만성에 대한 마이크로 드라이브 배열 생체내에 녹화 : 드라이브 제작

본 영상에서는 21개의 독립적으로 조절 가능한 나사 구동 방식 마이크로 드라이브로 구성된 경량 마이크로 드라이브 어레이의 조립 과정을 다룹니다. 각 마이크로 드라이브는 단일 전극의 기록 위치를 제어합니다. 마이크로 드라이브는 컴퓨터로 설계된 플라스틱 베이스에 장착되어, 움직이는 동물의 두개골을 기준으로 안정적으로 고정되며, 전극들을 조밀하게 배치하여 작은 개두술 부위를 통해 뇌 내부로 삽입될 수 있도록 합니다.

베이스에는 기록 장치와의 연결을 위한 전극 인터페이스 보드가 장착되어 있어, 실험 시작과 종료 시 동물을 편리하게 연결하거나 분리할 수 있습니다. 베이스에 부착된 플라스틱 원뿔은 쥐 케이지 내의 외부 요인으로부터 마이크로 드라이브와 전극을 보호합니다. 안녕하세요, 저는 매사추세츠 공과대학교 PIKA 학습 및 기억 연구소의 Matt Wilson 교수님 연구실 소속 Faia Postman입니다.

오늘은 마이크로 다이브 어레이(micro dive array)를 제작하는 프로토콜을 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 피질이나 해마와 같이 쥐 뇌의 광범위한 뉴런 집단으로부터 신호를 기록하기 위해 이러한 마이크로 다이브 어레이를 사용합니다. 먼저, 저희가 마이크로 다이브 어레이를 어떻게 설계했는지 보여드리겠습니다.

이제 작업실로 이동하여 Steve와 Stewart가 원자재를 처리하는 방법과 이를 완전히 작동하는 장치로 조립하는 방법을 보여줄 것입니다. 그럼 시작하겠습니다. 플라스틱 베이스는 컴퓨터 보조 설계 소프트웨어를 사용하여 설계되었으며, 저렴한 3D 프린팅 공정을 통해 제작됩니다.

우리는 또한 마이크로 드라이브 어레이의 다른 모든 구성 요소들을 모델링합니다. 이를 통해 완성된 드라이브의 크기와 무게를 세밀하게 조절할 수 있습니다. 플라스틱 베이스의 상단에는 개별 마이크로 드라이브를 장착할 수 있는 두 줄의 구멍 링이 있습니다.

3D 모델은 서비스 뷰로(service bureau)로 전송되며, 그곳에서 스테레오 리소그래피(stereo lithography)를 이용하여 레이저 경화성 수지로 설계를 제작합니다. 이 과정은 며칠밖에 걸리지 않으며, 완성된 부품은 가볍고 재사용이 가능합니다. 서비스 뷰로부터 부품이 도착하면, 이를 사용할 수 있도록 준비해야 합니다.

이제 작업실로 이동하겠습니다. 3D 프린팅 공정으로는 작은 구멍을 정밀하게 출력할 수 없으므로, 모델 설계 시 구멍의 직경을 더 작게 지정합니다. 그 후 작업실에서 드릴링과 탭 작업을 통해 구멍을 필요한 크기로 가공합니다.

플라스틱 베이스를 준비하기 위해 세 가지 서로 다른 크기의 드릴 비트를 사용하는데, 베이스의 외부 링에는 61번 비트, 65번 비트 및 1.55 millimeter 비트를 사용합니다. 61번 비트를 장착한 핸드 드릴을 매우 낮은 속도로 사용하여, 나중에 마이크로 드라이브 나사가 삽입될 가이드 구멍을 뚫습니다. 다음으로, 65번 비트로 구멍을 뚫어 베이스 입구에 마이크로 드라이브 지지 튜브를 위한 구멍을 준비합니다.

더 큰 1.55 millimeter 비트를 사용하여 베이스를 전극 인터페이스 보드 및 보호 콘에 부착할 구멍들을 뚫습니다. 마이크로 드라이브의 원활한 움직임을 보장하기 위해, 내부 구멍 링에 스테인리스 스틸 슬리브를 삽입합니다. 각 슬리브는 플라이어를 사용하여 베이스 상단과 수평이 될 때까지 압입해야 합니다.

