Name: 14 일 된 모종의 조직에서 Protoplasts의 분리 Arabidopsis thaliana /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 배우세요 Arabidopsis thaliana 14일령 모종에서 완전한 프로토플래스트를 분리하는 방법을. 효소 소화와 자당 농도 구배를 통해 세포벽을 제거하고 생존 가능한 세포를 얻어 96시간 이상 안정하게 유지할 수 있습니다.

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이 작품은 시작 그랜트 OKV에게 수여 코넬 대학 농업 실험 스테이션 (CUAES) NYC - 125433 해치 그랜트와 코넬에서 지원했습니다

1 부. 성장 식물 고체 매체의 준비. 우리는 일반적으로 집중 Murasige와 Skoog (MS) 매체에 문화 공장 1 % 자당 및 0.7 %의 한천과 함께 보충. 그것은 식물이 건강하게 유지하는 필요한 모든 재료가 포함되어 있습니다. MS의 1L, 미디어 산도 5.7 준비 <ol><li> 1.5 2.0L autoclavable 병에 물 800 ML에 MS 분말 2.15 g을 추가합니다. </li><li> 병에 감동 막대를 삽입하고 감동 접시에 매체를 교반하여 MS 분말을 풀다. </li><li> 교반하는 동안, 추가 드롭 들러, 1N 코는 5.7으로 MS 매체의 산도를 조정합니다. </li><li> 자당의 10g를 추가, 감동 유지. </li><li> 한천의 7g 추가 *. </li><li> 1000 ML에 준비 매체의 최종 볼륨을 조정하고 autoclaving하여 소독 .* </li><li> 장소 감동 접시에 매체를 autoclaved하고 교반하면서 그것을 진정 그 한천은 병의 바닥에 침전되지 않습니다. ~ 60 ° C. *로 매체를 쿨 </li><li> 100mm 페트리 접시에 붓고. 4 접시 보관 ° C. </li></ol> * 팁 1 : 한천을 분해하지 마십시오. 그것은 autoclaving 동안 solubilize 것입니다. * 팁 2 : autoclaving 동안 병에 교반 막대를 유지하는데, 나중에 필요합니다. * 팁 3 : 10 s에 대한 autoclaved 병에 손을 유지할 수있다면, 그것은 매체 충분히 식었 당신이 접시를 따르고 시작할 수있다는 것을 의미합니다. 2 부. 식물과 성장 조건. <ol><li> Arabidopsis thaliana의 씨앗을 소독 <ol><li> eppendorf의 microcentrifuge 튜브에 씨앗 100 MG를 삽입하고 70 % 에탄올 1 ML를 추가합니다. 잘 믹스 2 분 알을 품다. , 씨앗을 스핀 다운 뜨는을 대기음. </li><li> 1.8 %의 표백제 용액 1 ML 추가 * 0.1 % 트윈 - 20를 포함. 10 분 섞는다. 종자 및 대기음 표백 용액을 스핀. </li><li> 이 단계는 층류 후드에서 수행되어야한다. 씨앗을 멸균 물 1 ML 추가, 잘 섞는다. 물을 기음, 씨앗을 스핀. 이 단계에게 5 회 반복합니다. </li></ol></li><li> 1 단계 접시 (100 씨앗 / 플레이트)의 준비에 씨앗을 퍼뜨린다. </li><li> 4 24-48 H에 대한 씨앗을 품고 번호판을 계속 ° 충화 동안 짙은 어둠 속에서 C. </li><li> 19분의 23 ° C 빛 / 어둠의 온도 정권 8 H light/16 H 어두운 photoperiod (250 μmol m -2 S -1의 광합성 광자 선속 밀도에서)와 함께 성장 챔버에서 14 일 동안 식물을 성장하고 75 % 상대 습도. </li></ol> * 팁 1 : 블리치 솔루션 지어낸입니다 희석 가정 Clorox하여 6 % 나트륨 차아 염소 산염을 포함하고 0.1 %의 최종 농도 트윈 - 20를 추가. 