Drosophila에서 Visual과 강한 중재 플라이트 컨트롤을 맡은 이후로 자기 테더 시스템

Joof 후각 연구 분야의 성장으로 인해 후각 자기 결속 장치(olfactory magnetic tether apparatus, OMT)와 같은 더욱 정교한 행동 분석법의 필요성이 대두되었습니다. 이 절차는 초파리의 등면 흉부를 mnuchin 핀에 접착하는 과정을 포함합니다. 핀을 적절한 피치로 조절하여 초파리를 30도 각도로 매단 후, 두 개의 희토류 자석 사이에 정렬시킵니다.

올바르게 수행되면 자유로운 가동 범위가 확보됩니다. 그런 다음, 전달 노즐에서 초파리의 머리를 거쳐 진공 챔버로 부드럽게 흐르는 기류가 생성되도록 냄새 포트를 정렬합니다. 이후 시각적 자극이 있는 상태에서 초파리가 휘발성 향료를 찾는 능력을 테스트합니다.

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 생리과학과의 Mark Fry 박사 연구실 소속 Brian DeMars입니다. 오늘은 후각 자기 고정 장치(olfactory magnetic tether apparatus)에 사용하기 위해 초파리를 고정하는 방법을 보여드리겠습니다. 또한 자석과 냄새 포트를 정렬하고, 냄새 전달 시스템의 질량 유량을 설정하는 방법도 함께 설명하겠습니다.

본 실험실에서는 초파리의 시각 및 후각 매개 비행 제어를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 테더링을 시작하려면 성충 우화 후 4~6일 된 파리를 수집하여 4~6시간 동안 굶깁니다.

건조를 방지하기 위해 젖은 Kimwipe가 들어 있는 먹이 튜브에 보관합니다. 다음으로, 별표 표시된 파리 무리를 4 °C로 설정된 펠티어 냉각 스테이지의 황동 블록에 삽입된 작은 튜브로 옮깁니다. 이 온도에서 파리들은 약 30초 이내에 마취됩니다.

습기를 흡수할 수 있도록 냉각 스테이지 위에 Kim wipe를 놓습니다. 다음으로 마취된 초파리를 스테이지 위에 올려놓고 분리한 뒤, 테더링을 위해 가장 큰 암컷들을 선택합니다. 미세 브러시를 사용하여 야생형 암컷 초파리 한 마리가 들어갈 수 있도록 제작된 맞춤형 사르코파구스(sarcophagus)의 정해진 위치로 초파리를 밀어 넣습니다.

이제 현미경을 사용하여 초파리의 등 쪽이 위로 향하도록 올바르게 배치되었는지 확인하십시오. 초파리의 앞부분이 당신을 향하고 뒷부분이 반대편을 향해야 합니다. 다음으로, 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 마그네틱 로드가 달린 미뉴친 핀(minuchin pin)을 배치하십시오.

핀의 뭉툭한 끝부분이 초파리의 등쪽 가슴을 향하도록 정렬해야 합니다. 이 위치는 머리 바로 뒤쪽, 양쪽 날개 사이입니다. 초파리는 세 개의 축을 따라 핀 위에 올바르게 배치되어야 합니다.

피치, 롤, 요를 고려할 때, 정면에서 눈을 바라보았을 때 핀은 완벽하게 수직이어야 하며, 파리와 핀 사이에 아주 적은 양의 롤이라도 허용되지 않습니다. 핀과 몸체의 장축 사이의 측면 뷰 각도 또는 피치는 수평선 대비 30도 상향 각도가 되어야 합니다. 최적의 계류 운용을 위해 핀의 길이를 조정해야 할 수도 있음을 유의하십시오.

이는 현수 자석 사이의 거리에 따라 달라집니다. Mnuchin 핀이 정렬되면, 가는 강철 와이어를 사용하여 Mnuchin 핀의 뭉툭한 끝부분에 UV 경화 접착제를 소량 도포하십시오. 이제 핀을 조절하여 접착제 방울이 초파리의 머리 바로 위 가슴 부위에 닿게 하십시오.

접착제를 너무 많이 사용하지 않도록 주의하십시오. 적절한 방울 크기로 도포했을 때, 접착제가 핀에서 가슴 부위로 굽어 흐르는 형태가 되어야 합니다. 그런 다음, UV 라이트를 2초씩 두 번 조사하여 접착제를 경화시키십시오.

테더링이 완료되면, 파리가 본능적으로 내려앉으려는 반사가 있으므로 핀셋을 사용하여 각 파리에게 작은 정사각형의 킴와이프(Kim wipe)를 제공하십시오. 파리들이 킴와이프를 잡게 됩니다. 1시간의 회복 시간을 거친 후, 테더링된 파리들은 실험 준비가 완료됩니다.

원활한 360도 가동 범위를 구현하려면 자석을 적절하게 정렬하는 것이 매우 중요합니다. 이를 위해 플라스틱 슬리브를 사용하여 하단 링 자석들을 수평으로 잡고 투명 진공 챔버 바로 위에 배치합니다. 상단 로드 자석은 하단 자석들로부터 약 3/4인치 위에 수직으로 고정하며, 상단 자석의 바닥면에는 V 듀얼 베어링이 에폭시로 부착되어 있습니다.

