인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

이 절차는 원심분리를 통해 인플루엔자 바이러스 용액에서 모든 불순물을 제거하는 것으로 시작합니다. 그 후 세제로 바이러스 막을 파괴하고, 방출된 vRNPs를 글리세롤 농도 구배를 통해 분리합니다.

구배의 원심분리 분획을 수집하고 각 분획의 일부를 분석합니다. SDS page에서 젤을 쿠마시 블루로 염색하여 V nps가 포함된 피크 분획을 결정합니다. V NPS가 포함된 분획을 원심분리로 농축하고, 정제된 VRP를 구리 TEM 시료 그리드에 도포한 후, 투과 전자 현미경으로 VRP를 시각화하기 위해 음성 염색을 수행합니다. 안녕하세요, 저는 브리티시컬럼비아 대학교 동물학과 Nellie Pane 박사 연구실의 WinCo Wu입니다.

저는 이전에 Pane Lab에서 근무했던 Lindsay Weaver입니다. 오늘은 바이러스 리보핵단백질 복합체인 인플루엔자의 정제 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 조직 배양 세포 내 인플루엔자 A 바이러스의 핵 수입을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 시작하겠습니다. 실험을 시작하려면 750 µL의 MNT 버퍼를 11 mm x 34 mm Beckman 폴리카보네이트 원심분리 튜브에 넣습니다. 다음으로, 2 mg/mL 농도의 인플루엔자 A 바이러스 용액 500 µL를 튜브에 넣고, 피펫으로 여러 번 흡입 및 배출하여 바이러스를 MNT 버퍼와 혼합합니다.

혼합 후, 튜브를 TLA one 20.2 로터에 넣고 Beckman Optima max E 원심분리기로 4 °C에서 109,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 제거한 다음, 500 µL의 disruption buffer에 펠릿을 재부유시키고 vortex로 격렬하게 혼합합니다. 그 후 Eppendorf thermo mixer를 사용하여 31 °C에서 20분 동안 흔들어 섞어줍니다.

교반이 완료되면 글리세롤 밀도 구배 침강 속도 원심분리를 진행합니다. 글리세롤 구배를 준비하려면, Beckman UltraClear 13 millimeter by 51 millimeter 원심분리 튜브에 다음과 같이 글리세롤을 넣습니다: 70% volume by volume GLYCEROL 1 milliliter, 50% glycerol 0.75 milliliter, 40% glycerol 0.375 milliliter, 그리고 33% glycerol 1.8 milliliters. 이러한 글리세롤 용액은 순수 글리세롤을 NM 버퍼와 혼합하여 제조합니다.

글리세롤과 완충액을 모두 포함하는 균형 튜브(balance tube)도 준비하십시오. 그다음 파쇄된 바이러스 샘플을 다시 볼텍싱하고 글리세롤 밀도 구배(glycerol gradient)에 로딩하십시오. 튜브를 Beckman MLS 50 스윙 버킷 로터에 넣고 4 °C에서 217,000 ×g로 3시간 45분 동안 원심분리하십시오.

원심분리가 완료되면, 튜브의 상단부터 250 µL씩 기울기 분획을 수동으로 수집합니다. 수집한 분획은 얼음 위 또는 4 °C에서 보관하십시오. 분획 수집이 완료되면 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 사용하여 분석을 진행할 준비가 된 것입니다.

SDS-PAGE 분석을 시작하려면, 각 분획에서 20 µL를 취해 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 5배 농도의 SDS-PAGE 샘플 버퍼 5 µL를 추가하고, 샘플을 95 °C에서 5분 동안 가열합니다. 가열 후 샘플을 짧게 원심 분리하고 10% Polyacrylamide 겔에 로딩하며, 웰 하나에는 분자량 마커를 포함시킵니다. 다음으로, 브롬페놀 블루(brom phenol blue) 로딩 다이가 겔 바닥 근처에 도달할 때까지 샘플을 전기 영동합니다.

