Name: Astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-26T23:27:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 배우세요 대뇌해마 성상교세포-신경세포 공배양 준비 및 세포내 칼슘 역학 측정 방법을. 전반사 및 형광현미경을 활용한 이 기법은 신경과학 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 일본의 우에하라 기념 재단 (ES)을뿐만 아니라 화이트홀 재단, 신경 장애 및 뇌졸중과 스테인 - 오펜 하이머 엔다우먼트 수상 (BSK)을 국립 연구소에 의해 지원되었다.

실험 절차 실험 절차는 다음 단계 현명한 방식으로 설명하는 두 가지 핵심 부분으로 구성됩니다. 1 부 : 준비 HIPPOCAMPAL ASTROCYTE 문화 간단히 혼합 hippocampal astrocyte - 신경 세포의 문화가 잘 설립 프로토콜 1,2,3을 사용하여 준비되었습니다. 우리는 건강 교양 astrocytes를 얻을 수있는 절차를 최적화. 아래에 나열된 모든 절차는 이러한 층류 후드로 멸균 환경에서 수행되어야합니다. 준비 coverslips <ul><li> 22mm의 coverslips (VWR, 48380-068) </li><li> 폴리 - D - 라이신 (PDL, 시그마 P0899), aliquots (1 MG / ML) </li><li> Laminin aliquots가 (20 μg / ML) : 1 MG / ML laminin 솔루션 (시그마 L2020)에 멸균 물의 49 ML을 추가, -20 ° C에서 1.2 ML aliquots 및 저장을 </li></ul><ol><li> (50 μg / ML) 멸균 물의 PDL을 풀다 </li><li> coverslips을 압력솥, PDL의 살균 물과 장소 (100 coverslips 20 ML)로 헹굼. 하룻밤 상온에서 둡니다. </li><li> 멸균 물 (3 광범위한 세척)와 PDL을 바꿉니다. 그런 다음 4 coverslips하고 저장 ° C. 건조 </li><li> 6 잘 플레이트 (무균 Bioscience BD의 뚜껑과 Multiwell는 플랫 - 바텀 플레이트)에 대한 살균 잘에 astrocytes, 장소 개별 coverslips을 도금 전날. 각 coverslip에 laminin 400 μl를 넣고 증발을 방지하기 위해 인큐베이터에서 밤새 품어. </li></ol> 해부 해부 미디어 : <ul><li> 500 ML 얼의 밸런스드 소금 솔루션 (EBSS) (1X), 액체 (Invitrogen, 14155-063) </li><li> 5 ML HEPES 용액 (시그마, H0887) </li></ul> Hippocampal 미디어 : <ul><li> 412.5 ML 최소 필수 중간 (멤) (1X)은 액체가 얼의 염분을 포함하지만 L - 글루타민 또는 페놀 레드 없음 (Invitrogen, 51200-038) </li><li> 10 ML 포도당 (시그마, D - (+) - 포도당 무수 시그마 ULTRA G7528) 멤 1 M </li><li> 5 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신 (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 5 ML 나트륨 pyruvate 솔루션 (시그마, S8636) </li><li> 12.5 ML HEPES 용액 1 M (시그마, H0887) </li><li> 5 ML N - 2 보충 (100X), 액체 (Invitrogen, 17502-048) </li><li> 50 ML 호스 세럼, 열 Inactivated (Invitrogen, 26050-088) </li></ul> Papain 솔루션 : <ul><li> 워싱턴 PAPAIN - 022 유리병 (LK003178, 최종 농도가 20 U / ML)로 해부 미디어의 5 ML 추가 37 60 분 ° C 품어. </li></ul><ol><li> P1 (일반적으로이 새끼) 국가 규정 및 지역 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 vetted 및 승인 지침에 따라 세 쥐 새끼 목을 벨. </li><li> 감기 해부 미디어 가득 배양 접시에있는 피부와 두개골과 장소의 두뇌를 제거합니다. </li><li> meninges을 제거, 두 반구를 해부하다하고 hippocampi을 해부하다. </li><li> 37 papain 솔루션 ~ 1X1 mm 조각 소화 ° C 11-13 분에 hippocampi 잘라. </li><li> 조직의 조각이 정착되면, 제거 신중하게 papain과 효소의 모든 흔적을 제거하는 hippocampal 매체의 5 ML를 추가합니다. hippocampal 매체 (2 ML)에서이 단계와 resuspend를 반복합니다. </li><li> 점차적으로 더 작은 한거죠 (1000 μm의 ~ 500 μm의와 ~ 300 μm의)의 세 불꽃 - 광택 pipettes로 남아 대단히 짧은 시간은 없습니다 때까지 세포 ~ 5 번 씹다. </li><li> 일단 triturated, 셀 스트레이너 (기공 크기, 70 μm의, BD Bioscience)를 통해 세포를 전달합니다. 정지 10 μl의 세포를 계산합니다. 400000 세포 / ML을 위해 hippocampal 매체의 볼륨을 조정합니다. </li><li> coverslips에서 laminin을 기음과 coverslip 당 세포 현탁액의 표지가 건조하기 전에 판 200 μl. </li><li> 그들이 인큐베이터에서 60 분 부착 후 잘 당 hippocampal 중간 2 ML을 추가할 수 둡니다. </li><li> 다음 날, 죽은 세포와 찌꺼기를 제거하고 미리 예열 신선한 hippocampal 중간 2 ML을 추가하려면 이전 hippocampal 매체를 대기음. </li></ol> 유지 Neurobasal 미디어 : <ul><li> 500 ML neurobasal (Invitrogen, 12348-017) </li><li> 10 ML B27 혈청 무료 보충 (Invitrogen, 17504-044) </li><li> 5 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신 (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 1.25 ML L - 글루타민 (Invitrogen, 25030-149) </li></ul> 도금 후 사일 시작 neurobasal 매체와 astrocyte - 뉴런 문화 일주일에 두 번 먹이. 온도와 CO 2를 평형에 통풍이 플라스크에 인큐베이터에서 30 분 대한 미디어 Preincubate. 2 부 : 칼슘 이미징 Hippocampal 레코딩 버퍼 : 110 MM NaCl, 5.4 MMKCl, 1.8 MM CaCl 2, MgCl 2 0.8 MM 10 MM D - 글루코오스, 10 MM HEPES (시그마의 모든 화학 물질) 산도 7.4 (NaOH로 조정). astrocytes에 칼슘 지표 염료를 로딩 <ol><li> (Invitrogen, DMSO 2.5 μm의 Fluo - 4 AM (Invitrogen, F - 14217)와 0.05 %의 Pluronic ® F - 127 20 % 용액을 포함하는 두 ML hippocampal 기록 버퍼로 가득한 6 잘 접시에 잘있는 문화 플레이스 P - 