인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

이 절차는 인플루엔자의 잔해물을 제거하는 것으로 시작됩니다. 원심분리에 의한 바이러스 용액. 그런 다음 바이러스 막은 세제로 파괴되고 VR nps로의 방출은 글리세롤 구배에서 분리됩니다.

그래디언트에서 원심분리 분획을 수집하고 각 분획의 부분 표본을 실행합니다. SDS 페이지에서 V NPS를 포함하는 V nps 분획을 포함하는 피크 분획을 결정하기 위해 kumasi blue로 염색된 겔을 원심분리에 의해 농축하고 정제된 VRP를 구리 TEM 표본 그리드에 적용한 다음 투과 전자 현미경으로 VRP를 시각화하기 위해 음극으로 염색합니다. 안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 동물학과의 넬리 페인 박사 연구실에 있는 WinCo Wu입니다.

저는 이전에 Pane Lab에서 근무했던 Lindsay Weaver입니다. 오늘 우리는 바이러스성 갈비뼈 핵 단백질 복합체인 인플루엔자를 정제하는 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 조직 배양 세포에서 인플루엔자, A 바이러스의 핵 수입을 연구합니다.

시작하겠습니다. 실험을 시작하여, 750마이크로리터의 MNT 버퍼를 11mm x 34mm 크기의 Beckman 폴리카보네이트 원심분리 튜브 1개에 넣습니다. 다음으로, 인플루엔자 A 바이러스의 밀리리터당 2밀리그램 용액 500마이크로리터를 튜브 피펫에 여러 번 첨가하여 바이러스를 MNT 완충액과 혼합합니다.

혼합 후 튜브를 A TLA one 20.2 로터에 넣고 Beckman Optima max E 원심분리기에 원심분리기를 섭씨 4도에서 109, 000배 G로 10분 동안 놓습니다. 스핀이 완료되면 상등액을 제거한 다음 펠릿을 500 마이크로 리터 파괴 완충 와류에 현탁시킵니다. 재현탁액을 격렬하게 부유시킨 다음 einor 온도 혼합기에서 섭씨 31도에서 20분 동안 흔듭니다.

진탕이 완료되면 글리세롤 구배 침전물 속도 원심분리를 진행합니다. 글리세롤 그라디언트를 준비하려면 다음 글리세롤을 Beckman UltraClear 13mm x 51mm 원심분리 튜브에 넣고 1밀리리터 70% 부피 글리세롤 0.75밀리리터 50%글리세롤 0.375밀리리터, 글리세롤 40%, 글리세롤 1.8밀리리터, 글리세롤 33%를 넣습니다. 이 글리세롤 용액은 순수 글리세롤과 NM 완충액을 혼합하여 만듭니다.

또한 글리세롤과 완충액을 모두 포함하는 밸런스 튜브를 준비합니다. 그런 다음 파괴된 바이러스 샘플을 다시 와류로 가열하고 글리세롤 구배에 로드합니다. 튜브를 Beckman MLS 50 스윙 버킷 로터에 넣고 섭씨 4도에서 217, 000배 G에서 3시간 45분 동안 그래디언트를 원심분리합니다.

원심분리가 완료된 후 튜브 상단부터 시작하여 그래디언트의 250마이크로리터 분취량을 수동으로 수집합니다. 분획을 얼음 위나 섭씨 4도로 보관하십시오. 일단 분획이 수집되면, 우리는 SDS 많은 아크릴아미드 젤 전기 이동법을 사용하여 그(것)들을 분석하게 준비되어 있습니다.

SDS 페이지 분석을 시작하려면 각 분획에서 새 튜브로 20마이크로리터를 제거합니다. 다음 5 시간 SDS 페이지 표본 완충기의 5개의 마이크로리터를 추가하고, 5 분 동안 95 섭씨 온도에 가열하십시오 가열 후에, 표본을 짧게 회전시키고 10%Poly 아크릴아미드 젤에 그(것)들을 적재하십시오 우물의 한에 있는 분자량 감적을 포함하십시오. 다음으로, 브롬 페놀 블루 로딩 염료가 젤 바닥 가까이에 도달할 때까지 샘플을 겔을 통해 실행합니다.

