Name: 인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 학습하세요 인플루엔자 A 바이러스 vRNP 정화 및 투과전자현미경 시각화 방법을. 원심분리와 글리세롤 농도구배를 활용한 이 기법은 바이러스 구조 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI), 보건 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소와 자연 과학 및 캐나다 공학 연구 협의회 (NSERC)에서 보조금에 의해 지원되었다.

1 부 : 인플루엔자의 파괴 Virion <ol><li> 베크맨 옵티마에서 사용할 TLA - 120.2 로터에 맞게 설계된 하나 베크맨 폴리 카보 네이트 원심 분리기 튜브 (11mm X 34mm)로 MNT 버퍼의 750 μl (20 MM MES, 150 MM NaCl, 30 MM 트리스, 산도 7.5)를 추가 최대 - E의 초원 심 분리기. </li><li> 그 튜브로, 인플루엔자 바이러스 (2 MG / ML H3N2 X - 31 A/AICHI/68 변형) 500 μl를 추가합니다. 몇 시간을 아래와 pipetting하여 MNT 버퍼와 바이러스를 섞는다. </li><li> TLA - 120.2 로터를 사용하여 베크맨 옵티마 최대 - E의 원심 분리기에서 109,000 XG, 4 ° C에서 10 분 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 제거하고 500 μl 중단 버퍼의 펠릿 (100 MM KCl, 5 MM MgCl 2, 5 % (W / V) 글리세롤, 50 MM의 octylglucoside, 10 MG / ML lysolecithin, 1.5 MM dithiothreitol, 100 MM MES를 resuspend 산도 5.5). </li><li> 와동 적극적으로, 그리고 31 흔들 ° C를 eppendorf thermomixer에 20 분. </li></ol> 2 부 : 글리세롤 기울기 세디먼트 속도 원심 분리 <ol><li> 1 ML 70% (V / V) 글리세롤, 0.75 ML 50 % 글리세롤, 0.375 ML 40 % 글리세롤, 그리고 1.8 : 베크맨 ultraclear의 원심 분리기 튜브 (13mm X 51mm)를로 글리세롤의 다음과 같은 금액을 배치하여 글리세롤 기울기 준비 ML 33 % 글리세롤. 글리세롤 솔루션은 NM 버퍼 (150 MM NaCl, 50 MM MES, 산도 5.5)와 순수한 글리세롤을 혼합하여 만들어집니다. 또한 글리세롤과 버퍼를 모두 포함하는 균형 튜브를 준비합니다. </li><li> 소용돌이 다시 바이러스 샘플을 중단하고, 글리세롤 기울기에 그것을로드합니다. </li><li> 베크맨 MLS - 50 스윙 - 물통 회전자에 217,000 XG, 4 ° C에서 3.75 시간 동안 그라데이션을 원심 분리기. </li><li> 원심 분리가 완료되면 수동으로 튜브의 상단에서 시작 그라디언트 250 μl aliquots를 수집합니다. ° C. 얼음이나 4 분수 유지 </li></ol> 파트 3 : SDS의 Polyacrylamide 젤 전기 영동에 의해 글리세롤의 그라데이션 분수 분석 <ol><li> 각 분획에서 신선한 튜브 20 μl를 제거합니다. </li><li> 5 배 SDS - PAGE 샘플 버퍼의 5 μl를 추가합니다. </li><li> 95 열 ° C 5 분. </li><li> 간단히 샘플을 스핀 다운하고 10 % polyacrylamide 젤로 그들을로드하고, 우물 중 하나 분자량 마커를 포함합니다. </li><li> bromphenol 블루 로딩 염료가 젤 하단에 가까운 도달 때까지 겔에서 샘플을 실행합니다. </li><li> 쿠매시과 청색의 젤 얼룩. </li></ol> 파트 4 : vRNP 분수의 농도 <ol><li> 주로 NP가 들어있는 글리세롤의 분수를 선택, 그들을 결합, 두 베크맨 폴리 카보 네이트 원심 분리기 튜브 (11mm X 34mm)로 그들을 배포합니다. </li><li> 디에틸 pyrocarbonate (DEPC) 처리된 Ultrapure 물, 그리고 pipet 위아래 섞어 여러 번 각 튜브를 입력합니다. </li><li> 베크맨 TLA - 120.2 로터에 157,000 XG, 4 ° C에서 4.5 시간 동안 