3000MP)와 10-30 분 실온에서 알을 품다. </li><li> Fluo - 4 솔루션을 제거하고 30 분 실온에서 hippocampal 기록 버퍼와 부화와 coverslips에게 3 회 씻는다. </li><li> 챔버에 coverslip를 삽입하고, 렌즈 클리닝 액체로 coverslip의 다른 측면을 청소. </li><li> 목적에 침지 기름의 작은 방울 (Cargille에서 집중 오일 종류 DF)를 넣고 현미경의 무대 (올림푸스 IX71)에 실 (워너 인스 트루먼 트에서 25mm의 원형 coverslip에 대한 열기 챔버)을 넣어. </li><li> 세포가 보이는지, 그리고 초점에 그들을 위해 전송 라이트를 사용하여 세포보세요. 다음 (비전까지에서 폴리 크롬 V) 단색에서 488 nm의와 세포를 조명하고 Fluo - 4의 형광 신호가 균일하고 astrocytes에 감지할 수 있는지 확인합니다. </li><li> astrocytes에 칼슘을 측정하는 에피네프린과 TIRF 조명을 사용합니다. </li></ol> TIRF 현미경 간단히, 우리는 Andor IXON DV887DCS EMCCD 카메라가 장착된 올림푸스 현미경 IX71을 사용합니다. 여기 및 이미지 수집의 제어 TILLVision 소프트웨어를 사용하여 이루어진다. 454/488/515 nm의 아르곤 (100 MW)와 442 nm의 고체 (45 MW) 레이저의 광선이 결합과 함께 제어까지 폴리 라인 레이저 결합기, TIRF 듀얼 포트 콘덴서와 acoustoptical tuneable 필터와 컨트롤러 (AOTF, 모든의 TIRF의 콘덴서에 입국 Kineflex 넓은 밴드 섬유로 Photonics) 및 공급 때까지. 우리는 TIRF를 달성하는 올림푸스 60X 1.45 NA 렌즈를 사용합니다. 카메라 이득은 노이즈 이미지를 최상의 신호를 제공하는 각 astrocyte에 대해 조정됩니다. 배경 및 TIRF 현미경의 원리는 최근 5 4을 검토하고 있습니다. 우리가 사용하는 광학 부품의 대부분은 이제 애질런트 테크놀 로지스 (http://www.till-photonics.com/)의 일부 Photonics,까지에서 구입한했다. 티르의 침투 깊이는 아래의 방정식으로부터 계산하실 수 있습니다. <img style="float:left;" src="/files/ftp_upload/1142/equation.png" alt="방정식" /> D = 침투 깊이 유리 N1 =의 굴절률 세포의 N2 = 굴절률 발병률의 A = 각도 발병률의 나이 = 숫자 조리개 레이저가 TIRF을위한 최적의 정렬되도록하기 위해 우리는 100 nm의 형광 구슬 (Invitrogen, F8803)를 준수하는 것이 유용할. 우리는 여전히 프레임과 에피와 TIRF 현미경과 구슬의 동영상을 제시한다. TIRF 경우에, 하나는 신호 대 잡음의 극적인 증가를 관찰하고 구슬이 Brownian 확산을 표시합니다. 중요한 각도가 동일하지 않다면 우리는 최적의 TIRF 오히려 발생할 위험 경사 조명보다 발생 있는지 확인하기 위해 정기적으로 (~ 한 주당)에 TIRF 현미경 100 nm의 비즈의 행동을 관찰하는 것이 유용 α (그림 1 참조). G - 단백질 결합 수용체 agonists의 응용 Astrocytes는 metabotropic 글루 탐 산염 수용체와 P2Y 수용체 (작용제, ATP, ADP)를 포함 GQ - 결합 수용체 6, 7의 다양한 표현한다. 이들 수용체의 활성화는 astrocytes 이내 세포 내 칼슘 수준에서 크게 증가 발생합니다. 예를 들어, 하나는 쉽게 astrocytes의 80-10에 ATP (30 μm의)의 응용 프로그램을하는 동안 세포 내 칼슘의 고도를 볼 수 있습니다. 