만성에 대한 마이크로 드라이브 배열 생체내에 녹화 : Tetrode 조립

본 프로토콜에서는 깨어 있는 설치류의 만성 체내 기록을 위한 4개 전극으로 구성된 Tetros 번들의 제작 및 설치 방법을 설명합니다. 먼저 테트로 제작을 위해 마이크로전극 와이어 가닥을 두 번 접어 4개의 평행한 와이어 번들을 만듭니다. 그다음 이 와이어들을 함께 꼬고, 열풍기로 가열하여 고정합니다.

완성된 각 tero는 보관함에 넣습니다. tero를 계속 제작하는 동안, 각 tero를 리니어 액추에이터의 개구부를 통해 들어가 마이크로 드라이브 어레이의 바닥면으로 나오는 전용 경로에 삽입합니다. tero의 네 개 와이어 각각을 마이크로 드라이브 어레이 상단에 부착된 출력 커넥터 보드의 개별 핀에 연결합니다.

금 도금 공정을 사용하여 각 tero 채널의 임피던스를 낮춥니다. 모든 tero의 설치와 도금이 완료되면, 커넥터 보드의 해당 핀에 두 개의 접지선을 연결하고, 접지 처리를 거친 보호 콘을 마이크로 드라이브 어레이 프레임에 부착하여 보호합니다. 이로써 이식 준비가 완료된 기능적인 Tero 마이크로 드라이브 어레이가 구성됩니다. 안녕하세요, 저는 Pickout 학습 및 기억 연구소의 Nat Wilson 교수님 연구실 소속 Dave Nian입니다.

오늘 MIT에서는 테로스(teros)의 제작, 테로스 로딩, 그리고 마이크로 드라이브 재구성의 최종 단계를 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 깨어 있고 행동하는 동물 표본 내의 대규모 신경세포 집단과 개별 뉴런 사이의 협응된 신경 활동을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

표준 마이크로 드라이브 어레이용 tero를 제작하기 위해, 먼저 50 cm 길이의 절연된 12 micron 마이크로 와이어를 준비합니다. 와이어를 반으로 접은 후, 두 가닥이 서로 밀착되도록 손가락으로 훑어줍니다. 와이어 쌍이 전체 길이에 걸쳐 잘 접촉되어 있는지 확인하십시오.

두 끝단을 함께 잡고 쌍을 다시 접습니다. 한쪽 끝에 형성된 루프가 꼬이지 않았는지 확인하십시오. 루프가 없는 쪽의 와이어 4개를 잘라 4개의 끝단이 일직선이 되도록 맞춥니다.

다음 단계를 위해 개조된 악어 클립, 전동 회전 장치, 그리고 회전 장치 상단의 수평 바가 필요합니다. 악어 클립은 클립 바닥에 플라스틱 바를 접착하여 개조합니다. 팁이 노출되었을 때, 개조된 악어 클립을 사용하여 네 개의 와이어를 함께 고정하십시오.

와이어 루프를 수평 바 위에 겁니다. 악어 클립을 전동 스테이지에 배치합니다. 약 3분에 걸쳐 와이어 번들을 시계 방향으로 80회 비튼 다음, 반시계 방향으로 40회 비틉니다.

이러한 매개변수는 필요에 따라 변경할 수 있습니다. tero 꼬임 작업이 완료되면, 각 각도당 중간에서 낮은 풍량의 히트건을 사용하여 세 가지 다른 각도에서 가열함으로써 와이어들을 서로 융합시키십시오. 이때 와이어 번들이 갈라지는 지점에서 1~2cm 아래부터 시작하십시오. 그런 다음 와이어에서 2cm 떨어진 거리에서 히트건을 위아래로 약 5초 동안 움직여 줍니다.

고온에서는 절연체가 완전히 녹아 단락으로 이어질 수 있으므로 주의하십시오. 전선들이 서로 융합되었다면, 악어 클립을 살짝 들어 올려 테로(tero)에 가해지는 장력을 완화하며 꼬임 장치에서 테로를 제거하고, 악어 클립 근처에서 테로를 절단하십시오. 반대쪽 끝에서는 브랜드 표시가 없는 네 개의 전선 가닥이 동일한 길이가 되도록 루프를 절단하십시오. 다음으로, 끝이 부드러운 핀셋을 사용하여 전선을 조심스럽게 구부려 상단의 개별 가닥들을 분리하십시오.