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 제거하고, DEPC - 처리된 물을 50 μl의 펠렛을 resuspend. </li><li> 원하는 경우, 집중 vRNPs의 280도 측정할 수 있습니다. NP는 풀링된 분수의 주요 구성 요소 존재로서, NP의 molarity의 견적가 55,350 자사의 흡광 계수 M -1 cm -1 (같은 ProtParam 3를 통해 결정)를 사용하여 계산하실 수 있습니다. </li><li> 나누어지는 정화 vRNPs을하고, 그들 ° C 나중에 사용하기 위해 -80에서 냉동 보관합니다. </li></ol> 제 5 부 : vRNPs의 음성 스테 이닝 <ol><li> 9 μl로 정화 vRNP 1 μl를 희석 갓 만든 여과 - 두 번 MNT 버퍼 (20 MM MES, 150 MM NaCl, 30 MM 트리스, 산도 7.5). 다른 버퍼는 또한 vRNPs을 희석하고 표본 그리드 (단계 5.5) 씻어 확인을하지만, uranyl 아세테이트가 부정적인 얼룩에 사용하는 경우 PBS를 사용하지 마십시오. </li><li> 30 초 동안 parlodion 탄소 필름으로 이전 코팅 글로우 방전 표본 (구리 TEM)은 그리드. </li><li> 핀셋으로 신선한 형광 방전 표본 격자를 보유하고 표본 격자에 희석 vRNP의 5 μl 드롭을 적용합니다. </li><li> 팔분을위한 그리드에 시편의 드롭를 남겨주세요. </li><li> 기다리는 동안 벤치에 Parafilm의 작은 스트립을 배치, 10 μl MNT 버퍼의 각 (격자를 씻어), 그리고 갓 만든 얼룩 솔루션의 80 μl 드롭 (1 % 암모늄 molybdate 또는 1을 포함하는 두 방울을 분배 Parafilm에 %의 uranyl 아세테이트). </li><li> 흡착의 8 분 후에, 필터 종이로 표본 그리드 (삼각형으로 잘라)에서 샘플 솔루션의 일부를 심지. 표본의 격자가 건조시키지 마십시오. </li><li> 일분의 총 시간을위한 10 μl MNT 버퍼를 각각 포함하는 두 방울의 표본 격자를 씻으십시오. 이것은 신중하게 드롭에 표본 그리드를 낮추고, 그리고 필터 종이로 표본 그리드 (표본 그리드 건조 아무말도없이)에서 샘플 솔루션의 일부를 위킹 통해 이루어집니다. </li><li> 즉시 표본 격자에서 버퍼의 마지막 한 방울을 위킹 후, 완료정의 잠수함은 표본의 얼룩 비말 내에서 격자 1 잠깐 만요. </li><li> 완전 필터 종이로 표본 그리드에서 얼룩 솔루션을 심지. </li><li> 전송 전자 현미경으로 관찰하기 전에 몇 분 동안 공기 건조 표본의 격자를 허용합니다. </li></ol> 6 부 : 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_1/1105_Figure2.png" alt="그림 2" width="600" height="215" /> 그림 1 독감 NP (~ 56 KDA)와 같은 바이러스성 ribonucleoprotein의 단지에있는 주요 단백질은, NP 밴드는 일반적으로 vRNPs (그림 1)이있는 분수에서 가장 강한 밴드이다. NP 이외에도, 각 인플루엔자 vRNP 또한 trimeric RNA 효소 (82, 86 및 86.5 KDA의 분자 가중치) 복합의 사본을 포함하고 있습니다. 이것은 수 또는 풍부가 낮은 NP의 비교이기 때문에 쿠매시 푸른 얼룩으로 표시되지 않을 수 있습니다. polymerases 그러나, 대신에 얼룩 Commassie 파란색의 경우, 은색이 젤이 수행되는 중 얼룩 검색하실 수 있습니다. 독감 매트릭스 단백질 M1은 (~ 28 KDA) NP 단백질 피크 분수가 존재하는 분수에 최소한 존재해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_2/1105_3.png" alt="그림 3" width="600" height="360" /> 그림 2 전송 전자 현미경 하에서 시각으로 부정 묻은 vRNPs 길이가 120 나노미터 (그림 2A)에 약 30 nm의 아르 가변 길이 막대 모양의 입자 유사 vRNPs를 얻을 것입니다. oligomeric NP가 더욱 더블 헬리컬 반복 구조로 접혀 있습니다 NP 분자의 체인으로 구성되어 있습니다, 이러한 막대 모양의 입자 중 하나를 끝에 고리 때로는 (그림 2B) 볼 수 있습니다.