우리는 워너 인스 트루먼 트에서 스위처는 VC - 77SP 빠른 단계 재관류 시스템 (http://www.warneronline.com/index.cfm를)라는 빠른 솔루션을 사용합니다. 이 방법 솔루션은 ~ 10 MS 이하에 적용할 수로. <img src="/files/ftp_upload/1142/Fig 1a.jpg" alt="그림 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1142/fig1c.jpg" alt="" /> 그림 1. 만화와 영상의 사진가 설정할 수 있습니다. (B) 레이저 어셈블리, 컨트롤러 및 빔 상자의 사진을 보여주는 반면 A.는 airtable에 장착된 현미경의 사진을 보여줍니다. C.이 영상에 대한 마운트 챔버와 함께 현미경 단계의 사진을 보여줍니다. 에 빠른 재관류 장치 (스테퍼 모터와 세타 튜브와 함께)을 볼 수 있습니다 떠났다. 오른쪽 Axopatch 200A 증폭기의 headstage 볼 수 있습니다. 만화는 세트에서 빛을 경로를 schematizes 어떻게 TIRF가 이루어집니다. 레이저는 그것이 중요한 각도 α에 침지 기름에 나온다 있도록 중심을 조정하는 60X 1.45 NA 목표 렌즈와 위치의 뒤쪽 초점 비행기에 초점을두고 있습니다. 이 시점에서 빔 낮​​은 굴절률의 중간에 거리 λ (주 텍스트로 방정식을 참조) 총 내부 반사와 자연 붕괴로 인해 고통받는. 이 경우에 이것은 astrocytes 및 astrocytes 자신을 둘러싼 녹음 버퍼입니다. 결과는 플라즈마 막의 ~ 100 nm의 시간 분자의 광학 여기 (때문에 영상)입니다. 세포 내에서 또는 세포의 상단 표면에 사람들이 흥분되지 않은 반면, 세포의 만화는 이것이 녹색 &quot;흥분&quot;막 수용체로 표시됩니다. TIRF 현미경의 전체 계정은 스테 이어와 Almers 사에 의해 제공되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig2.png" alt="그림 2" /> 그림 2. 에피와 TIRF 현미경과 함께 인수 100 nm의 형광 구슬의 이미지. A. 여러 개 100 nm의 형광 구슬로보기의 필드의 에피 이미지를 표시합니다. 파란 화살촉이 물에 diffusing 아르 구슬을 가리킨 반면, 유리 coverslip에 정착 구슬에 빨간색 화살표 지점. B.는 빨간색 화살표로 표시된 자기편 비즈가 표시되는이보기에서는 A. 같이보기 같은 분야의 TIRF 이미지를 표시합니다. 이들은 유리 coverlsip에 정착하고 ~ 100 nm의 지극히 미미한 분야 내에서 따라서 이었어요 때문입니다. 파란 화살표로 표시 구슬이 지역 내에서되지 않으며 TIRF 이미지에 따라서 보이지 않습니다. 낮은 줄거리는 이미지의 3D 렌더링을 보여줍니다. 그것은 TIRF 현미경으로 관찰하면 신호 대 잡음의 큰 증가가 지극히 미미한 분야 내에서 구슬에 대한 발생 분명하다. TIRF 위해 20되었다 반면 ± 0.7 사실 이러한 이미지에 대한 에피네프린을위한 신호 대 잡음은 7.1 ± 0.6되었다. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig3.png" alt="그림 3" /> 그림 3. 에피와 TIRF 현미경과 함께 인수 Fluo - 4 칼슘 표시기 색소와 함께 로드된 이미지 astrocytes. 오 astrocytes 전망이 분야의 A. 에피 이미지. 의 이미지가 A와 B가 크게 다르다는 것을 B. 참고보기에 표시된 것과 같은 분야의 B. TIRF 이미지. TIRF 조명과 유리 coverslip에 가까운 동격에서만 플라즈마 막 지역이 몇 군데 있기 때문입니다. 하단 패널은 표시 ATP - evoked 에피와 TIRF 현미경과 몇 군데 세포내 칼슘 과도합니다.

