   - 3 μl ddH₂O
   - 1 μl 역 전사제
   - 합계 : 20 μl
4. 42ºC에서 90 분 동안 반응을 배양하십시오. 역 전사를 생략하는 네거티브 제어를 포함한다.
5. 5 분 동안 85ºC에서 배양하여 역 전사를 비활성화합니다.
6. 효율적인 PCR을 위해 DNA 수준을 희석시키기 위해 80 μl TE 버퍼를 추가하여 총 부피를 100 μl로 가져옵니다.

3. cDNA 단편 증폭

1. 고충실도(HF) Taq 폴리머라제를 사용하여 1라운드 증폭 PCR 믹스를 준비하십시오.
   - 4 μl 5x HF 타크 폴리머라제 버퍼
   - 0.4 μl dNTP 믹스 (각 10mMM)
   - 1 μl GSP1 프라이머 (10 μM)
   - 1 μl 올리고 (dT)20 프라이머 (10 μM)
   - 1 μl cDNA 템플릿
   - 0.2 μl HF 타크 DNA 폴리머라제
   - 12.4 μl ddH2O
   - 합계 : 20 μl
2. PCR1 프로그램(표 1)을 사용하여 PCR을 실행합니다. RT 없이 원래 RNA 제품을 템플릿으로 사용하여 음의 대조를 포함한다. 또한, '프라이머 없음' 컨트롤이 포함될 수 있다.
3. 선택 사항: 중첩된 PCR을 통해 특이성과 cDNA 제품의 양을 증가시합니다. PCR 제품의 1 μl을 희석하고 TE 버퍼에서 음수 제어 1:20을 희석합니다. 두 번째 PCR 반응에 대한 템플릿으로 사용하십시오.
   - 4 μl 5x HF 타크 폴리머라제 버퍼
   - 0.4 μl dNTP 믹스 (각 10mMM)
   - 1 μl GSP2 프라이머 (10 μM)
   - 1 μl 올리고 (dT)₂₀ 프라이머 (10 μM)
   - 1 μl PCR 제품 템플릿
   - 0.2 μl HF 타크 DNA 폴리머라제
   - 12.4 μl ddH2O
   - 합계 : 20 μl
4. PCR2 프로그램을 사용하여 두 번째 PCR 실행(표 1)

4. cDNA 단편 의 격리

1. 에티듐 브로마이드 또는 대체 DNA 얼룩을 사용하여 1-2% 아가로즈 젤을 TAE 버퍼로 준비합니다.
2. 샘플 5 μl을 6x 젤 로딩 버퍼 1μl과 혼합합니다.
3. 시료와 1kb DNA 사다리를 마커로 적재하고 젤을 120 V에서 약 45분 동안 또는 염료 전면이 겔 아래로 내려가는 방식의 ~75%가 될 때까지 젤을 실행합니다. 샘플이 젤이 부족하지 않도록 하십시오.
4. UV 램프 아래에서 젤 밴드를 확인합니다. 제품의 추가 처리를 위해, 낮은 강도 UV를 사용하여 증폭 된 밴드를 찾아 메스를 사용하여 젤에서 잘라.
5. 동결 짜기 또는 키트와 같은 방법을 사용하여 젤에서 DNA를 정화합니다.
6. 정제된 cDNA 조각을 -20ºC에 저장하거나 시퀀싱 또는 복제와 같은 추가 응용 프로그램에 즉시 사용하십시오.