<ol><li>Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+microinjected+influenza+virus+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins.</a> Virology. 202, 1028-1033 (1994).</li>
<li>Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+the+nuclear+localization+sequences+on+influenza+a+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes.</a> J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+influenza+A+viral+ribonucleoprotein+complexes+is+mediated+by+two+nuclear+localization+sequences+on+viral+nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein.</a> Virol J. 4, 49-49 (2007).</li>
<li>Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single-particle+tracking+to+study+nuclear+trafficking+of+viral+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes.</a> Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).</li>
</ol>

vRNPs의 정화가 Kemler 외. (1994)에 기술된 절차에 따라 달라집니다. 한 우리는 다른 사람들이 그들이 핵 수입을 공부 vRNPs을 분리하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 2,4,5 우리는 바이러스 게놈은 RNA로 구성되어 있기 때문에 RNase 무료 도움말 및 vRNPs을 조작 튜브의 사용을 권장하고, 따라서 RNA의 존재에서 쉽게 떨어집니다. 또한, 모든 버퍼는 RNase 무료입니다 물에하여야한다. 프로토콜은 산성 추출 (예 중단 버퍼와 글리세롤 기울기의 산도는 5.5)으로 수행되었습니다 여기에 설명되어 있습니다. 마찬가지로, 기본 추출는 MES, 트리스, pH를 7.8로 산도 5.5를 대체하여 (같은 Kemler 외. (1994) 1 설명) 수행할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>H3N2 X-31 A/AICHI/68 인플루엔자 A</td><td>Charles River Laboratories</td><td>490715</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8250</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>옥틸글루코사이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O-8001</td><td></td></tr><tr><td>리소레시틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4129</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9779</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant blue G-250</td><td>Kodak</td><td>1367796</td><td></td></tr><tr><td>diethyl pyrocarbonate (DEPC) 처리수</td><td>Invitrogen</td><td>750024</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이트</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>19481</td><td></td></tr><tr><td>몰리브덴산 암모늄</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-674</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-E 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>434491</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 로터 패키지, 스윙잉 버킷</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 로터 어셈블리, 고정각, 티타늄</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer</td><td>Lauda Brinkmann</td><td>022670000</td><td></td></tr></tbody></table>

인플루엔자 바이러스성 ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

인플루엔자 바이러스 게놈은 개별적으로 바이러스성 ribonulceoprotein 입자 (vRNPs)에 인플루엔자 핵 단백질 (NP)의 복사본이 여러 개 모여 팔 부정적 - 감각, 단일 좌초 RNA 분자로 이루어져 있습니다. 인플루엔자 vRNPs는 바이러스 봉투 안에 동봉됩니다. 그들이 호스트 핵 수송 기계에 액세스할 어디 셀 항목 동안 그러나, 이러한 vRNP의 단지는 세포질에 발표됩니다. 인플루엔자 vRNPs 및 인플루엔자 게놈의 복제의 핵 수입을 연구하기 위해서는, 그것은 바이러스의 다른 구성 요소가 이러한 프로세스를 방해하지 않도록 격리 v​​RNPs 작동하는 데 유용합니다. 여기, 우리는 인플루엔자 바이러스로부터 vRNPs 정화 절차를 설명합니다. 절차는 싸여 virion에서 vRNP 단지를 공개하기 위해 인플루엔자 세제과 virion의 장애로 시작합니다. vRNPs은 다음 인플루엔자 속도 침강에 의해 33~70% 불연속 글리세롤 기울기에 virion의 다른 구성 요소에서 분리됩니다. 글리세롤 기울기에서 얻은 분수는 다음 쿠매시과 청색의 얼룩 후 SDS - PAGE를 통해에서 분석하고 있습니다. NP가 포함된 정상 분수 그런 다음 함께 풀링 및 원심 분리에 의해 집중되고있다. 농도 후 vRNPs의 무결성은 부정적인 얼룩 후 전송 전자 현미경에 의해 vRNPs의 시각화에 의해 확인됩니다. 글리세롤 기울기 정화는 Kemler에게서의 수정입니다<em&gt; 외.</em&gt; (1994)<sup&gt; 1</sup&gt;, 그리고 부정적인 얼룩이 우에 의해 수행되었습니다<em&gt; 외.</em&gt; (2007).<sup&gt; 2</sup