SDS page 장치에서 겔을 제거하고 Coomassie blue로 겔을 염색합니다. 염색 결과를 바탕으로 인플루엔자 뉴클레오단백질(nucleoprotein)이 주로 포함된 분획을 확인합니다.

인플루엔자 A NP는 크기가 약 56 kilodaltons이며, 바이러스 리보핵단백질 복합체에서 발견되는 주요 단백질입니다. 따라서 NP 밴드는 일반적으로 vRNP가 포함된 분획에서 가장 강한 밴드로 나타납니다. 다음 단계에서는 이러한 vRNP 분획을 농축하겠습니다.

주로 NP를 포함하고 있는 글리세롤 분획들을 합치고, 이를 두 개의 Beckman 11 mm x 34 mm 폴리카보네이트 원심분리 튜브에 나누어 담은 후 각 튜브를 ethyl pyro carbonate 또는 DEPC 처리된 초순수로 채웁니다. 그다음 파이펫으로 여러 번 흡입 및 배출하여 혼합합니다. 튜브를 Beckman TLA 120.2 로터에 넣고 4 °C에서 157,000 ×g로 4시간 30분 동안 원심분리합니다.

원심분리가 완료되면 상층액을 제거하고 펠렛을 재현탁합니다. 정제된 V NPS를 50 µL의 DEPC 처리수로 분주하여, 한 분주액은 따로 떼어 놓고 나머지는 -80 °C에서 보관합니다. 이제 VRP의 음성 염색을 진행할 준비가 되었습니다.

1 µL의 정제된 VRNP를 갓 제조하여 두 번 여과한 PBS 버퍼 9 µL에 희석하고, 구리 TEM 시편 그리드를 30초 동안 글로우 방전(glow discharge) 처리합니다. 이 그리드는 이전에 Parlow Dion 및 탄소 필름으로 코팅된 상태여야 합니다. 갓 글로우 방전 처리된 시편 그리드를 핀셋으로 잡고, 희석된 VRNP 5 µL 한 방울을 시편 그리드 위에 도포합니다.

기다리는 동안 액적(drop)이 그리드에 흡수되도록 8분간 둡니다. 파라필름(parfum) 작은 조각을 트레이에 놓고, 그 위에 PBS 버퍼 10 µL씩 담긴 두 개의 액적과 1% ammonium melidate로 구성된 갓 제조한 염색액 80 µL 액적 한 개를 분주합니다. 이제 시료 그리드를 두 개의 PBS 액적 속에 조심스럽게 담가 총 1분 동안 세척합니다.

그다음 거름종이 조각을 사용하여 시료 그리드가 마르지 않도록 주의하며 그리드에서 시료 용액의 일부를 흡수하여 제거합니다. 시료 그리드에서 버퍼의 마지막 한 방울을 제거한 직후, 그리드를 염색액 방울 속에 완전히 담급니다. 그리고 1분 동안 대기합니다.

1분 후, 새로운 여과지를 사용하여 시편 그리드에서 염색액을 완전히 흡수하여 제거합니다. 관찰 전 시편 그리드를 수 분 동안 공기 중에서 건조시킵니다. 투과 전자 현미경으로 관찰한 음성 염색된 V nps의 대표적인 투과 전자 현미경 이미지들이 여기 있습니다.

여기서 보시는 바와 같이, V NPS는 길이가 약 30 nanometers에서 120 nanometers까지 다양하며 막대 모양의 입자와 유사합니다. 올리고머 NP는 NP 분자들의 사슬 형태로 구성되어 있으며, 이는 다시 이중 나선 반복 구조로 접혀 있습니다. 따라서 이러한 막대 모양 입자의 양 끝단에서 루프 구조가 때때로 관찰될 수 있습니다.

인플루엔자 바이러스 리보핵단백질 복합체(viral ribonucleoprotein complexes)를 정제하고 시각화하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 음성 염색을 위해 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)를 사용하는 경우 VRNP를 희석할 때 PBS를 사용하지 않는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.