Drosophila의 애벌레의 NMJ에서 시냅틱 후보를 녹음 Electrophysiological 방법

Joof 유충 신경근 접합부에서 안정적인 전기생리학적 기록을 생성합니다. 먼저 유충을 해부하여 기록하기 전에 체벽, 근육 및 신경계를 노출시킵니다. 중추신경계(CNS)의 기저부에 있는 축삭돌기(axons)는 복부 신경절(ventral ganglion) 후방에서 절단됩니다.

그런 다음 관심 있는 근육에 기록 전극을 놓고 신경 분포 운동 뉴런 근처에 자극 전극을 배치합니다. 운동 뉴런의 절단된 축삭돌기는 자극적인 피펫으로 빨려 들어갑니다. 그런 다음 흥분성 접합 전위를 기록할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 컬럼비아 대학의 생리학 및 세포 생물 물리학과 McCabe Lab의 Wendy MLA입니다. 오늘은 GE 용암의 신경근 접합부에서 틱 전달을 측정하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 시냅스 생리학과 신경 전달을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

시작하겠습니다. 실험을 시작하려면 떠돌이 유충과 별유충을 해부하여 체벽을 노출시킵니다. 이 프로토콜은 짧은 해부 핀을 사용하여 전기 생리학 실험을 위해 수정됩니다.

이들은 길이가 약 2-4mm이며 실험 중에 전극에서 현미경 대물렌즈에 부딪힐 가능성이 적습니다. 체벽을 노출한 후 집게를 사용하여 CNS를 잡고 약간 올립니다. 그런 다음 말초 신경 운동 축삭을 자르고 뇌를 제거합니다.

세뇌를 제거한 후 해부된 프렙을 1밀리몰 칼슘이 함유된 HL 3.1 완충액으로 두 번 세척합니다. 이제 해부가 완료되었으므로 유충 근육 세포에서 세포 내 기록을 만들 수 있습니다. 전기생리학 현미경에 박리 플레이트를 놓고 HL 3.1 버퍼와 칼슘을 준비물에 담급니다.

그런 다음 용액과 접촉하도록 수조 전극을 고정합니다. 흡입 전극은 근육을 신경 분포시키는 말초 신경을 자극하는 데 사용됩니다. 세포 내 전극이 근육에 놓일 때 진동을 피하기 위해 먼저 접시에 흡입 전극을 배치하십시오.

전극이 접시에 들어가면 6번 근육에 신경을 분포시키는 운동 뉴런 가까이에 전극을 놓습니다. 세 번째 복부 분절에서는 절단 신경이 유리 피펫 내부에 들어갈 때까지 부드럽게 흡입합니다. 흡입을 할 때 신경이 무리하지 않도록 주의합시다.

피펫이 근육에 닿지 않도록 피펫을 약간 올립니다. 그런 다음 절단된 신경 섬유를 당기지 않도록 위치를 잡습니다. 흡입 전극이 제자리에 놓이면 세포 내 녹음을 위해 기록 전극을 배치합니다.

3개의 몰 염화칼륨으로 채워진 날카로운 마이크로 전극을 사용하십시오. 기록 전극을 6번 근육의 중심 위에 놓습니다. 입력 오프셋을 조정하여 수조 용액에 대해 0을 읽습니다.

전극을 천천히 내리고 근육 표면에 닿을 때까지 높은 광학 배율로 근육에 접근합니다. 근육이 관통되었는지 확인하려면 오실로스코프를 관찰하십시오. 휴지 멤브레인 전위는 최소 음의 60밀리볼트여야 합니다.

이제 산발적인 미니어처 nplate 전위가 표시되어야 합니다. 기록 전극이 제자리에 놓이면 1분 동안 세포를 안정화시킵니다. 녹음을 시작하기 전에 축삭 클램프 2 B 증폭기의 헤드 스테이지인 축삭 HS 2를 사용하여 멤브레인 전위의 변화를 감지합니다.

액슬 클램프 2 B는 숫자 데이터를 통해 P 클램프 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 대한 인터페이스입니다. 1322 A, 신호를 디지털화합니다. PC에 멤브레인 전위를 기록합니다. 클램프 X 소프트웨어를 사용하면 모터 축삭에 자극을 가하여 흥분막 전위 또는 ejs를 생성할 수 있습니다.

ejs가 생성되면 자극 시냅스 없이 3분 동안 미니어처 ejs를 기록합니다. 소프트 미니 분석 소프트웨어를 사용하여 트레이스를 분석하고 미니 EJP 진폭 및 주파수를 결정할 수 있습니다. ejs를 생성합니다.

마스터 8 펄스 발생기를 사용하여 운동 뉴런 프로그램의 절단된 끝을 자극합니다. 0.3 밀리 초 제곱 전압 펄스 프로그램을 제공하는 발전기. 시냅스 회복을 위해 자극 사이에 5초의 간격을 둡니다.

NMJ에서는 각 근육에서 최소 10개의 유발 전위를 기록하고 진폭의 평균을 구합니다. 이 그림은 유발된 EJP 반응과 자발적인 미니 EJ.PS 를 가진 야생형 살 유충의 6번 근육에서 기록된 일반적인 흔적을 보여줍니다. 우리는 방금 초파리 용암의 신경근 접합부에서 cy potentials를 기록하는 방법을 보여주었습니다. 이 절차를 수행할 때는 3분에서 10분 이내에 해부를 완료하고 세포가 여전히 건강하고 반응할 때 즉시 전기생리학적 기록을 시작하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

해부에 너무 오래 걸리면 근육 세포의 휴지막 전위가 마이너스 60밀리볼트 미만이 되어 기록하기에 너무 낮습니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.