부 3. Arabidopsis 모종의 protoplasts의 고립. <ol><li> 슬라이스 필터 - 살균 TVL 솔루션의 15 ML에 신선한 면도날로 14 일 된 모종의 2g. 우리는 일회용 멸균 배양 접시에 식물 자료를 들어온다. </li><li> 200 ML의 비커에 잘게 조직을 전송, 필터 살균 효소 솔루션, 소용돌이 효소 솔루션으로 조직 믹스가 parafilm 및 알루미늄 호일로 커버하도록 비커 20 ML를 추가합니다. </li><li> 16-18 H. 위해 상온에서 어두운 35 RPM에서 식물 조직 쉐이크 </li><li> 치즈 천 8 층, W5 용액에 미리 서부 유럽 표준시를 통해 거를 50 ML 팔콘 튜브에 공개 protoplasts를 수집합니다. </li><li> W5 솔루션의 15 ML과 천을 세탁하여 치즈 천으로 한 번 더에서 체의 protoplasts. </li><li> 조심스럽게 W5 솔루션의 10 ML과 오버레이 protoplasts은 설탕 기울기를 방해하지, 원심 분리기를 100 7 분, G.위한 </li><li> 효소 솔루션 및 W5 솔루션 (그림의 1B)의 인터페이스에서 protoplasts 10 ML를 수집하고 새로운 50 ML 팔콘 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 60 G.에서 5 분 15 ML W5 솔루션, 원심 분리기 추가 뜨는을 제거합니다. </li><li> 60g에서 5 분 대한 15ml W5의 솔루션, 원심 분리기에 protoplasts을 resuspending하여 효소 솔루션에서 무료 protoplasts 와시 </li><li> 1 - 3ml W5 솔루션에 뜨는, resuspend pelleted protoplasts를 제거합니다. </li><li> hemocytometer로 계산하여 세포 원형질의 수율을 평가해보십시오. </li></ol> 부 4. 시약 : TVL : sorbitol 0.3 M, 50 MM CaCL이 필터 - 소독 및 -20 ° C.에 저장 효소 솔루션 : 0.5 M의 자당, 10 MM MES - ​​코 [산도 5.7], 20 MM CaCl 2, 40 MM KCl, 1 % Cellulase (Onozuka R - 10), 1 %의 Macerozyme (R10). 필터 - 소독과 갓 사용합니다. W5 솔루션 : 0.1 % (W / V) 포도당, 0.08 % (W / V) KCl, 0.9 % (W / V) NaCl, 1.84 % (W / V) CaCl 2, 2 MM MES - ​​코 산도 5.7. 필터 - 소독하고 실온에서 저장합니다. 제 5 부 : 대표 결과 : 부품 1과 2에서 설명한 Arabidopsis 문화 조건을 사용하면 protoplasts (그림 1A)을 분리에 적합한 건강한 모종을 렌더링. 원형질은 자당 농도 그라디에 의해 정화 아르엔트 원심 분리 및 W5 및 효소 솔루션 (그림의 1B)의 인터페이스에서 수집했습니다. 제 3에 설명되어있는 원형질 분리 절차를 사용하여 우리는 일반적으로 신선한 모종 중 하나 그램에서 그대로 protoplasts의 10월 5일부터 10일까지 6 (그림 1C)를 수확. <img src="/files/ftp_upload/1149/Fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. Arabidopsis 모종의 protoplasts의 고립. A, Arabidopsis 14 일 된 모종의 조직가의 수정 절차 (첸과 Halkier, 2000)이 수집하여 protoplasts로 변환되었습니다. B, Protoplasts은 자당 밀도 기울기 원심 분리에 의해 정화 및 효소 솔루션의 인터페이스에서 수집되었습니다 W5 uffer (화이트 화살표). C, protoplasts의 브라이트 - 필드 현미경. Microphotographs은 자이스 혈구 Axioscope이 플러스 현미경으로 연계 냉각 CCD 카메라를 사용하여 수집되었습니다.