인플루엔자 바이러스의 게놈은 RNA와 단백질 여덟 별도 단지, 칭했다 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스 (vRNPs)로 구성되어 있습니다. 본 논문은 글리세롤 기울기 정화 및 독감 vRNPs의 전송 전자 현미경의 시각화에 대해 설명합니다.

인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

인플루엔자 A 바이러스 게놈은 8개의 음성 가닥 단일 가닥 RNA 분자로 구성되어 있으며, 각각 여러 개의 인플루엔자 A...

본 절차는 원심분리를 통해 인플루엔자 바이러스 용액에서 모든 부유물을 제거하는 것으로 시작합니다. 그 다음 세제로 바이러스 막을 파괴하며, 방출된 vRNPs를 글리세롤 밀도 구배를 이용하여 분리합니다.기울기 원심분리 분획을 수집하고 각 분획의 일부를 분석합니다. SDS-PAGE를 수행하고 젤을 쿠마시 블루로 염색하여 V NP가 포함된 피크 분획을 결정합니다. V NP가 포함된 분획을 원심분리로 농축한 후, 정제된 VRP를 구리 TEM 시편 그리드에 도포하고, 투과전자현미경으로 VRP를 시각화하기 위해 음성 염색을 진행합니다. 안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 동물학과의 Nellie Pane 박사 연구실의 WinCo Wu입니다.저는 이전 Pane Lab 소속이었던 Lindsay Weaver입니다. 오늘은 바이러스 리보핵산단백질 복합체인 인플루엔자의 정제 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 조직 배양 세포 내 인플루엔자 A 바이러스의 핵 내 유입을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작하겠습니다. 실험을 시작하기 위해 11 mm x 34 mm Beckman 폴리카보네이트 원심분리관에 MNT buffer 750 µL를 넣습니다. 다음으로, 2 mg/mL 농도의 influenza A virus 용액 500 µL를 튜브에 추가하고, 피펫팅을 여러 번 반복하여 바이러스와 MNT buffer를 혼합합니다.혼합 후, 튜브를 TLA one 20.2 로터에 넣고 Beckman Optima max E 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 109,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 상층액을 제거한 다음, 500 µL의 파쇄 완충액(disruption buffer)에 펠렛을 재현탁하고 볼텍싱합니다. 재현탁된 펠렛을 강하게 볼텍싱한 후, einor thermo mixer에서 31 °C로 20분 동안 흔들어 섞어줍니다.교반이 완료되면 글리세롤 기울기 침강 속도 원심분리를 진행합니다. 글리세롤 기울기를 준비하려면 Beckman UltraClear 13 millimeter by 51 millimeter 원심분리 튜브에 다음과 같이 글리세롤을 넣습니다: 70% (volume by volume) GLYCEROL 1 milliliter, 50% glycerol 0.75 milliliter, 40% glycerol 0.375 milliliter, 33% glycerol 1.8 milliliters. 이 글리세롤 용액들은 순수 글리세롤을 NM buffer와 혼합하여 제조합니다.글리세롤과 완충액이 모두 포함된 평형 튜브(balance tube)도 준비합니다. 그런 다음, 파쇄된 바이러스 샘플을 다시 한번 볼텍싱하고 이를 글리세롤 기울기(glycerol gradient)에 로딩합니다. 튜브를 Beckman MLS 50 스윙 버킷 로터(swinging bucket rotor)에 넣고 4 °C에서 217,000 ×g로 3시간 45분 동안 원심분리합니다.원심분리가 완료되면, 튜브 상단부터 250 µL씩 구배액을 수동으로 분취합니다. 분취액은 얼음 위 또는 4 °C에서 보관하십시오. 