이제 나사 가이드 구멍에 나사산을 내야 합니다. 핀 바이스를 사용하여 탭을 고정하고, 탭핑 전 건식 윤활제를 도포하십시오. 인접한 슬리브에 일시적으로 삽입한 23 gauge 튜브와 평행이 되도록 탭과 그 정렬 상태를 맞추십시오.

인터페이스 보드와 보호 콘을 고정하는 구멍들에 나사산을 만들어야 합니다. 동일한 방식으로 이 구멍들을 핸드 탭으로 가공하십시오. 플라스틱 기반 설계에는 각 나사 가이드 구멍마다 탭 스타터가 포함되어 있어, 나사산 가공 과정에서 초기 나사산이 손상되지 않도록 보호합니다.

모든 파일럿 홀에 나사산 가공이 완료되면, 면도날을 사용하여 이러한 탭 스타터를 쉽게 제거할 수 있습니다. 전극들은 여러 개의 전극 안내 튜브에 의해 드라이브 바닥의 단일 지점으로 안내됩니다.

먼저, 모든 전극 가이드 튜브를 고정할 수집 캐뉼라를 제작해야 합니다. 수집 캐뉼라는 1.5 cm 길이의 스테인리스 스틸 튜브 조각으로 만듭니다. 수집 캐뉼라는 치과용 시멘트로 고정합니다.

접착력을 높이기 위해 Dremel 그라인딩 휠을 사용하여 튜브 표면을 조심스럽게 거칠게 만든 후, 이 캐뉼라를 플라스틱 베이스 바닥에 삽입하십시오. 캐뉼라의 5~7 mm 부분이 마이크로 드라이브 어레이 외부에 남도록 위치시킵니다. 외과적 이식을 용이하게 하기 위해 수집 캐뉼라를 플라스틱 베이스 바닥에 부착하십시오.

치과용 아크릴을 사용하는 경우, 최소 15분 동안 경화시키십시오. 이제 면도날을 사용하여 폴리아미드 21개를 잘라 가이드 튜브를 준비합니다. 이 단계는 21개의 가이드 튜브 전체를 구동 베이스 하단의 수집 캐뉼라에 삽입하는 것으로 시작합니다.

이렇게 하면 튜브들이 모두 서로 평행하게 유지됩니다. 번들의 튜브가 너무 헐겁거나 빡빡한 경우, 튜브 수를 줄여서 시작하거나 필요에 따라 튜브를 추가하십시오. 이제 각 가이드 튜브를 하나씩 제거하여 드라이브 상단의 슬리브 중 하나에 삽입하십시오.

튜브 묶음 뒤쪽 왼쪽 틈새를 통해 튜브를 아래로 통과시킵니다. 가이드 튜브에 꼬임이나 심한 굴곡이 있는지 확인하고, 필요한 경우 교체합니다. 각 가이드 튜브의 위치를 조정하여 슬리브 상단으로부터 1~2mm 정도 돌출되도록 합니다.

이제 수집 캐뉼라(collector cannula) 바닥에 묽은 sano acro lake 글루를 소량 떨어뜨립니다. 이때 글루가 가이드 튜브 안으로 흘러 들어가지 않도록 매우 주의하십시오. 다음으로, 새 면도날을 사용하여 수집 캐뉼라 바닥에 남은 불필요한 튜브 묶음을 잘라냅니다.

실체 현미경 하에서 튜브가 깔끔하게 절단되었으며 캐뉼라와 평평하게 일치하는지 확인합니다. 각 전극은 개별 마이크로 드라이브에 의해 전진하므로, 21개의 마이크로 드라이브를 제작하여 플라스틱 베이스에 삽입해야 합니다. 각 마이크로 드라이브는 서로 연결된 맞춤형 나사와 중공 지지 튜브로 구성됩니다.

치과용 아크릴을 사용하여 전극이 지지 튜브를 통과하게 합니다. 나사는 치과용 아크릴에 매립되는 작은 립(lip)이 있는 비나사부(non threaded part)가 있어, 나사가 자유롭게 회전할 수 있습니다. 나사를 플라스틱 베이스로 돌려 넣으면 전극이 전진하거나 후퇴하게 됩니다.