<ol><li>Cocking, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+Isolation+of+Plant+Protoplasts+and+Vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles.</a> Nature. 187, 962-963 (1960).</li>
<li>Chen, S., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glucosinolate+uptake+by+leaf+protoplasts+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus.</a> J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).</li>
<li>Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+vacuoles+from+Arabidopsis+rosette+leaf-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts.</a> Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).</li>
<li>Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+RNAi+as+a+reverse+genetic+approach+for+gene+functional+analysis+in+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.</a> Plant Phys. 149, 642-652 (2009).</li>
</ol>

식물 유전자의 기능 분석에의 이용에 대해이 절차를 설명 잠정 특허는 기술 기업 및 상용화에 대한 코넬 센터 (CCTEC) 월 2008 접수되었습니다. OK Vatamaniuk, 그리고 Zhai, 식물 유전자의 기능 분석에 대한 신속한 Z. 방법 : 내용 적요 대한 50341/015001 없습니다.

그대로 원형질의 높은 수율을 보장하기 위해서는 건강 식물 - 시작하는 것은 매우 중요하다. protoplasts를 분리 위해 필터 소독 솔루션을 사용합니다. protoplasts가되기 것을 기억하십시오. 따라서 protoplasts을 처리하는 경우, pipet 또는 그들을 브레이크 것입 적극적으로부터 와동을 혼합하지 않습니다. 대신 천천히 회전 또는 원심 튜브를 녹화하여 protoplasts를 섞는다. 적어도 96 H.에 대한 가능한 설명하는 절차는 수율 그대로 protoplasts 따라서, protoplasts 그러한 subcellular 단백질 현지화, 절연 및 손상 organelles 두 번 좌초 RNA 간섭 (RNAi) 등 3-5으로 유전자 불활 성화 타겟의 분석으로 세포 프로세스의 다양한 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Murashige and Skoog 기본 염 혼합물(MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시(100x15mm)</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>82-4001</td><td></td></tr><tr><td>셀룰라아제(OnozukaR)&amp;#8208;10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C32200</td><td></td></tr><tr><td>마세로자임(Macerozyme)(R10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>M22010</td><td></td></tr><tr><td>치즈클로스 와이프(Cheesecloth wipes)</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-665-29</td><td></td></tr><tr><td>실험실 회전 혼합기</td><td>Fisher Scientific</td><td>제공된 텍스트가 없거나 식별 번호(1167152Q)만 포함되어 있습니다. 번역할 원문 텍스트를 제공해 주시기 바랍니다.</td><td></td></tr><tr><td>AllegraX&amp;#8208;15R 원심분리기</td><td>VWR international</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Axioskop2Plus현미경</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

14 일 된 모종의 조직에서 protoplasts의 분리 arabidopsis thaliana</em

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts 자신의 세포 벽을 제거 효소가 있었 식물의 세포 수 있습니다. 다른 식물의 조직에서 protoplasts의 분리가 먼저 40 년 이상 전에보고되었다<sup&gt; 1</sup&gt; 이후 같은 subcellular 단백질의 지방화, 손상 organelles의 고립을 두 번 좌초 RNA 간섭 (RNAi)에 의해 유전자 불활 성화 대상으로 세포 프로세스 다양한, 연구에 적응되었습니다<sup&gt; 2-5</sup&gt;. 원형질 분리 프로토콜의 대부분은 성숙 Arabidopsis의 잎 조직 (예 : 35 일 된 식물)를 사용<sup&gt; 2-4</sup&gt;. 우리는 14 일 된 Arabidopsis의 모종을 채용하여 기존의 프로토콜을 수정했습니다. 이 절차에서는, 14 일 된 모종의 일g 5 10 굴복<sup&gt; 6</sup&gt; -10<sup&gt; 7</sup&gt; 최소한 96시간 그대로 유지 protoplasts. 모종의 protoplasts의 수확량은 성숙 Arabidopsis의 잎사귀에서 준비를 비교하지만, 대신 35-36일의 protoplasts의 분리는 15 일 이내에 완료됩니다. 이것은 성숙한 식물을 사용하는 경우 protoplasts를 분리하는 데 필요한 시간과 성장 챔버 공간을 감소 수 있으며 그대로 protoplasts을 필요로 하류 연구를 신속.

이 동영상은 Arabidopsis 14 일 된 모종의 조직에서 그대로 protoplasts를 분리하는 절차를 보여줍니다. 격리 protoplasts 적어도 96h 위해 그대로 유지하고 대신 한 달 된 성숙한 식물의 모종으로부터 격리되는 감안할 때,이 절차는 그대로 protoplasts가 필요한 assays을 신속.

14 일 된 모종의 조직에서 Protoplasts의 분리 Arabidopsis thaliana</em

원형질체는 효소 처리를 통해 세포벽을 제거한 식물 세포입니다. 서로 다른 식물 조직으로부터 원형질체를 분리하는 방법은 처음으로...