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</ol>

그것은 astrocytes은 세포 내 칼슘의 고도를 표시 잘 설정됩니다. 이들은 자발적으로 발생하는가의 연결 활동이나 astrocyte 표면 11 수용체를 활성화하기 위해 agonists의 응용 프로그램에 의해 실행하실 수 있습니다. 하나의 중요한 논쟁 문제는 astrocyte 세포 내 칼슘의 고도는 뉴런 11, 12 수용체를 활성화 신호 분자의 릴리스를 실행할 수 있는지 여부입니다. 로 헤이든 7, 13, 11 맥카시 실험실에 의해 리뷰에 강조이보기와에 대한 증거를이 되었기 때문에 이것은 논쟁이다. 우리는 새로운 가설을 기반 실험 방법 astrocytes 충격 뉴런에게 14 결정할 수 있도록 설계하기 전에 astrocyte 칼슘 역학보다 정확한 이해가 필요하다는 주장 최근 뇌의 슬라이스 이미징 및 전기 생리학 데이터를 기반으로. 이 동영상이 문서에서 우리는 플라즈마 막과 교양 astrocytes 거의 동시에 글로벌 세포내 칼슘의 변화 근처 이미지에 간단한 방법을 제...

<table><tbody><tr><td>VWR&amp;#174; 마이크로 커버슬립, 원형, No. 1</td><td>도구</td><td>VWR international</td><td>48380-068</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm 생쥐 육종 기저막 유래 Laminin</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Earle&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), 액상</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>14155-063</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM) (1X), 액상 (Earle&amp;rsquo;s 염을 포함하며 L-glutamine 또는 phenol red는 포함하지 않음)</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 액상</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate 용액</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 용액 1 M</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X), 액상</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum, 열불활성화</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>PAPAIN-022</td><td>시약</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;#8482; Medium (1X) 액상, Phenol Red 미포함</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Serum-Free Supplement (50X), 액상</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine-200 mM (100X), 액상</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너</td><td>도구</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 멀티웰 평저 플레이트 및 덮개, 멸균</td><td>도구</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexahydrate</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexahydrate</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES free acid</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM 1 mM DMSO 용액</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&amp;#174; F-127 20% DMSO 용액</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil TYPE DF</td><td>현미경</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td></td></tr><tr><td>25 mm 원형 커버슬립용 오픈 챔버, 100 &amp;mu;l 용량</td><td>도구</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0362 (RC-21BDW)</td><td></td></tr><tr><td>Series 20 챔버용 P-2 플랫폼, 비가열식</td><td>도구</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0278 (P-2)</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres 카복실기 수식 마이크로스피어, 0.1 &amp;mu;m, 황녹색 형광 (505/515) 2% 고형분</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr></tbody></table>

astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

두뇌는 glial 세포가 포함되어 있습니다. Astrocytes, glial 세포의 종류는 긴 뉴런에 수동 지원 역할을 제공하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나, 증가 증거 astrocytes도 적극적으로 뉴런과 기능적 상호 작용을 통해 뇌의 기능에 참여할 수있다하는 것이 좋습니다. 그러나, astrocyte 생물학의 많은 근본적인 측면 논쟁, 불분명 및 / 또는 실험적으로 미개척 남아있다. 중요한 문제는 astrocytes의 세포내 칼슘 과도의 역학입니다. 칼슘이 잘 중요한 두번째 메신저로 설립되고 있기 때문에 그것이 astrocyte 칼슘 고도가 astrocytes에서 송신기의 릴리스를 실행할 수있는 제안 되었기 때문에이 적합합니다. 그러나, astrocytes의 신호 근처 플라즈마 막 칼슘의 자세한 설명을하거나 만족이되지 않았습니다. 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 살 세포의 플라즈마 막의 약 100 nm의 시간 생리학 관련 신호 이벤트를 분석하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 TIRF 현미경을 사용하여 거의 동시에 플라즈마 막과 글로벌 세포내 칼슘 역학 근처 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법의 자세한 상세하고 체계적인 응용 프로그램은 astrocyte 칼슘 신호의 정확한 세부 사항에 대해 알리기 위해 가능성이 있습니다. astrocyte 칼슘 역학에 대한 상세한 이해, 어떻게 언제 왜 astrocytes와 뉴런은 칼슘 의존 기능 상호 작용을 거쳐, 이해하는 기초를 제공할 수 있습니다.

우리는 총 내부 반사와 epifluorescence 현미경을 사용하여 교양 astrocytes에 막 및 글로벌 세포내 칼슘 역학 근처 측정하는 방법에 대해 설명합니다.

Astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정

뇌에는 글리아 세포(glial cells)가 포함되어 있습니다. 글리아 세포의 일종인 별아교세포(astrocytes)는 오랫동안 뉴런에 수동적인 지지 역할을 제공하는 것으로 알려져 왔습니다. 하지만...