나사의 머리는 반원통형 모양입니다. 마이크로 드라이브를 제작하기 전에, 먼저 맞춤형 나사를 돌릴 수 있는 드라이버를 만들어야 합니다. 임시 드라이버는 맞춤형 나사를 가져와 반원통형 머리를 둘러싸고 있는 립 부분을 완전히 갈아내어 제작합니다.

나사 머리가 완전히 감싸일 때까지 5 cm 길이의 15 gauge 튜브 안으로 밀어 넣습니다. 이제 나사의 나사산 주변의 튜브를 으깨어 나사가 튜브에 고정되어 회전하지 않도록 합니다. 손잡이 역할을 할 미니 핀 바이스를 부착하면 드라이버가 완성됩니다.

마이크로 드라이브는 나사와 지지 튜브 주변에 치과용 아크릴을 몰딩하여 제작합니다. 사용되는 몰드는 플라스틱 베이스와 마찬가지로 3D 프린팅된 플라스틱이며, 하단에 구멍이 있어 아크릴을 몰드에 부을 때 나사와 지지 포스트의 정렬 상태를 유지해 줍니다. 먼저 몰드를 준비해야 하는데, 23 gauge 바늘을 사용하여 지지 튜브 구멍을 깨끗이 비우고, 나사 구멍을 비운 뒤 탭을 사용하여 나사산을 만듭니다.

이는 방금 플라스틱 베이스에 적용했던 것과 동일한 절차입니다. 이제 마이크로 드라이브를 제작하기 위한 몰드가 준비되었습니다. 치과용 아크릴이 몰드에 달라붙는 것을 방지하기 위해 테플론 기반 윤활제로 몰드 내부를 코팅합니다.

아크릴 깊이 내에 단단히 고정될 수 있도록 14 mm 길이의 23 gauge 스테인리스 스틸 지지대의 상단 2~3 mm 부분을 그라인딩 휠로 거칠게 깎아냅니다. 지지대의 윗부분이 웰(well) 상단보다 높게 위치하도록 몰드의 작은 구멍에 지지대를 삽입합니다. 나사에 테플론 기반 윤활제를 얇게 바른 후, 나사산이 웰 바닥 바로 아래에 위치할 때까지 나사 구멍에 삽입합니다.

이제 치과용 아크릴을 혼합하여 몰드에 붓습니다. 모든 구석진 곳까지 빈틈없이 채워졌는지 확인하십시오. 아크릴이 경화된 후에는 바늘을 사용하여 기포를 제거할 수 있습니다.

나사를 풀어서 마이크로 드라이브를 제거할 수 있습니다. 엄격한 품질 검사를 수행하십시오. 아크릴에 균열이나 기포가 없어야 합니다.

포스트와 나사는 평행해야 하며 옆으로 움직이지 않아야 합니다. 나사는 부드럽게 돌아가야 하지만 유격이 없어야 하며, 재사용되는 부품 중 상태가 좋지 않은 마이크로 드라이브는 폐기해야 합니다. 21개의 양호한 마이크로 드라이브가 확보될 때까지 이 과정을 반복하십시오.

몰드에 여러 개의 웰이 있는 경우, 시간을 절약하기 위해 마이크로 드라이브를 여러 개 제작하여 일괄 처리할 수 있습니다. 각 마이크로 드라이브를 플라스틱 베이스의 구멍 한 쌍에 조심스럽게 맞춥니다. 드라이버를 사용하여 마이크로 드라이브 나사를 전진시키면서, 마이크로 드라이브 지지 튜브를 폴리머 가이드 튜브 위로 밀어 넣어 금속 슬리브 안으로 삽입하십시오.

이 과정은 까다로울 수 있습니다. 마이크로 드라이브가 내려갈 때 가이드 튜브가 버클에 걸리지 않도록 베이스 중앙을 주의 깊게 살피십시오. 모든 마이크로 드라이브가 제자리에 배치되고 완전히 내려가면, 가이드 튜브 묶음을 고정하기 위해 드라이브 중앙에 소량의 아크릴을 떨어뜨립니다.