이 절차는 14일 차에 Arabidopsis 종자를 Ms.Agar에 파종하는 것으로 시작합니다. 종자가 발아하면 유묘를 수집하여 절단합니다. 그 후 식물 조직을 효소 용액으로 소화시켜 세포벽을 분해합니다.결과 혼합물을 치즈 천으로 걸러 프로토플라스트를 다른 식물 조직으로부터 분리합니다. 수집된 프로토플라스트는 W five 용액을 층이 지게 하여 sucrose 밀도 구배를 통해 추가로 정제합니다. 프로토플라스트는 효소 용액과 W five 용액의 경계면에 농축됩니다.실험 전 이를 수집하고 세척합니다. 안녕하세요, 코넬 대학교 작물 및 토양 과학과의 Lina Wauk 연구실 소속 Jang Ja입니다. 오늘은 14일 된 aro Ana의 TH로부터 온전한 photographs를 분리하는 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 관심 단백질의 세포 내 국소화를 연구하고, 온전한 세포 소기관을 분리하며, 이중 가닥 RNA 간섭을 이용한 유전자의 기능 분석을 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 먼저 1L의 배지를 기준으로 1% sucrose와 0.7% agar가 첨가된 0.5배 MS 플레이트를 준비하여 절차를 시작합니다.MS 분말 2.15 g을 정밀하게 측정합니다. 교반자가 들어있는 1.5 L 오토클레이브용 병에 담긴 800 mL의 증류수에 이를 넣고, 교반판 위에서 교반하며 분말을 완전히 용해시킵니다. pH가 5.7이 되도록 1 N 수산화칼륨 용액을 한 방울씩 첨가하여 조정합니다.교반을 계속하면서 sucrose 10 grams를 첨가합니다. 다음으로, 녹지 않지만 이후 오토클레이브 과정에서 용해될 agar 7 grams를 첨가합니다. 마지막으로, 부피를 1000 milliliters로 맞춥니다.MS 배지를 121°C에서 20분 동안 오토클레이브하여 멸균합니다. 오토클레이브 후에도 병 안에 교반바를 그대로 둡니다. 교반기 위에서 배지를 저어 약 60°C까지 식힙니다.냉각하는 동안 계속 저어주면 한천(agar)이 병 바닥에 침전되는 것을 방지할 수 있습니다. 병을 10초 동안 잡고 있을 수 있다면 배지가 충분히 식은 것이므로 플레이트에 분주할 수 있습니다. 150 by 15 mm 페트리 접시에 배지를 분주하기 위해 후드로 이동하십시오.플레이트당 90 milliliters. 플레이트를 4°C에서 보관하십시오. 이제 플레이트에서 성장이 이루어졌으므로, 식물을 사용할 준비가 되었습니다.Arabidopsis 종자를 준비하겠습니다. 한 개의 페트리 접시에 파종하기 위해 Arabidopsis 종자를 멸균하여 식물 재배를 시작합니다. 50 µL 부피에 해당하는 양의 종자를 에펜도르프 마이크로 원심분리 튜브에 넣으십시오.먼저 70% ethanol 1 mL를 첨가하고 섞어 에탄올로 멸균합니다. 종자가 가라앉을 때까지 2분 동안 에탄올과 함께 충분히 배양합니다. 피펫을 사용하여 에탄올을 가능한 한 많이 제거한 후, bleach tween 용액 1 mL를 첨가하여 bleach로 멸균하며, 2~3분마다 볼텍싱하여 10분 동안 혼합합니다.표백액을 쉽게 제거하기 위해, 씨앗을 짧게 원심 분리한 후 가능한 한 많은 양의 용액을 피펫으로 제거합니다. 마지막 멸균 단계는 층류 깨끗한 작업대(laminar flow hood)에서 수행합니다. 씨앗에 멸균수 1 mL를 추가하고 잘 섞어줍니다.종자를 짧게 원심 분리한 후 물을 흡입하여 제거합니다. 이 세척 과정을 4회 더 반복합니다. 멸균된 종자를 MS 플레이트에 도말합니다.종자를 파종한 후, 층적화를 위해 파종된 플레이트를 4°C 암소에서 24시간 동안 보관하십시오. 24시간의 배양 후, 식물을 성장실로 옮겨 14일 동안 재배합니다. 8시간 광조사와 16시간 암조건에서 14일 된 유묘는 이제 수확 가능한 상태가 됩니다.묘목이 2주 동안 성장했으므로, 이제 클린벤치에서 원형질체를 준비할 차례입니다. 새 면도날을 사용하여 페트리 접시에 담긴 15 milliliters의 여과 멸균된 TVL 용액 내에서 묘목 2 grams을 절단하십시오. 그다음, 절단된 조직을 알루미늄 호일로 감싼 200 milliliter 비커로 옮기십시오.식물 세포벽을 분해하기 위해 갓 준비하여 필터 멸균한 효소 용액 20 milliliters를 첨가합니다. 비커를 흔들어 혼합하고, 조직을 암소에 보관하기 위해 바이오필름과 알루미늄 호일로 덮습니다. 이어서 효소 용액에 담긴 식물 조직을 실온에서 16시간 동안 진탕합니다.효소 용액과 함께 배양한 후, W five 용액으로 미리 적신 8겹의 치즈클로스(cheesecloth)를 통해 혼합물을 걸러내어 방출된 원형질체를 50 milliliter 팰콘 튜브(falcon tube)에 수집합니다. 치즈클로스를 10 milliliters의 W five 용액으로 천천히 세척하여 남아 있는 원형질체를 모두 회수합니다. 