본 영상의 첫 번째 파트에서는 성상교세포-신경세포 공배양(astrocyte neuron co-culture) 준비 방법을 시연하겠습니다. 이를 위해 P1 쥐의 해마(hippo Campi) 여러 개를 튜브에 수집하여 프로나제(pronase)로 소화시키고, trituration을 통해 분리한 후 커버슬립에 플레이팅합니다. 두 번째 섹션에서는 성상교세포 내의 세포 내 칼슘 역동성을 측정하는 방법을 보여드릴 예정이며, 여기에는 성상교세포에 Fluo-4 칼슘 지시제 염색약을 로딩하고, 에피 현미경(epi microscopy)으로 전반적인 칼슘 역동성을 측정하며, TIRF 현미경(tuff microscopy)으로 세포막 인근의 칼슘 역동성을 측정하는 과정이 포함됩니다.조명을 자동으로 빠르게 변경함으로써, 전체 칼슘과 막 근처의 칼슘을 거의 동시에 관찰할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 생리학과 Budget COS 연구실의 박사후 연구원 Aji omi입니다. 오늘은 성상교세포(astrocytes)의 칼슘 이미징 절차를 보여드리겠습니다.본 연구실에서는 이 절차를 통해 성상세포(astrocyte)의 막 근처 및 전체 칼슘 역학을 연구합니다. 제거 과정을 자동화하고 빠르게 수행함으로써, 전체 칼슘과 막 근처 칼슘을 구분하여 분석할 수 있습니다. 거의 동시에, 성상세포에서 칼슘 상승을 유도하기 위해 TP를 적용하는 방법을 보여드리겠습니다.마지막으로 성상교세포 연구 방법을 통해 장벽에 대해 요약하고 논의하며 마무리하겠습니다. 그럼 학습을 시작해 보겠습니다. 성상교세포 배양을 시작하려면, 안락사시킨 쥐 새끼의 머리에서 피부와 두개골을 제거하십시오.차가운 해부액이 채워진 페트리 접시에 뇌를 넣고, 양쪽 반구를 해부하여 뇌수막을 제거합니다. 다음으로 해마를 적출합니다. 적출한 해마를 약 1x1 mm 크기의 조각으로 잘게 자릅니다.Pappa 용액에서 37 °C로 11~13분 동안 소화시킵니다. 배양기에서 분리된 조직을 꺼냅니다. 조직 조각들이 가라앉으면, 프로판 소화액에서 조각들을 조심스럽게 제거하고 5 mL의 해마 배지를 추가하여 절단된 해마 조각들을 세척합니다.이 단계를 반복한 후, 마지막으로 해마 배지(hippocampal medium)에 재현탁합니다. 화염 연마된, 크기가 점차 작아지는 피펫 세 개를 사용하여 세포를 약 5회 반복적으로 파이펫팅합니다. 이후 70 µm 공극 크기의 세포 스트레이너(cell strainer)에 세포를 통과시키고, 스트레이너에 배지 4 mL를 추가합니다.현탁액 10 µL 내의 세포 수를 측정합니다. mL당 400,000개의 세포가 되도록 해마 배지의 부피를 조절합니다. 이제 하룻밤 동안 라미네이트 용액에 노출시킨 커버슬립에서 라미네이트를 흡입하여 세포 현탁액 파종을 위한 커버슬립을 준비합니다.커버슬립이 마르기 전에 커버슬립당 200 µL의 세포 현탁액을 분주합니다. 인큐베이터에서 60분 동안 세포가 부착되도록 둡니다. 배양 후, 웰당 2 mL의 해마 배지를 추가합니다.다음 날, 죽은 세포와 잔해물을 제거하기 위해 기존의 해마 배지를 흡입하여 제거하고, 미리 데워둔 신선한 해마 배지 2 mL를 첨가합니다. 성상교세포-신경세포 공동 배양의 유지 관리는 세포 도말 4일 후부터 시작하며, 일주일에 두 번 1 mL의 신선한 neurobasal 배지를 첨가합니다. 이때 배지는 온도와 이산화탄소 농도가 평형을 이룰 수 있도록 통기성 플라스크에 담아 인큐베이터에서 약 30분 동안 사전 배양하십시오.성상교세포(astrocytes)를 연구하기 전에, turf를 위한 레이저 각도를 최적화하기 위해 나노 형광 비드를 관찰하는 것이 유용합니다. 이를 위해 페트리 접시에 200 µL의 물을 넣고 100 nm 형광 비드 1 µL를 추가하여 혼합한 후, 에피 형광 현미경(epi fluorescence microscopy)으로 비드를 관찰하십시오. 그다음, turf 현미경으로 비드를 관찰하십시오.