Name: Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 Drosophila 눈 imaginal 디스크에서 GFP 표지 신경교세포의 실시간 이동을 관찰하는 방법을. 이 기술은 신경계 발달 연구에 필수적인 세포 역학 분석을 가능하게 합니다.

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패트릭 카퍼티는 캐나다의 여러 경화증 협회에서 박사 친교에 의해 지원됩니다.

1 부 : 사전 실험 설정. <ol><li> 한 주 미리, 친구 유충을 생성하는 빠르다 glial 특정 발기인의 통제하에 표현 GFP. 우리의 실험에 대한 우리의 반대 극성 (repo) 발기인 (3, 4)를 사용 glial 세포에 표현 핵 로컬 라이제이션 시퀀스 태그 GFP를 시각. </li><li> 1% 하룻밤 건조 폴리 - L - 라이신 솔루션과 공중에서 10 분 18mm 라운드 커버 전표를 몸으로로 사전에 최소한 1 일 이상 전표를 커버 준비합니다. </li><li> 실험 전날, 70 % 에탄올에서 하룻밤 구성 요소를 몸으로하여 Chamlide 자기 문화 챔버 청소. </li><li> 실험의 날, 무균 기술을 사용 슈나이더의 곤충 중간의 10 ML에 태아 소 혈청, 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션, 그리고 인슐린을 추가하여 문화 매체를 준비합니다. 작업 농도는 다음과 같습니다 1X 태아 소 혈청, 100U/ml 페니실린, 스트렙토 마이신 0.1mg/ml, 그리고 슈나이더의 곤충 매체 0.2 MG / ML 인슐린 ((5)에서 수정). </li><li> 문화 챔버는 세포 배양 후드의 건조 공기를 허용합니다. 준비 문화 매체와 rinsing하여 문화 챔버에서 잔여 에탄올을 씻으십시오. </li></ol> 2 부 : Drosophila 눈 - 뇌 복합 해부. <ol><li> 몇 분 동안 얼음에 페트리 접시에 차게 문화 매체의 드롭 플라이 약병과 장소의 측면에서 타사 instar 방황하는 유충을 선택합니다. 유충 등골이 오싹한 것은 절개의 용이성을위한 연동 신체 수축 속도가 느린 것을 권장합니다. </li><li> 해부 현미경 아래 Sylgard 코팅 접시에 배지의 드롭에 차게 유충를 놓습니다. </li><li> 해부 현미경에서 단단히 후부 하순부터 방식의 약 3 분의 1을 유충을 파악하기 위해 더몬트 좋은 포셉 한 쌍의을 사용합니다. 유충은 앞쪽에 끝에서 그 입을 갈고리를 extrudes 때까지 기다리십시오. 입 전체 연장시 포셉의 두 번째 쌍의와 후크 파악. 유충을 해부하다하려면, 천천히 반대 방향으로 포셉의 두 쌍을 가져옵니다. 눈 - 뇌 단지, 침샘, 지방 기관 및 imaginal 티슈와 함께 애벌레 몸 가까이 끌어 것입니다. 입들이 눈 - 뇌 복합 찢을 것이다 빠르게 달리 너무 후크 당기지 마십시오. </li><li> 침샘, 지방 기관 및 울트라 미세 클리퍼 가위를 사용하여 imaginal 디스크를 멀리 낸다. 두뇌와 눈 - 디스크의 두 반구는 복부 신경 코드와 구강 갈고리에 연결된 것입니다. </li><li> 유리 슬라이드에 18mm 커버 전표를 놓습니다. 나중에 커버 슬립을 픽업하기 위해 슬라이드의 가장자리를 걸려 커버 슬립 중 하나 가장자리를 남겨주세요. 18mm 커버 슬립에 문화 매체의 드롭을 추가합니다. 포셉로 입 갈고리를 쥐고하여 문화 매체에 눈을 뇌의 복잡한을 전송합니다. 포셉 또는 조직이 손상됩니다 직접 눈 - 뇌 복합 파악하지 마십시오. </li><li> 미세 해부 가위를 사용하여 입 눈 - 뇌 복잡하고 폐기에서 갈고리에서 트림. 입 후크는 조직 현미경 동안 이동하는 원인이 문화 매체에 계약을 계속으로 입 갈고리 제거 라이브 영상 중요합니다. </li><li> 눈 imaginal 디스크 내에 glial 마이 그 레이션을 시각화하기 위해 조심스럽게 광 스토킹, 뇌 및 안구 디스크를 연결하는 얇은 조직을 잘라 (그림 1A 참조) 머리를 밀어 또는 폐기합니다. 광학 스토킹 이내 glia을 시각화하려면, 뇌, 광 스토킹하고, 그대로 눈을 imaginal 디스크 (그림 1E 참조) 두십시오. </li><li> 포셉를 사용하여 coverslip을 선택하고 영구 마커와 관심의 조직 주위 밑에 원을 그려. 