Murine 신장 이식 절차

마우스 신장 이식 절차는 공여 마우스에서 왼쪽 신장을 적출하여 얼음에 보관하는 공여 장기 적출로 시작됩니다. 수혜 마우스에서는 공여 신장을 이식할 공간을 확보하기 위해 오른쪽 신장을 제거합니다. 그 후 공여 신장을 얼음에서 꺼내 수혜 마우스에 이식합니다.

남아 있는 자생 신장을 제거하기 전, 마우스가 4일 동안 회복하도록 합니다. 7일 후, 이식편 기능을 평가하기 위해 I STAT 휴대용 임상 분석기를 사용하여 크레아티닌 수치를 모니터링합니다. 안녕하세요, 저는 오하이오 주립대학교 이식외과 및 Greg Hadley 박사 연구실의 Sarah Heimer입니다.

오늘은 마우스의 신장 이식 절차를 보여드리겠습니다. 오늘 보실 신장 이식 수술은 상주 전문가인 신경외과 의사 Jing Wing이 수행합니다. 저희 실험실의 이 절차를 통해 이식 거부 반응의 면역학적 사건과 거부 반응 발생을 방지하기 위한 전략을 연구하시기 바랍니다.

그럼 시작하겠습니다. 공여 장기 적출을 시작하기 위해, 동물이 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 발가락 집기(toe pinch)를 수행합니다. 멸균 구역 내에서 멸균된 기구를 사용하여, 마취된 마우스의 흉골부터 치골까지 정중선 절개를 실시하고, 공여 신장 관류를 위해 장을 오른쪽으로 측면 이동시켜 왼쪽 신장을 노출시킵니다. 신동맥과 신정맥의 상하단에 있는 대동맥과 하대정맥 주위를 4-0 실크 봉합사로 결찰합니다.

신장 하대정맥으로 차가운 헤파린 처리된 링거 젖산 용액을 이용하여 서서히 체내 관류합니다. 8-0 실크 봉합사로 부신 및 정소 혈관과 몇몇 요추 분지를 결찰하고 절단하여 왼쪽 신장을 분리합니다. 다음으로, 대동맥과 하대정맥이 왼쪽 신동맥 및 신정맥과 만나는 부위를 가동화하고, 신동맥과 신정맥의 위아래 대동맥 및 하대정맥 주위에 4-0 실크 봉합사로 결찰합니다.

출혈을 최소화하기 위해, 먼저 신혈관 아래쪽의 대동맥을 결찰하십시오. 그 다음, 신문에서 방광까지 왼쪽 요관을 박리하여 분리하십시오. 방광 돔(bladder dome)에 코다 리트랙션(coda retraction)을 사용하여 요관-방광 접합부를 노출시키십시오.

우측 요관이 손상되지 않도록 주의하며, 좌측 요관의 방광 접합부가 포함된 방광의 작은 타원형 조각을 절제합니다. 이 조직 조각은 방광-방광 문합술을 통한 비뇨기 재건에 사용됩니다. 그 다음, 신동맥과 신정맥 상단에서 대동맥을 결찰합니다.

신장 하대동맥을 통해 차가운 헤파린 처리 링거 젖산 용액으로 래프트를 서서히 in situ 관류합니다. 신동맥에서 약 2mm 아래 지점에서 대동맥을 사선으로 절단합니다. 마지막으로, 방광 패치가 부착된 요관과 함께 신장 및 혈관 공급계를 블록째로 제거합니다.

신장은 숙주 수 recipient에 이식할 준비가 될 때까지 얼음 위에 링거 젖산 용액에 보관하며, 공여 마우스는 마취 하에 경추 탈구법으로 안락사시킵니다. 이전에 입증된 바와 같이, 수Recipient 이식은 동물이 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 꼬리를 꼬집는 것으로 시작합니다. 수술을 시작하려면 정중선 절개를 하고, 젖은 거즈로 장을 덮은 뒤 조심스럽게 왼쪽으로 견인합니다.

이 신장 이식 수술을 성공적으로 마치기 위해서는 공여자 대동맥 커프와 수혜자의 대동맥 사이에 문합술을 시행해야 합니다. 공여자 신정맥은 수혜자의 하대정맥에, 공여자 방광 패치는 수혜자의 방광 결찰 부위에 문합합니다. 우측 요관 신동맥과 신정맥을 처리합니다.

결찰 후 신장을 제거하십시오. 요부 분지들을 결찰한 뒤, 4mm 미세혈관 클램프 두 개를 사용하여 신동맥 하부 대동맥과 하대정맥을 조심스럽게 격리하고 교차 클램핑하십시오. 10-0 나일론 봉합사를 대동맥 전층에 통과시킨 후, 혈관 직경의 약 1/5 정도가 되도록 단 한 번의 절개로 타원형의 대동맥 절개창을 만드십시오.