이제 tero를 마이크로 드라이브 어레이에 로드할 준비가 되었습니다. Tet road를 21~25개 더 제작하여 tero 로딩 공정을 진행할 때까지 먼지가 없는 보관함에 보관하십시오. 아직 마이크로 드라이브 어레이를 제작하지 않았다면, 완전한 어레이가 필요합니다.

당사 설계 계획의 만성 생체 내 기록용 마이크로 드라이브 어레이 제작을 위해 비디오 마이크로 전극 드라이브 어레이를 참조하십시오. tero는 한쪽 끝이 커넥터 하드웨어에 부착되며, 마이크로 드라이브의 poly mid 캐리어 튜브를 통해 통과하여 전극 팁이 마이크로 드라이브 어레이의 베이스 아래로 확장되도록 합니다. 이제 하나의 tero에 대한 이 로딩 과정을 시연하겠습니다.

시작하기 전에, 한쪽 끝은 커넥터 보드에 부착할 수 있고 다른 쪽 끝은 얼음 팬으로 고정할 수 있는 드라이브 홀더를 제작하십시오. 본 예제에서 드라이브 홀더는 X-acto 나이프 핸들의 한쪽 끝에 Milax 커넥터를 접착제로 붙여 만든 것입니다. 소프트 팁 핀셋으로 tetrode를 잡고 실체 현미경을 사용하여, micro drive 중 하나의 poly-mid 캐리어 튜브 내부로 tetrode의 팁을 밀어 넣으십시오. 개별 전극 와이어가 드라이브 어레이 상단의 커넥터 보드에 가까워질 때까지 tetrode를 튜브 안으로 밀어 넣으십시오. 이때 와이어가 꺾이거나 구부러지지 않도록 주의하십시오. 와이어가 변형되면 tetrode가 뇌에 수직이 아닌 각도로 삽입되어 tetrode의 무결성이 약화될 수 있습니다.

이제 소프트 팁 핀셋을 사용하여 네 가닥 전선의 반대쪽 끝을 전극 인터페이스 보드의 각 구멍에 조심스럽게 밀어 넣습니다. 이때 전선이 꼬이거나 꺾이지 않도록 주의하십시오. 네 가닥의 전선을 모두 배치한 후, 아래쪽 턱을 짧게 개조한 플라이어를 사용하여 금색 핀을 구멍 속으로 밀어 넣습니다.

핀을 구멍에 밀어 넣으면 전선 절연체가 벗겨지며 나중에 참조할 전기적 연결이 생성됩니다. 마이크로 드라이브와 전극 인터페이스 보드의 핀 위치 사이의 매핑을 기록하십시오. 총 18개의 tetrode 로딩을 계속 진행하십시오.

어레이에 남은 3개의 마이크로 드라이브는 기준 전극을 수용하는 데 사용됩니다. 각 기준 전극은 결합되지 않은 4개의 yn 중 하나만 사용하는 tero로 제작됩니다. 기준 전극을 부착하려면 로딩 절차를 따르되, 4개의 전극 중 하나만 커넥터 보드의 해당 기준 전극 핀에 부착하십시오.

다중 부위 기록을 계획하고 있다면, 테트로(tetro)에서 커넥터 보드로 이어지는 연결 상태를 미리 계획하는 것이 유용할 수 있습니다. 예를 들어, 하나의 해부학적 영역을 대상으로 하는 테트로들을 전극 인터페이스 보드 상에 함께 클러스터링하십시오. 이렇게 하면 실험 중에 잘못된 테트로를 조정할 가능성을 최소화할 수 있습니다.

테로 로딩이 완료되면, 동물용과 보호 콘용으로 각각 하나씩, 총 두 개의 접지선을 만듭니다. 6인치 길이의 절연 강선을 하나 자르고, 금속 핀셋을 사용하여 와이어 양 끝의 절연체를 3mm씩 제거합니다. 그런 다음 4인치 길이의 절연 강선을 하나 자릅니다.

한쪽 끝에서는 3 mm, 반대쪽 끝에서는 1 cm의 절연물을 제거하십시오. 6인치 접지선을 마이크로 드라이브 어레이 측면의 구멍을 통해 인터페이스 보드 방향으로 통과시킵니다. 노출된 전선을 금색 핀을 사용하여 지정된 접지 구멍의 전극 인터페이스 보드에 연결하십시오.