칼슘 이미징을 위해, 2.5 µM Fluo-4 AM과 0.05% Pluronic F-127(DMSO 20% 용액)이 포함된 2 mL의 해마 기록 완충액이 채워진 6-웰 플레이트의 웰에 배양물을 넣고 실온에서 10분에서 30분 동안 배양합니다. 이때 Fluo-4의 퇴색을 방지하기 위해 플레이트를 덮어야 함을 유의하십시오. Fluo-4 용액을 제거하고 커버슬립을 해마 기록 완충액으로 3회 세척합니다. 세척한 커버슬립을 실온에서 30분 동안 배양합니다.커버 슬립을 챔버에 넣고, 렌즈 세정액으로 커버 슬립의 반대쪽을 닦아낸 뒤 hippocampal buffer 200 µL를 첨가합니다. 대물렌즈에 이머전 오일을 한 작은 방울 떨어뜨리고 현미경 스테이지 위에 챔버를 올립니다. 투과광을 사용하여 세포를 관찰하며 초점을 맞추고 세포의 상태를 확인합니다.다음으로, 단색광의 488 nanometers 파장으로 세포를 조사하여 flu oh four의 형광 신호가 균일하고 검출 가능한지 확인합니다. 성상교세포의 경우, epi 및 turf 조명을 사용하여 성상교세포 내의 calcium을 측정합니다. 여기서는 epi 조명을 통해 형광 비드를 관찰합니다.이들은 배경 형광을 생성할 뿐만 아니라, 조명 각도에 따라 상당한 브라운 운동을 나타내기도 합니다. 레이저가 임계각에 접근하면 레이저 빔은 유리-물 계면에서 전반사됩니다. 이러한 전반사는 에바네센트 필드(evanescent field)라고 불리는 전자기장을 생성합니다.이것은 굴절률이 더 낮은 세포 내부로 약 100 nanometers의 깊이를 가집니다. 표본 표면의 이 얇은 층에서 형광체(fluorophores)를 여기시킬 수 있습니다. 여기는 에피(epi) 조명과 비교하여 터프(turf) 조명으로 관찰한 형광 비드의 모습입니다.각도를 줄이면 조명 신호 대 잡음비가 크게 증가합니다. 레이저 빔이 표면에서 반사되지 않고 커버슬립을 통과하여 형광 비드에 직접 도달합니다. 이때 많은 배경 형광을 관찰할 수 있습니다.이제 각도를 높입니다. 다시 한번 배경 노이즈가 현저히 감소하며 커버슬립 표면 근처의 형광 비드를 확인할 수 있습니다. 이 이미지들은 flu oh four가 로딩된 성상교세포와 뉴런을 보여줍니다.별아교세포는 미세한 돌기가 있는 납작한 세포인 반면, 신경세포는 둥근 세포체와 굵고 긴 수지상돌기를 가지고 있습니다. 별아교세포와 신경세포 모두 건강해 보이며 형광 염색이 적절하게 처리되었습니다.에피 또는 공초점 현미경으로 성상교세포를 관찰하는 것은 성상교세포가 건강한지, 그리고 칼슘 지시자가 성상교세포 내로 적절히 로딩되었는지 확인하는 데 유용합니다. 커버글라스와 가장 가까운 영역인 풋프린트(footprint)라 불리는 성상교세포 부위에서는, TP가 세포막 근처에서 칼슘 증가를 유발하는 것이 관찰됩니다. 해마의 성상교세포는 순수 무반응 수용체(pure anergic receptors)를 발현하는 것으로 알려져 있으며, 배양액에 TP를 처리하면 전신적인 칼슘 방출이 일어날 수 있습니다.지금까지 해마 성상교세포 배양 준비 방법과 성상교세포의 전체 및 세포막 근처 칼슘 농도를 측정하는 방법을 살펴보았습니다. 이 실험 절차를 수행할 때 레이저 각도를 최적화하는 것이 중요하며, 현미경에서 이를 확인하는 가장 좋은 방법은 100 millimeter 유속에서의 거동을 관찰하는 것입니다. 전체 칼슘 농도와 세포막 근처 칼슘 농도를 동시에 기록하면 칼슘 신호에 대한 상세한 설명뿐만 아니라, 성상교세포의 칼슘 조절 기전에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있을 것입니다.또한 여기서 설명한 접근 방식이 다른 흥분성 미지의 영역에서 막 근처 및 전체 세포 내 칼슘 수치를 측정하는 데 유용할 것이라는 점을 알게 되었습니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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생물학