이 서클은 4 부의 현미경을위한 조직을 찾는데 도움이됩니다. </li></ol> 3 부 : 자기 문화 챔버의 눈을 imaginal 디스크를 장착. <ol><li> 포셉 사용하여 coverslip의 매달려 가장자리를 파악. 문화의 조직을 방해하지 않고 Chamlide 자기 챔버의 바닥 접시에 coverslip을 전송합니다. </li><li> Chamlide 챔버의 본체에 실리콘 O - 링 놓습니다. 하단 플레이트 위에 본체를 설치합니다. </li><li> 천천히 실로 문화 매체를 추가합니다. 너무 빨리 또는 관심의 조직이 방해되는 문화 매체를 추가하지 마십시오. 완전히 커버 아래의 가스 교환 수 있도록 챔버를 기입하지 마십시오. </li><li> 부드럽게 Chamlide 챔버의 상단에있는 눈에 보이지 않는 덮개를 놓으십시오. </li></ol> 4 부 : 아이 디스크에 glial 세포를 마이 그 레이션의 시각화. <ol><li> 공촛점 또는 형광 현미경의 무대에서 문화 챔버를 놓습니다. 낮은 배율에서 참조로 coverslip에 동그라미를 사용하여 샘​​플을 찾습니다. </li><li> 40x 렌즈를 사용하여 샘​​플에 초점. 조직이 coverslip에 정착하도록 허용합니다. 눈 디스크 또는 3-4시간 이상의 모든 10 - 15 광학 스토킹의 이미지를 캡처합니다. 조직 트위치과 집중을 밖으로 이동할 수 있습니다. 수동으로 이미지를 캡처하기 전에 조직을 중심으로하는 일을 경감됩니다문제가있다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 : 제대로 수행, 우리 프로토콜은 우리가 눈 imaginal 디스크 (그림 1 BD)로 광학 줄기에서 마이 그 레이션 GFP - 태그 glial 세포의 이미지 일련의를 수집하는있었습니다. 60 분 동안 라이브 이미지는 야생 타입 눈 imaginal 디스크 이내 glial 핵의 위치 변화를 관찰할 수있는 충분한 동안 glial 세포 마이 그 레이션에 필요한 유전자의 돌연변이에 glial 핵 완전히 광학 스토킹 (화살표를 종료하는 데 실패 그림 1 FH). 우리는 교양 조직의 저하를 관찰하기 전에 240분만큼 기간 동안 교양 눈 - 뇌 단지 있습니다. 240 분 시간이 지점에 따라 우리는 교양 눈 - 뇌 단지 (화살표 그림 2 C)를 둘러싼 문화 매체에 GFP 양성 세포를 관찰하기 시작합니다. 추가 GFP에서 조직의 무결성에 고장을 제안 조직 전반에 걸쳐 확산 장소에 축적됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1155/figure1.png" alt="" width="589" height="241" /> 그림 1 : 개발 야생 타입과 돌연변이 시각 시스템에서 GFP - 태그 glial 핵의 라이브 영상. A, E) 이미지 차등 간섭 대비 (DIC) 교양 야생 유형과 돌연변이 눈을 imaginal 디스크 (ED)의 현미경을 사용하여 촬영. 야생 타입, glial 세포에서 태어나되고 눈을 디스크에 광학 스토킹 (OS)에서 마이 그 레이션. 머리가 납작하며 눈 imaginal 디스크의 이미지를 용이하게하기 위해 제거되었습니다. BD) (A) 0, 30, 및 60분 시간 포인트는 GFP - 태그 glial 핵은 눈 디스크 내에 마이 그 레이션 공개에 야생 유형 교양 눈 imaginal 디스크의 형광 현미경. FH) (E) 0, 30, 및 60분 시간이 지점은 광학 스토킹 (화살표) 이내에 GFP - 태그 glial 핵의 연기를 보여줍니다에서 돌연변이 눈 - 뇌 복합 형광 현미경. 두뇌 (BR)은 줄기 내에서 glia의 이미지를 용이하게하기 위해 광학 줄기에 붙어 왼쪽으로되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1155/Figure_2.png" alt="" width="600" height="156" /> 그림 2 : 야생 유형 눈 imaginal 디스크에 GFP - 태그 glial 세포막의 라이브 영상. 우리는 성공적으로 240 분 동안 눈을 두뇌 단지을 배양해 있습니다. 조직 교양 초과 240분 신경 쇠약하기 시작합니다. 300분 시간 점 (C)에 비해 눈에 imaginal 디스크를 둘러싼 문화 매체 (ED), 광학 스토킹 (OS), 0 (A) 150 분 (B)에서 두뇌 기억 상실증이 (BR), 무료 GFP 양성 세포의 화살표로 표시.