분취가 완료되면, SDS poly acrylamide gel electrophoresis를 사용하여 이를 분석할 준비가 된 것입니다.SDS page 분석을 시작하려면, 각 분획에서 20 µL를 취해 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 5배 농축 SDS page 샘플 버퍼 5 µL를 첨가하고, 샘플을 95 °C에서 5분 동안 가열합니다. 가열 후 샘플을 짧게 원심 분리하여 가라앉히고, 이를 10% Poly acrylamide 젤에 로딩하며, 웰 하나에는 분자량 마커를 포함시킵니다. 다음으로, brom phenol blue 로딩 염료가 젤 바닥 근처에 도달할 때까지 샘플을 전기영동합니다.SDS page 장치에서 겔을 꺼내어 쿠마시 블루(kumasi blue)로 염색합니다. 염색 결과에 따라 주로 인플루엔자 뉴클레오단백질(nucleo protein)이 포함된 분획을 확인합니다.인플루엔자 A NP의 크기는 약 56 kilodaltons이며, 바이러스 리보핵산단백질 복합체에서 발견되는 주요 단백질입니다. 따라서 일반적으로 NP 밴드는 vRNP가 포함된 분획에서 가장 강한 밴드로 나타납니다. 다음 단계에서는 이러한 vRNP 분획을 농축하겠습니다.주로 NP를 포함하는 글리세롤 분획들을 합친 후, 이를 두 개의 Beckman 11 mm x 34 mm 폴리카보네이트 원심분리 튜브에 나누어 담고, 각 튜브를 ethyl pyro carbonate 또는 DEPC 처리된 초순수로 채웁니다. 그다음 피펫으로 여러 번 상하로 섞어줍니다. 튜브를 Beckman TLA 120.2 로터에 넣고 4 °C에서 157,000 ×g로 4시간 30분 동안 원심분리합니다.원심분리가 완료되면 상층액을 제거하고 펠렛을 재현탁합니다. 정제된 V NPS를 50 µL의 DEPC 처리된 물 분주액에 현탁한 후, 한 개의 분주액은 따로 떼어 두고 나머지는 -80 °C에서 보관합니다. 이제 VRP의 음성 염색을 진행할 준비가 되었습니다.정제된 VRNP 1 µL를 갓 제조하여 두 번 여과한 PBS 버퍼 9 µL에 희석하고, 구리 TEM 시료 그리드를 30초 동안 글로우 방전 처리합니다. 이 그리드는 이전에 Parlow Dion과 탄소 필름으로 코팅된 것입니다. 갓 글로우 방전 처리된 시료 그리드를 핀셋으로 잡고, 희석된 VRNP 5 µL 한 방울을 시료 그리드 위에 도포합니다.기다리는 동안 방울이 그리드에 흡수되도록 8분간 둡니다. 트레이에 파룸(parfum) 조각을 작게 놓은 다음, 파룸 위에 PBS 버퍼 10 µL가 포함된 방울 두 개와 1% ammonium mellite로 구성된 갓 제조한 염색액 80 µL 방울 하나를 분주합니다. 이제 시료 그리드를 두 개의 PBS 방울에 조심스럽게 담가 총 1분 동안 세척합니다.그런 다음, 시료 그리드가 마르지 않도록 주의하면서 거름종이 조각을 사용하여 시료 용액의 일부를 흡수하여 제거합니다. 시료 그리드에서 버퍼의 마지막 한 방울을 제거한 즉시, 시료 그리드를 염색액 방울 속에 완전히 담급니다. 그리고 1분 동안 기다립니다.1분 후, 새로운 거름종이를 사용하여 시편 그리드에서 염색액을 완전히 흡수하여 제거합니다. 관찰 전 시편 그리드를 수분 동안 자연 건조시킵니다. 투과 전자 현미경으로 관찰한 음성 염색된 V nps의 대표적인 투과 전자 현미경 이미지입니다.여기서 보시는 바와 같이, V NPS는 길이가 가변적인 막대 모양의 입자와 유사하며, 길이는 약 30 nanometers에서 120 nanometers 정도입니다. 올리고머 NP는 NP 분자들이 사슬 형태로 조직되어 있으며, 이는 다시 이중 나선 반복 구조로 접혀 있습니다. 따라서 이러한 막대 모양 입자의 양 끝단에서 루프 구조가 때때로 관찰될 수 있습니다.인플루엔자 바이러스 리보핵단백질 복합체(vRNP)를 정제하고 시각화하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 음성 염색을 위해 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)를 사용하는 경우 vRNP를 희석할 때 PBS를 사용하지 않는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예