SDS 페이지 장치에서 젤을 제거하고 젤을 쿠마시 블루로 염색합니다. 염색 결과를 바탕으로 주로 인플루엔자를 포함하는 분획을 식별합니다. 핵 단백질.

인플루엔자 A NP는 크기가 약 56킬로달톤이며 바이러스 리보핵단백질 복합체에서 발견되는 주요 단백질입니다. 따라서 NP 대역은 일반적으로 VRN ps를 포함하는 분수에서 가장 강한 대역입니다. 다음 부분에서는 이러한 VRNP 분획을 농축합니다.

주로 NP를 함유하는 글리세롤 분획을 결합하고 두 개의 Beckman 11mm x 34mm 폴리카보네이트 원심분리기 튜브에 분배하고 각 튜브에 에틸 피로 탄산염 또는 DEPC 처리된 초순수를 채웁니다. 그런 다음 피펫을 위아래로 여러 번 사용하여 혼합합니다. 튜브를 Beckman TLA 20.2 로터 1개에 넣고 섭씨 4도에서 157, 000배 G로 4시간 30분 동안 원심분리기를 놓습니다.

스핀이 완료되면 상등액을 제거하고 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 50마이크로리터의 DEPC 처리수 분취액에서 정제된 V NPS는 하나의 분취액을 따로 보관하고 나머지는 섭씨 음의 80도에서 저장합니다. 이제 VRP의 음성 염색을 진행할 준비가 되었습니다.

정제된 VRNP 1마이크로리터를 새로 만들고 두 번 여과한 PBS 버퍼 글로우 9마이크로리터로 희석하여 구리 TEM 시편 그리드를 30초 동안 방전합니다. 이 그리드는 이전에 Parlow Dion과 탄소 필름으로 코팅되었습니다. 핀셋을 사용하여 갓 빛나는 방전 표본 그리드를 잡고 희석된 VRNP를 5마이크로리터 방울로 표본 그리드에 떨어뜨립니다.

기다리는 동안 8분 동안 방울이 그리드에 흡수되도록 합니다. 트레이에 작은 퍼퓸 스트립을 놓은 다음 각각 10마이크로리터의 PBS 버퍼가 들어 있는 두 방울과 1%암모늄 멜리 데이트로 구성된 갓 만든 염색 용액 80마이크로리터 방울을 퍼퓸에 떨어뜨립니다. 이제 총 1분 동안 PBS 두 방울로 조심스럽게 내려 표본 그리드를 세척합니다.

그런 다음 여과지 조각을 사용하여 표본 그리드를 건조시키지 않고 표본 그리드에서 샘플 용액의 일부를 흡수합니다. 시편 그리드에서 마지막 완충액 한 방울을 흡수한 직후, 시편 그리드를 염색 방울 내에 완전히 잠겼습니다. 그리고 1분 정도 기다립니다.

1분 후 새 여과지를 사용하여 시편 그리드에서 얼룩 용액을 완전히 흡수합니다. 관찰하기 전에 표본 그리드를 몇 분 동안 자연 건조시키십시오. 투과 전자 현미경에서 다음은 음으로 염색된 V nps의 대표적인 투과 전자 현미경 이미지입니다.

여기에서 볼 수 있듯이 V NPS는 길이가 약 30나노미터에서 120나노미터인 다양한 길이의 막대 모양의 입자와 유사합니다. 올리고머 NP는 NP 분자의 사슬로 구성되어 있으며, 이는 이중 나선형 반복 구조로 더 접혀 있습니다. 따라서 이러한 막대 모양의 입자의 양쪽 끝에 있는 고리가 때때로 보일 수 있습니다.

지금까지 인플루엔자를 정화하고 시각화하는 방법을 보여드렸습니다. 바이러스성 갈비뼈 핵단백질 복합체 이 절차를 수행할 때. 음성 염색을 위해 소변기 아세테이트를 사용하는 경우 VR mps를 희석할 때 PBS를 사용하지 않는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.