Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

유충의 후단과 전단을 잡고 핀셋을 서로 반대 방향으로 당겨 해부합니다. 초미세 가위를 사용하여 과잉 조직을 제거합니다. 이렇게 하면 유충 뇌-눈 성체원판의 두 반구가 드러납니다.

복측 신경삭과 구강 갈고리. 유충의 안구-뇌 복합체를 배양 챔버로 옮깁니다. 야생형 안구 상상판 내에서의 글리아 세포 이동을 시각화하기 위해 뇌엽을 시신경 줄기에서 분리합니다.

돌연변이체의 시신경 줄기에 정체된 글리아 세포를 관찰하기 위해, 뇌엽을 시신경 줄기에 부착된 상태로 둡니다. 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 동물학과의 Vanessa Als 실험실 소속 Patrick Cafferty입니다. 안녕하세요, Rin입니다.

오늘은 발달 중인 초파리 눈에서 이동하는 글리아 세포를 시각화하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 글리아 세포의 발달을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

실험 시작 일주일 전에, 글리아 세포 특이적 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 유충을 생성하기 위해 초파리를 교배시킵니다. 본 실험에서는 글리아 세포에서 발현되며 핵 국소화 서열이 태그된 GFP의 시각화를 다룹니다. 역극성 프로모터를 사용하여, 실험 전날 최소 하루 전에 1% poly L lysine 용액에 10분 동안 담근 후 하룻밤 동안 공기 중에서 건조시켜 18 millimeter 원형 커버슬립을 준비합니다.

실험 당일, 체인 라이드(chain lied) 자기 배양 챔버의 구성 요소를 70% ethanol에 하룻밤 동안 담가 세척합니다. 무균 조작법을 사용하여 배양 배지를 준비합니다. 10 milliliters의 Schneider's insect medium에 fetal bovine serum, penicillin, streptomycin 용액 및 insulin을 첨가합니다.

깨끗하게 세척된 체인 라이드(chain lied) 자성 배양 챔버를 세포 배양 후드 내에서 공기 건조시킨 후, 준비된 배양 배지로 헹구어 잔류 에탄올을 제거하십시오. 이러한 준비가 완료되면 초파리 눈-뇌 복합체의 해부를 시작할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 초파리 배양병 측면에서 3령 방랑 유충을 선택하여, 얼음 위에 놓인 페트리 접시 위의 차가운 배양 배지 한 방울에 넣고 몇 분 동안 냉각시키십시오.

해부를 용이하게 하기 위해 유충의 연동성 체벽 수축을 늦추는 것이 권장됩니다. 다음으로, 냉각된 유충을 해부 현미경 아래의 아가르 코팅 접시 위에 놓인 한 방울의 배양 배지에 놓은 후, 듀몬트 미세 핀셋을 사용하여 유충을 단단히 잡습니다. 후단에서 약 3분의 1 지점을 잡고, 유충이 전단에서 구강 갈고리(mouth hooks)를 밀어낼 때까지 기다린 후, 구강 갈고리가 완전히 확장되면 두 번째 핀셋으로 이를 잡습니다.

유충을 해부하려면 두 쌍의 포셉을 반대 방향으로 천천히 당기십시오. 그러면 안구-뇌 복합체(eye brain complex)가 타액선, 지방체 및 성충판 조직과 함께 유충의 몸체에서 분리됩니다. 입갈고리(mouth hooks)를 너무 빠르게 당기면 안구-뇌 복합체에서 찢어져 떨어질 수 있으므로 주의하십시오.

초정밀 클리퍼 가위(ultra fine clipper scissors)를 사용하여 타액선, 지방체 및 성충 원판(imaginal discs)을 제거합니다. 뇌의 두 반구와 안구 원판은 복측 신경삭(ventral nerve cord) 및 구강 갈고리(mouth hooks)에 부착된 상태로 유지합니다. 그다음, 유리 슬라이드 위에 18 mm 커버슬립을 놓되, 커버슬립의 한쪽 가장자리가 슬라이드 밖으로 나오게 합니다. 나중에 커버슬립을 쉽게 집어 올릴 수 있도록 커버슬립 위에 배양액 한 방울을 떨어뜨립니다.