이 전선은 동물의 두개골에 연결됩니다. 4인치 길이의 접지선을 이전에 설치한 접지선과 평행하게 배치하십시오. 피복이 벗겨진 3mm 끝부분을 지정된 다른 접지 구멍의 골드 핀을 사용하여 전극 인터페이스 보드에 연결하십시오.

이 전선은 나중에 보호 콘에 연결되며, 이는 노이즈 유입을 줄이기 위한 소형 패러데이 케이지 역할을 하게 됩니다. 이제 전선 연결을 마쳤으므로 테로스(teros)를 정밀하게 다듬는 과정을 진행할 수 있습니다. 이 과정의 목표는 모든 테로스를 대상 뇌 구조의 깊이와 본 예시보다 약간 더 길게 절단하는 것입니다.

마이크로 드라이브는 성체 쥐의 많은 신피질 영역과 배측 해마에 도달하기에 충분한 5~6mm의 최대 이동 거리를 가지도록 설계되었습니다. 먼저, 모든 테트로드가 최대한 동시에 노출되도록 모든 마이크로 드라이브를 내립니다. 정교하고 날카로운 가위를 사용하여 모든 테트로드를 원하는 최종 길이보다 약 5mm 더 길게 절단하십시오.

얼음 패널에 톱니형 가위 한 쌍을 준비하고, 한쪽 손잡이를 약간 아래쪽으로 기울인 채 톱니가 위를 향하도록 고정하며 다른 쪽 손잡이는 매달려 있게 둡니다. 이제 마이크로 드라이브를 올려 모든 Tet road를 가이드 캐뉼라 안으로 완전히 회수합니다. 실체 현미경을 사용하여 하나의 tero를 캐뉼라 밖으로 완전히 확장합니다.

자를 사용하여 가이드 캐뉼라로부터 원하는 거리만큼 톱니 가위를 배치합니다. 천천히 그리고 부드럽게 한 번의 매끄러운 동작으로 tero를 절단합니다. tero를 절단한 후, 마이크로 드라이브를 3~4 mm 위로 끌어올립니다.

모든 tero가 절단될 때까지 이 과정을 반복하십시오. 이제 금 도금을 진행할 준비가 되었습니다. 금 도금.

로테로스는 장기적인 안정적 기록을 위해 매우 중요합니다. 이는 부식을 방지하고 생체 적합성을 향상시킵니다. 임피던스 측정기를 전류 발생기의 외부 모드와 오디오 출력이 활성화된 DC 확인 모드로 설정하십시오.

전류 발생기의 두 리드를 각 tero 내의 가능한 6가지 채널 쌍에 접촉시키고, 오디오 피드백을 통해 쌍 사이에 단락이 존재하는지 확인하십시오. 채널 쌍 간의 단락은 다음과 같이 들립니다. 단락이 존재할 경우, 톱니형 가위로 tero를 다시 절단하고 다시 테스트하십시오.

문제가 지속되면 Tet road를 폐기하고 교체하십시오. 모든 마이크로 드라이브를 아래로 이동시켜 모든 Tet road를 가능한 한 최대한 길게 확장하십시오. 전극 임피던스 확인을 위해 장비 구성을 수정하십시오.

이제 모든 테로(tero)의 팁을 표준 금 도금 용액에 담급니다. 금 도금조는 임피던스 측정기의 음극 리드선에 전기적으로 연결되어 있습니다. 임피던스 측정기의 양극 리드선을 커넥터 보드의 해당 핀에 접촉시켜 전극의 임피던스를 확인하십시오.

마이크로 드라이브 어레이의 모든 전극 와이어의 임피던스를 측정하고 기록하십시오. 전류 발생기 기준 정상 수치 범위는 1~3 MΩ입니다. 전류를 1~3 µA 사이로 설정하십시오.

다음으로 안전하게 연결합니다. 임피던스 측정기의 양극 리드를 커넥터 보드의 핀에 연결합니다. 임피던스 측정기에서 수행합니다.