인플루엔자 바이러스는 호스트 세포 염색질과 협회들의 RNA 게놈을 복제. 여기서는 감염된 세포의 염색질에서 그대로 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스를 정화하는 방법을 제시한다. 바이러스 단지 투석을하는 것은 각각 서양 얼룩 및 단백질과 RNA 내용의 프라이머 확장명을 모두에 의해 분석할 수 있습니다.

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우리는 아데노바이러스(Ad)에 감염된 인간 세포에서 바이러스 복제 구획(RC)을 분리하는 새로운 전략을 제공합니다. 이 접근법은 바이러스 게놈 복제 및 발현을 조절하는 분자 메커니즘과 RC에서 확립된 바이러스-숙주 상호 작용의 조절을 밝히는 데 도움이 될 수 있는 무세포 시스템을 나타냅니다.

아데노 바이러스에 감염된 정상적인 인간의 세포에서 바이러스 복제 구획 풍부한 하위 핵 분수의 분리

바이러스가 숙주 세포에 들어가는 동안 인플루엔자 A 바이러스 코어를 분해하는 것은 다단계 과정입니다. 우리는 바이러스 비코팅의 초기 단계를 분석하기 위한 시험관 내 방법을 설명합니다. 이 접근 방식에서는 속도 구배 원심분리를 사용하여 정의된 조건에서 코팅 해제를 시작하는 단계를 생화학적으로 해부합니다.

그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에

여기서는 배큘로 바이러스 또는 포유류 발현 시스템, 및 초 원심 정제를 사용하여 바이러스 입자의 합성을위한 프로토콜을 제시한다. 이것은 매우 최적화 방법은 안전하고 유연하게 타겟으로 백신 바이러스 항원을 확인하는 데 사용된다.

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이 연구는 설명   영상 기반의 마이크로 중화 분석은 바이러스의 항원 성 관계를 분석합니다. 이 프로토콜은 평판 스캐너를 사용하고 적정, 적정 정량, 중화, 중화 정량 등 4 단계가있다. 분석은 현재 순환 인플루엔자 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 바이러스와 함께 잘 작동합니다.

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

음이온 교환 수 지 기반 방법, 바이러스의 충돌-기반 bioaerosol 샘플링 시연 액체에 적응 합니다. 다운스트림 분자 탐지와 결합 하면 메서드 bioaerosols에서 바이러스의 손쉬운 및 민감한 감지.

Bioaerosols 음이온 교환 수 지를 사용 하 여 바이러스의 검출

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

이 기사에서는 극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 이미징된 인플루엔자 바이러스의 데이터 처리 및 혈구응집소 당단백질의 후속 서브 단층 촬영 평균화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 이미지 전처리부터 최종 모델 개선까지 단계별 데이터 처리를 다룹니다.

인플루엔자 바이러스의 극저온 전자 단층 촬영에서 혈구응집소의 서브나노미터 분해능 구조 결정

학습하세요 인플루엔자 A 바이러스 vRNP 정화 및 투과전자현미경 시각화 방법을. 원심분리와 글리세롤 농도구배를 활용한 이 기법은 바이러스 구조 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

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