<ol><li>Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+chain+migration+requires+pioneer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial chain migration requires pioneer cells.</a> J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).</li>
<li>Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+migration+in+the+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cell migration in the eye disc.</a> J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sepp, K. J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+lacZ+enhancer+trap+lines+to+GAL4+lines+using+targeted+transposition+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 151, 1093-1101 (1999).</li>
<li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epitheia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

이 프로토콜에서는 라이브 현미경을 사용하여 눈을 imaginal 디스크에 glial 세포 이주의 관찰을 설명합니다. 우리의 야생 유형 예를 들어 (그림 1 AD)에서, 우리는 한 시간의 과정을 통해 아이 디스크에 glial 세포의 움직임을 관찰하기 위해 핵 GFP 표지를 사용했습니다. 현재 저희 연구실에서 공부를 아래에 glial 세포 마이 그 레이션에 필요한 후보 유전자에 대한 돌연변이, 우리는 한 시간 동안 (그림 1 EH) 동안 광학 스토킹 이내 glial 세포 핵의 연기를 관찰했다. 우리의 전략은 관심이 우리의 유전자에 의해 규제 세포 행동의 자세한 세부 사항을 시각화하기 위해 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 멤브레인, 이러한 mCD8 - GFP로 GFP 분자를 타겟으로 세포 프로세스를 시각화하는 glia로 표현하실 수 있습니다. 우리의 돌연변이에 glial 세포가 눈 디스크에 같은 filopodia 같은 세포 과정을 확대 할 수있다면 우리가 결정할 수있는 멤브레인 바운드 GFP 표지의 사용. 마찬가지...

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Insect Media</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장 유래 인슐린 용액</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Chamlide 자기 챔버</td><td>도구</td><td>Live cell Instrument</td><td>CM-R-10</td><td>18 mm 커버슬립용 35 mm 디시 타입 챔버</td></tr><tr><td>초정밀 커팅 가위</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 포셉</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>현미경</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>GFP에 필요한 필터와 여기 장치를 갖춘 모든 형광 이미징 시스템을 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

drosophila 아이 imaginal 디스크에 glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

척추 및 무척추 동물 생물 모두 Glial 세포 ensheath하기 위해서는 최종 대상 지역으로 마이 그 레이션과 관련된 뉴런을 지원해야합니다. 최근 진행은 개발 pupal 날개 (1)의 연구에 glial 세포의 라이브 마이 그 레이션을 설명하기 위해 만든되었습니다 있지만<em&gt; Drosophila</em&gt; glial 세포 마이 그 레이션은 일반적으로 고정 조직 검사를 참여했습니다. 운동성이있는 세포의 라이브 현미경 분석의 속도와 성장 방향의 변경을 결정하는 포함하여 철새 과정을 통해 세포 행동을 검사하는 기능을 제공합니다. 유전자 도구의 사용과 결합하여, 라이브 영상은 개발 과정에서 특정 유전자에 대한 더 정확한 역할을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. Silies로 이전 작업<em&gt; 외.</em&gt; (2) 고정 조직에서 눈을 imaginal 디스크로, 광 스토킹, 개발 안구와 두뇌를 연결하는 구조에서 발생하는 glia의 마이 그 레이션하는 작업을 설명하고 있습니다. 여기에 glial 세포의 라이브 마이 그 레이션을 조사를위한 프로토콜을 윤곽<em&gt; Drosophila</em&gt; 눈 imaginal 디스크. 우리는 야생 타입과 돌연변이 동물의 glial 세포의 진행에 따라 개발 glia에 GFP를 표현 Drosophila 라인을 활용.

여기 GFP 태그 glial 세포와 결합하여 라이브 미세 분석을 사용하여 개발 Drosophila의 눈을 glial 세포의 마이 그 레이션을 검사하기 위해 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

척추동물과 무척추동물 모두의 글리아 세포는 관련 뉴런을 초과하고 지지하기 위해 최종 표적 부위로 이동해야 합니다. 반면...