이제 원형질체가 팰콘 튜브에 수집되었습니다. 원형질체 위에 5 milliliters의 WW five 용액을 조심스럽게 층을 이루도록 덮어줍니다.W five 용액을 첨가하여 형성된 당 농도 구배가 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 다음으로 프로토플라스트를 100 Gs에서 7분 동안 원심분리합니다. 프로토플라스트는 효소 용액과 W five 용액의 계면에 수집됩니다. 계면의 액체 10 milliliters를 수집하십시오.수집한 원형질체를 새로운 50 milliliter falcon tube로 옮기고 15 milliliters의 W five solution을 첨가합니다. 그 다음 60 gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 제거하고 원형질체를 15 milliliters의 W five solution에 다시 현탁합니다.다시 한번 원형질체를 60 gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 재현탁합니다. 펠렛 상태의 원형질체를 1~2 mL의 W five 용액에 현탁합니다.마지막으로, 현미경 하에서 혈구계수기를 이용하여 세포 수를 측정함으로써 원형질체 수율을 평가합니다. 본 문서에 기술된 배양 절차는 소화 및 밀도 구배 분리 후 원형질체를 분리하는 데 적합하고 건강한 Arabidopsis 유묘를 생성합니다. 보통 1 g의 신선한 유묘를 수확하면 5~10 × 10⁶개의 온전한 원형질체를 얻을 수 있습니다.저희는 14일 된 *Arabidopsis*의 잎에서 원형질체를 분리하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 매우 중요하게 기억해야 할 점은, 성공 여부가 식물의 건강 상태에 달려 있다는 것입니다. 따라서, 본 프로토콜에서 명시한 대로 적절한 묘목 대 플레이트 비율을 유지하는 것이 중요합니다.플레이트당 배지 양입니다. 마지막으로, 포트 플러스(port plus)는 매우 취약하므로 주의하십시오. 세포를 제거한 후에는 볼텍싱(vortexing)이나 피펫팅(pipetting)을 통한 상하 혼합 대신, 가볍게 쳐서 섞는 방식으로 포트 플러스를 조심스럽게 다루십시오.이상입니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

isolation-protoplasts-from-tissues-14-day-old-seedlings-arabidopsis

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연구

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생물학

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의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

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발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석

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식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

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식물 세포 유형의 분리 및 전사체 분석

이 프로토콜은 Arabidopsis thaliana 종자에서 배유 세포층의 온전한 샘플을 준비하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 주사 바늘 및 정밀 겸자와 같은 일반적인 실험실 장비만 필요하며 개발 중인 종자와 성숙한 종자 모두에서 배유 세포의 고해상도 형광 라이브 셀 이미징을 가능하게 합니다.

Preparation of intact tissue for microscopic analysis of the endosperm cell layer in Developing and mature Arabidopsis seeds(개발 및 성숙한 애기장대 종자에서 배유 세포층의 현미경 분석을 위한 온전한 조직의 준비)

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배우세요 Arabidopsis thaliana 14일령 모종에서 완전한 프로토플래스트를 분리하는 방법을. 효소 소화와 자당 농도 구배를 통해 세포벽을 제거하고 생존 가능한 세포를 얻어 96시간 이상 안정하게 유지할 수 있습니다.

14 일 된 모종의 조직에서 Protoplasts의 분리 Arabidopsis thaliana

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