이렇게 하면 초파리의 위치를 표준화하고 회전 마찰을 최소화할 수 있습니다. 이러한 자석은 위험할 수 있으며, 잘못 사용할 경우 장비가 손상되거나 가벼운 신체적 부상을 입을 수 있으므로 주의하시기 바랍니다. 다음으로, 상단 및 하단 자석의 위치를 시각적으로 대략 맞춥니다.

상단 막대 자석을 하단 링 자석의 중심점 바로 위에 배치하고, 미세 조정을 위해 상단 자석을 마이크로 매니퓰레이터에 부착하는 것이 유용합니다. 이제 아레나에 초파리를 넣고, 모든 실험의 시작 단계에서 초파리가 360도 부드럽고 안정적으로 회전할 수 있을 때까지 상단 자석의 수평 및 수직 위치를 조정하십시오. 자석이 제대로 정렬되었는지와 mnuchin 핀이 손상되지 않았는지 확인하기 위해 각 초파리의 부드러운 회전 여부를 점검해야 합니다. 설정이 잘못된 경우 초파리가 전혀 회전하지 않을 수 있습니다.

운동 범위가 제한되었거나 불규칙한 속도로 회전할 수 있습니다. 이는 접착 과정의 문제일 수 있으며, 초파리 앞에 줄무늬 격자를 회전시켜 omo 반응을 유도함으로써 확인할 수 있습니다. 초파리가 회전하지 않거나 불규칙하게 회전하는 경우, 다른 초파리로 교체하십시오.

만약 파리가 제대로 회전하지 않고 모든 파리에서 이러한 문제가 발생한다면, 이는 자석의 정렬 문제일 가능성이 높으며 안정적인 냄새 전달을 위해 추가 조정이 필요합니다. 냄새 시스템의 초기 설정을 추적하려면 가스 멀티플렉서에서 맞춤 제작된 수성 냄새 바이알까지 좁은 게이지의 Teflon 튜빙을 연결해야 합니다. 이 바이알의 배출구는 동일한 Teflon 튜빙을 사용하여 하이포더믹 포트 튜브에 직접 연결되어야 합니다.

다음으로, 자석을 지지하기 위해 투명 아크릴 진공 챔버를 아레나 아래에 배치합니다. 파리 아래에 장착되어 진공 챔버와 연결된 4 mm 유리 튜브를 사용하여 진공 개구부를 파리에 더 가깝게 가져가고 개구부의 직경을 줄입니다. 이제 포셉을 사용하여 결박된 파리를 아레나에 넣습니다.

초파리가 정해진 위치에 놓이면 유인 향기를 켭니다. 향기가 공급될 때 초파리가 향기 포트 방향으로 향하는지 시각적으로 확인할 수 있습니다. 초파리가 향기에 대해 특별한 선호도를 보이지 않는 경우, 시행착오 방법을 통해 OMT를 최적화하십시오.

이를 위해 먼저 파리가 냄새를 추적하는 것으로 보일 때까지 냄새 포트의 위치를 조정하십시오. 본 실험에서 냄새 포트는 마이크로 조작기(micromanipulator)에 장착되어 있으며, 파리 머리를 기준으로 등쪽으로 4 mm, 앞쪽으로 3 mm 지점에 위치합니다. 냄새 포트의 위치를 변경해도 냄새 추적이 개선되지 않는 경우, 파리가 냄새를 추적하는 것으로 보일 때까지 질량 유량을 조정하십시오.

설정값은 분당 7 mL로 사용합니다. 질량 유량을 조절해도 냄새 추적 능력이 개선되지 않는 경우, 초파리가 냄새를 추적하는 것처럼 보일 때까지 진공 유량을 조절하십시오. 유량 조절기를 사용하여 진공 유량을 분당 13 L로 설정합니다.

포트의 위치와 유량이 설정되면, 전환 가능한 가스 멀티플렉서를 사용하여 수증기와 냄새 증기의 공급을 주기적으로 전환합니다. 장치를 올바르게 설정했다면 두 가지 현상을 관찰할 수 있어야 합니다. 첫째, 지속적인 회전 시각 자극 하에서 OMT에 고정된 초파리는 수직 또는 ya 축을 따라 부드럽게 360도 회전해야 합니다. 지속적인 시각 자극이 없을 때 나타나는 자발적 회전 행동의 특징인 kos라고 불리는 갑작스러운 회전이 나타나서는 안 됩니다.

초파리가 부드럽게 회전하지 못한다면, 부적절한 접착이나 자석의 정렬 불량이 원인일 수 있습니다. 둘째로, 냄새가 공급될 때 초파리가 냄새 포트 방향으로 향하는지 확인해야 합니다. 냄새 공급이 중단되면, 초파리는 아레나 내의 특정 위치에 대한 선호 없이 자발적으로 회전해야 합니다.

초파리가 냄새 플룸을 능동적으로 추적하지 않는다면, 이는 냄새 포트의 위치, 공기 흐름 속도 또는 진공 흐름 속도를 조정해야 함을 의미할 수 있습니다. 지금까지 후각 자기 테더 장치에서 사용할 수 있도록 초파리를 테더링하는 방법을 보여드렸습니다. 또한 자석과 냄새 포트를 적절하게 정렬하는 방법과 냄새 전달 시스템의 질량 유량을 설정하는 방법도 살펴보았습니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.