포셉으로 입 갈고리(mouth hooks)를 잡고 iBrain 복합체를 커버슬립 위의 배양액으로 옮깁니다. eye brain 복합체가 커버슬립으로 옮겨지면, 미세 해부 가위를 사용하여 eye brain 복합체에서 입 갈고리를 잘라냅니다.

입후크(mouth hooks)의 제거는 라이브 이미징(live imaging)에서 중요한데, 이는 입후크가 배양액 내에서도 계속 수축하여 현미경 관찰 중 조직을 움직이게 하기 때문입니다. 시신경삭(optic stalk) 내의 GL을 시각화하려면 뇌 시신경삭과 눈 성충판(eye imaginal disc)을 그대로 유지하십시오. 눈 성충판 내의 글리아 세포 이동(glial migration)을 시각화하려면 뇌와 눈 성충판을 연결하는 얇은 조직인 시신경삭을 조심스럽게 절단하고 뇌를 밀어내거나 제거하십시오.

마지막으로, 핀셋을 사용하여 커버슬립을 들어 올린 후, 영구 마커로 관심 조직 주변에 원을 그립니다. 이 원은 나중에 현미경 관찰 시 조직의 위치를 찾는 데 도움이 됩니다. 이제 눈 상상반(eye imaginal disc)을 자기 배양 챔버에 장착할 준비가 되었습니다.

눈 상상반(eye imaginal disc)을 자기 배양 챔버에 장착하려면, 포셉으로 커버 슬립의 매달린 가장자리를 잡고 배양 중인 조직이 흐트러지지 않도록 주의하며 커버 슬립을 체인 라인 자기 챔버의 바닥 플레이트로 옮깁니다. 다음으로, 실리콘 O-링을 체인 라인 챔버의 본체에 배치합니다. 본체를 바닥 플레이트 위에 천천히 설치합니다.

챔버에 배양액을 추가하십시오. 배양액을 너무 빠르게 추가하면 조직이 교란될 수 있으므로, 커버 아래에서 가스 교환이 가능하도록 주의하십시오. 챔버를 완전히 채우지 말고, 투명 커버를 체인 라인 챔버 상단에 조심스럽게 놓으십시오.

이동하는 글리아 세포를 시각화하려면, 배양 챔버를 공초점 또는 형광 현미경의 스테이지 위에 놓으십시오. 저배율에서 커버슬립 위의 원을 기준으로 샘플의 위치를 찾으십시오. 40배 렌즈를 사용하여 샘플의 초점을 맞추십시오.

조직이 안정될 때까지 기다린 후, 올바르게 수행되었다면 3~4시간 동안 10~15분마다 안구 원반(eye disc) 또는 시신경 줄기(optic stalk)의 이미지를 캡처하십시오. 이 프로토콜을 통해 시신경 줄기에서 안구 상상원반(eye imaginal disc)으로 이동하는 GFP 표지 글리아 세포(glial cells)의 연속 이미지를 얻을 수 있습니다. 야생형 안구 상상원반의 경우 60분 동안의 라이브 이미징만으로도 글리아 핵의 위치 변화를 관찰하기에 충분했으나, 글리아 세포 이동에 필요한 유전자가 돌연변이된 경우에는 글리아 핵이 시신경 줄기를 전혀 빠져나오지 못했습니다.

배양 조직의 손상이 관찰되기 전까지 최대 240분 동안 안구-뇌 복합체를 배양하였습니다. 240분이 지난 시점부터 배양된 안구-뇌 복합체 주변의 배양액에서 GFP 양성 세포가 관찰되기 시작합니다. 또한, GFP가 조직 전체에 산재한 반점 형태로 축적되며, 이는 조직의 무결성 붕괴를 시사합니다.

지금까지 신경교세포 이동을 연구하기 위해 상상원판(imaginal discs)을 배양하는 방법을 살펴보았습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.