아크릴을 15분 동안 경화시킵니다. 아크릴이 마르면, 각 마이크로 드라이브를 약 3mm 정도 후퇴시키기 위해 마이크로 드라이브의 상단 뷰 도식도를 작성하고 각 마이크로 드라이브에 고유한 이름이나 번호를 부여합니다. 이제 스테레오 현미경으로 보면서 드라이브를 뒤집고 컬렉터 캐뉼라와 가이드 튜브의 바닥면 사진을 찍습니다.

다음 단계에서 참조용으로 사용할 수 있도록 사진을 출력하십시오. 그다음 드라이브를 거꾸로 든 상태에서, 각 가이드 튜브에 좁은 폴리아미드 캐리어 튜브를 마이크로 드라이브 상단으로 나올 때까지 삽입하십시오. 어느 가이드 튜브가 어느 마이크로 드라이브에 해당하는지 사진에 기록해 두십시오.

캐리어 튜브는 나중에 정밀한 전극 와이어를 보호하고 지지하는 역할을 합니다. 이 튜브는 마이크로 드라이브를 통과합니다. 각 캐리어 튜브가 마이크로 드라이브 지지 튜브 상단보다 1 cm 높게 오도록 늘린 다음, 5분 경화 에폭시 또는 점도가 높은 sano acro lake 접착제를 사용하여 캐리어 튜브를 지지 튜브에 접착하십시오.

이 단계에서 각별히 주의하십시오. 접착제가 지지 튜브 내부로 흘러내리면 지지 튜브가 고정 가이드 튜브에 고착되어 해당 마이크로 드라이브가 손상될 수 있습니다. 이것이 캐리어 튜브를 삽입하기 전에 마이크로 드라이브를 들어 올리는 이유입니다.

모든 캐리어 튜브를 접착제로 고정한 후, 마이크로 드라이브를 다시 완전히 내리고 새 면도날을 사용하여 드라이브 바닥면에 맞춰 모든 캐리어 튜브를 평평하게 잘라냅니다. 다음으로, 날카로운 가위를 사용하여 마이크로 드라이브 상단에서 1~2mm 위 지점에서 캐리어 튜브를 자릅니다. 마지막으로 드라이브 베이스 위에 전극 인터페이스 보드를 배치하고 나사 두 개로 고정합니다.

이제 드라이브 어레이에 전극과 실험 장치를 장착할 준비가 되었습니다. 일반적으로 테트로(tetros)라고 불리는 4채널 마이크로와이어 전극을 사용하지만, 어떤 종류의 전극이라도 사용할 수 있습니다. 테트로의 제작 방법, 마이크로 드라이브에 장착하는 방법, 그리고 수술적 이식을 위해 드라이브 어레이를 준비하는 방법은 다른 JoVE 영상에서 다루고 있습니다.

본 프로토콜을 그대로 따르거나 필요에 맞게 수정하여 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 일부 연구자는 더 깊은 뇌 구조에서 기록하기 위해 더 긴 나사가 필요할 수 있습니다. 또한, 하나 이상의 뇌 부위를 대상으로 하는 드라이브를 설계하고자 하는 경우도 있을 수 있습니다.

약간의 수정을 거치면 생쥐와 같은 더 작은 동물에게 사용할 수 있도록 설계를 소형화할 수 있으며, 전극 위치를 원격으로 조정할 수 있는 전동식 마이크로 드라이브를 사용할 수 있습니다. 지금까지 쥐의 머리에 이식하여 동물이 실제로 움직이는 동안 대규모 뉴런 집합으로부터 기록할 수 있는 마이크로 드라이브 어레이의 설계 및 제작 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 마이크로 드라이브 나사가 미끄러지지 않도록 플라스틱 베이스의 구멍을 조심스럽게 뚫는 것이 중요합니다.

제작된 마이크로 드라이브의 품질을 엄격하게 점검하십시오. 나사와 지지 튜브가 평행한지, 그리고 나사가 유격 없이 부드럽게 회전하는지 확인하십시오. 접착제나 치과용 아크릴을 사용할 때 튜브가 실수로 막히지 않도록 주의하십시오.

마지막으로, MyDrive 어레이를 완성하고 수술을 진행하기 전에, 드라이브 내에 tetros와 low dose를 제작해야 함을 기억하십시오. 이 내용은 다른 JoVE 비디오 논문에서 다루고 있습니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.