다음으로, 30 gauge 바늘로 하대정맥을 찔러 종단 정맥 절개술을 시행하고 마이크로 가위를 사용하여 적절하게 확장합니다. 대동맥과 하대정맥 내부의 혈액이나 혈전을 제거하기 위해 헤파린 처리된 식염수로 세척합니다. 공여 신장을 얼음에서 꺼내 쥐의 오른쪽 옆구리에 배치합니다.

수혜자의 대동맥 절개창 근위부와 원위부 정점에 공여자 대동맥 커프를 함께 고정하는 유지 봉합사(stay suture) 두 개를 배치합니다. 대동맥 외측에서 2~3개의 연속적인 10-0 나일론 봉합사를 사용하여 공여자 대동맥 커프와 수혜자 대동맥 절개창의 전벽 사이에 단단-측면 문합술(end-to-side anastomosis)을 시행합니다. 이후 공여자 신장 이식편을 수혜자의 왼쪽 옆구리 방향으로 돌려놓습니다.

공여자의 대동맥 커프와 수혜자 대동맥의 후벽 사이에서 이전 절차를 반복합니다. 정맥과 동맥의 문합은 모두 20분 이내에 완료해야 한다는 점이 중요합니다. 또한 문합 과정 중에 이식편을 차가운 식염수로 여러 번 헹궈주어야 합니다.

공여자의 신정맥과 수혜자 하대정맥의 후벽 사이에 10 oh 나일론 봉합사 4~5개를 사용하여 하대정맥 내부에서 연속 봉합으로 단측-측면 문합을 수행합니다. 하대정맥 외부에서 4~5개의 연속 봉합으로 하대정맥의 전벽과 공여자의 신정맥을 폐쇄합니다. 다음 단계는 수혜자 방광의 돔 부분을 절개하는 것입니다.

소작법으로 출혈을 지혈합니다. 고정이 완료되면, 돔 부위에 작은 절개를 내고 10-0 나일론 실로 두 군데의 유지 봉합을 실시하여 공여자의 작은 방광 패치와 수혜자의 방광 돔을 문합합니다. 문합부의 각 측면을 8~10회의 연속 봉합으로 꿰맵니다. 마지막으로 4-0 멸균 합성 흡수성 비크릴 봉합사로 복부를 두 층에 걸쳐 연속 봉합하여 폐쇄합니다.

술후 관리는 페니실린을 단회 근육 주사하는 것으로 시작합니다. 이식 수혜자에게는 통증 완화를 위해 수술 후 0일 차와 1일 차에 buprenorphine 0.05 mg/kg을 근육 주사하며, sulfa trim이 포함된 물을 지속적으로 공급합니다. 수술 후 첫 24시간 동안 쥐는 온도가 조절되는 인큐베이터에 보관합니다.

피부 봉합사는 수술 2주 후에 제거합니다. 혈청 크레아티닌 측정을 통해 신장 이식편의 기능 저하를 모니터링하기 위해서는 남아 있는 자가 신장을 반드시 제거해야 합니다. 이는 일반적으로 공여 신장의 최초 이식 후 4~7일 후에 수행되며, 공여 쥐에서 신장을 적출할 때 사용하는 주요 단계들을 포함합니다.

혈액 샘플을 수집하기 위해 ISO 플루오린 마취제를 사용하여 공여 동물을 진정시킵니다. 안와하 정량 전혈 크레아티닌 수치를 이식편의 기능을 평가하는 판독 값으로 사용하며, I stat 휴대용 임상 분석기를 통해 측정합니다. 기존 단위에 88.4를 곱하여 SI 단위로 변환합니다.

크레아티닌 농도는 리터당 마이크로몰(µmol/L)로 표시합니다. 동물은 일반적으로 수술 후 2~3시간 후에 회복되며, 남은 자생 신장을 제거한 후 정상적인 마우스 행동을 보입니다. 동물의 생존 여부는 신장 이식편의 기능에 달려 있으며, 이는 동물의 전반적인 건강 상태와 크레아티닌 수치를 매일 검사함으로써 평가할 수 있습니다.

참조를 위해 휴대용 i-STAT 임상 분석기를 사용하여 전혈을 측정합니다. 이식하지 않은 정상 마우스의 크레아티닌 수치는 20 micromolar 부근입니다. 마우스가 질병 징후를 보이고 크레아티닌 수치가 100 micromolar 부근으로 상승하면 신장 이식편 기능 부전으로 간주합니다.

지금까지 마우스 신장 이식 절차를 살펴보았습니다. 이 절차는 기술적으로 까다롭지만, 본 연구실에서는 성공적으로 수행해 왔습니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.