유충의 후단과 전단을 잡고 핀셋을 서로 반대 방향으로 당겨 해부합니다. 초미세 가위를 사용하여 과잉 조직을 제거합니다. 이렇게 하면 유충 뇌-눈 성체원판의 두 반구가 드러납니다.복측 신경삭과 구강 갈고리. 유충의 안구-뇌 복합체를 배양 챔버로 옮깁니다. 야생형 안구 상상판 내에서의 글리아 세포 이동을 시각화하기 위해 뇌엽을 시신경 줄기에서 분리합니다.돌연변이체의 시신경 줄기에 정체된 글리아 세포를 관찰하기 위해, 뇌엽을 시신경 줄기에 부착된 상태로 둡니다. 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 동물학과의 Vanessa Als 실험실 소속 Patrick Cafferty입니다. 안녕하세요, Rin입니다.오늘은 발달 중인 초파리 눈에서 이동하는 글리아 세포를 시각화하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 글리아 세포의 발달을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.실험 시작 일주일 전에, 글리아 세포 특이적 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 유충을 생성하기 위해 초파리를 교배시킵니다. 본 실험에서는 글리아 세포에서 발현되며 핵 국소화 서열이 태그된 GFP의 시각화를 다룹니다. 역극성 프로모터를 사용하여, 실험 전날 최소 하루 전에 1% poly L lysine 용액에 10분 동안 담근 후 하룻밤 동안 공기 중에서 건조시켜 18 millimeter 원형 커버슬립을 준비합니다.실험 당일, 체인 라이드(chain lied) 자기 배양 챔버의 구성 요소를 70% ethanol에 하룻밤 동안 담가 세척합니다. 무균 조작법을 사용하여 배양 배지를 준비합니다. 10 milliliters의 Schneider's insect medium에 fetal bovine serum, penicillin, streptomycin 용액 및 insulin을 첨가합니다.깨끗하게 세척된 체인 라이드(chain lied) 자성 배양 챔버를 세포 배양 후드 내에서 공기 건조시킨 후, 준비된 배양 배지로 헹구어 잔류 에탄올을 제거하십시오. 이러한 준비가 완료되면 초파리 눈-뇌 복합체의 해부를 시작할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 초파리 배양병 측면에서 3령 방랑 유충을 선택하여, 얼음 위에 놓인 페트리 접시 위의 차가운 배양 배지 한 방울에 넣고 몇 분 동안 냉각시키십시오.해부를 용이하게 하기 위해 유충의 연동성 체벽 수축을 늦추는 것이 권장됩니다. 다음으로, 냉각된 유충을 해부 현미경 아래의 아가르 코팅 접시 위에 놓인 한

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우리의 특별 표현하는 소설 빨간색 형광 단백질 (RFP) 기자를...

에있는 아이 Imaginal 디스크의 시각화에 도움을 소설 RFP 리포터 Drosophila</em

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

이 비디오는 신경교세포의 단세포 이미징을 위한 형질전환 초파리 뇌의 면역형광 염색을 보여줍니다. 뇌는 신경교세포 특이적 재조합효소 시스템의 제어 하에 항원 항원결정기의 다양한 조합과 융합된 막 표적 단백질을 발현합니다. 분리되고 고정된 뇌는 항원 항원결정기에 특이적인 1차 항체로 염색된 후 형광단 접합 2차 항체로 염색됩니다. 이 라벨링을 통해 다양한 뇌 영역에 걸쳐 서로 다른 신경교세포 하위 집단을 동시에 이미징할 수 있습니다.

신경교세포의 단세포 이미징을 위한 초파리 뇌의 면역형광 염색

출처: Hellerman, M. B.,  et al.  Pupal Eye의 실시간 이미징. J. Vis. Exp. (2015){{TAG_ 28}}이 비디오는 Drosophila melanogaster 번데기의 눈 패턴을 연구하기 위한 실시간 이미징 기술을 보여줍니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 태그 마커를 사용하면 발달 중인 눈 구조가 형성되는 동안 세포 조직 및 분화를 시각화할 수 있습니다.

형광 현미경을 사용한 Drosophila Pupal Eye의 라이브 이미징

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

초파리의 성체 구조는 상상 원반이라고 하는 주머니와 같은 구조에서 파생됩니다. 이러한 디스크의 분석은 조직 결정, 구획 경계 설정, 세포 증식, 세포 운명 사양 및 평면 세포 극성을 포함한 많은 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 광/형광 현미경 검사를 위해 가상 디스크를 준비하는 데 사용됩니다.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

이 프로토콜은 장기적인 ex vivo 배양과 Drosophila imaginal disc의 라이브 영상에 대한 상세한 방법을 설명합니다. 눈 디스크의 10 시간의 라이브 영상에서 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간단하며 값 비싼 설정이 필요하지 않습니다.

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여기에서는 초파리 난소 틈새 시장에서 생식세포 줄기세포(GSC)의 비대칭 분열에 대한 실시간 이미징을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 분광 단백질 Par-1의 녹색 형광 단백질(GFP) 융합을 유비쿼터스하게 발현하는 형질전환 라인을 사용합니다.

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