바이패스 모드 상태에서 일반 모드와 바이패스 모드를 빠르게 전환하십시오. 전류가 Tet 도로와 금 용액을 통해 흐르게 되며, 전극 팁에 금이 도금됩니다. 각 도금 회차 후의 임피던스는 이전보다 낮아져야 합니다.

현재 펄스를 반복하십시오. 임피던스가 1 MΩ 미만으로 떨어지지 않은 경우입니다. 허용 가능한 임피던스의 보수적인 범위는 250 kΩ에서 350 kΩ 사이입니다.

임피던스가 200 kilo ohms 미만으로 떨어지면 단락(short circuit)이 발생했을 가능성이 있습니다. 반복적인 펄스 가함 후에도 임피던스가 충분히 떨어지지 않는다면, 전극 팁이 막혔을 수 있습니다. tero를 다시 절단하여 단락 여부를 확인하고 금 도금 공정을 반복하십시오.

재절단으로 해결되지 않을 경우, tero를 교체하고 다시 시작하십시오. 모든 tero의 플레이팅이 완료되면, 에탄올에 담근 후 3~5분 동안 건조시키십시오. tero 팁이 공기에 노출된 상태에서 전류 발생기를 사용하여 tero 내부의 단락 여부를 테스트하십시오.

두 개 이상의 tero 전극 사이에 DC 연결이 존재하는 경우, tero를 다시 절단하고 금 도금을 다시 수행하십시오. 모든 tero의 금 도금이 완료되면, 모든 tero를 드라이브로 이동시키십시오. 마지막 단계로, 각 마이크로 드라이브 상단에서 각 tero와 폴리 튜브의 인터페이스에 중간 두께의 cyanoacrylate 접착제를 한 방울씩 추가하십시오.

이렇게 하면 tero가 마이크로 드라이브에 고정됩니다. 보호 커넥터의 목적은 마이크로 드라이브와 노출된 tero 와이어를 외부 환경으로부터 보호하는 것입니다. 또한 실험 중 조작 시 지지대 역할을 하며 전기적 노이즈를 줄여줍니다.

본 실험에서는 3D 프린터로 제작된 플라스틱 콘을 사용합니다. 하지만 구부린 음료수 캔 조각과 같은 다른 재료로 콘을 제작하는 것도 가능합니다. 플라스틱 콘의 내면이나 외면에 알루미늄 호일 테이프를 부착하여 고정할 수 있습니다.

먼저 드라이브 어레이를 매단 상태에서 3/16인치 길이의 72 사이즈 나사 3개를 원뿔의 측면에 삽입하고 부분적으로 돌려 고정합니다. 원뿔을 드라이브 위에 끼웁니다. 두 접지선이 드라이브 어레이 하단으로 뻗어 있는지 확인하십시오.

4인치 접지선의 노출된 부분을 1 72 나사 중 하나에 여러 번 감은 다음 나사를 조여 고정하십시오. 나머지 두 개의 콘 나사를 조여 콘을 드라이브 베이스에 단단히 고정합니다. 이제 마이크로 드라이브 어레이 제작이 완료되었습니다. 제작된 마이크로 드라이브 어레이에는 3개의 레퍼런스에 18개의 테로가 적재되어 있습니다.

내구성을 위해 보호용 콘과 캡으로 감싸져 있습니다. 완성된 드라이브의 무게는 평균적으로 보통 20에서 25g입니다.

완성된 드라이브 어레이는 표준 수술 절차를 통해 이식됩니다. 보시는 바와 같이, 드라이브는 프리앰프 칩과 데이터 수집 하드웨어 및 소프트웨어로 신호를 전달하는 와이어 번들에 연결되어 있습니다. 지금까지 teros를 제작하고 마이크로 드라이브 어레이 구축 절차를 완료하는 방법을 살펴보았습니다.

이 영상에서는 teros를 제작하고, in vivo 기록을 위해 teros를 장착 및 컨디셔닝하는 방법을 보여드렸습니다. 또한, 마이크로 드라이버 어레이에 원뿔형 구조물을 추가하여 시간이 지나도 견고하게 유지하는 방법을 설명하였습니다. 마이크로 드라이버 어레이 제작 과정에는 많은 단계가 포함되어 있으므로, 인내심을 가지고 전극을 조심스럽게 다루며 모든 중간 단계가 적절히 완료되었는지 확인하시기 바랍니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.