절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의...

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

출처: Bannai, H., et. al., 막 표적 Ca2+ 지표에 의한 배양 세포의 국소 Ca2+ 신호 해부. J. Vis. Exp. (2019년)이 비디오는 원형질막과 소포체에 국한된 칼슘 민감성 단백질을 순차적으로 모니터링하여 성상세포에서 구획 특이적 자발적 칼슘 역학을 관찰하기 위한 형광 이미징을 보여줍니다.

성상세포의 구획 특이적 역학을 위한 자발적 칼슘 이미징

여기에서 우리는 성상 교세포 G 단백질 결합 수용체의 가소성 연구를위한 신경 세포의 항상성 가소성을 유도하기 위해 사용되는 프로토콜의 적응을 설명합니다. 최근 성상 세포 그룹 청소년 생쥐 내가 mGluRs의 변화를 검사하는 데 사용되는 방법은 현장에서 생체 성인 마우스의 조직에서, 다양한 성상 세포의 GPCR의 확장을 측정하고, 성상 세포 수용체의 감도의 더 나은 인식을 얻기 위해 적용 할 수있는 신경 활동의 변화에​​.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

선조체에서 성상교세포 세포 내 Ca2+ 신호의 특성과 기능은 불완전하게 탐구된 상태로 남아 있습니다. 혈청형 2/5(AAV2/5)의 아데노 관련 바이러스를 사용하여 선조체 성상세포에서 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 발현하는 방법과 선조체 성상세포 내 Ca2+ 신호를 안정적으로 이미지화하는 절차를 설명합니다.

이미징 세포 내 칼슘 2 + 유전자 인코딩 된 칼슘 표시기를 사용하여 성인 마우스의 선조체 성상의 신호

여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜은 빠르고, 단순 하 고 저렴 한 방식으로 다른 뇌 세포 분리에서 murine 이다 경작에 최적입니다. AWESAM 이다 자발적인 캘리포니아2 + 신호, 형태학, 및 유전자 식 프로필 이다에서 vivo에서유사한 전시.

Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은

여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 "튜브" 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

여기 우리는 캘리포니아2 + 이미징 신경 그리고 glial 세포, 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 해 부를 수 있게 하는 프로토콜을 제시. 이 프로세스는 유전자 인코딩된 Ca2 + 지표의 식을 허용 하는 모든 셀 형식에 적용 됩니다.

로컬 Ca2 + 신호 막 대상 Ca2 + 지표에 의해 경작된 한 세포에의 해 부

여기에서 우리는 세포기관의 세포내 수송 및 뮤린 성상 세포에 있는 혈장 막 단백질의 인신 매매를 구상하는 시험관 내 살아있는 화상 진찰 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 또한 화물 운송 일정 및 역학을 결정하는 이미지 분석 방법론을 제시합니다.

성상 세포에서 세포기관 및 기타 화물의 세포내 운송 시각화 및 분석

이 프락토콜은 성상세포와 뉴런에서 생체 외 및 생체 내 미토콘드리아 Ca2+ 이미징을 위한 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.

유전자 인코딩 된 Ca2 + 지표 (GECIs)를 사용하여 성상 세포와 뉴런에서 이미징 미토콘드리아 Ca2 + 섭취

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

이 프로토콜은 여러 기억 관련 뇌 영역에 걸쳐 뉴런과 성상교세포로부터 칼슘 신호를 동시에 기록하는 방법을 포괄적으로 설명하며, 학습 및 기억 행동 패러다임에서의 적용 방식을 시연합니다.

학습 및 기억 행동 중 여러 뇌 영역에 걸친 성상교세포-뉴런 활동을 기록하는 이중 색상 섬유 광도 측정법

배우세요 대뇌해마 성상교세포-신경세포 공배양 준비 및 세포내 칼슘 역학 측정 방법을. 전반사 및 형광현미경을 활용한 이 기법은 신경과학 연구에 필수적인 도구입니다.

Astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정

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