Name: 지드 셀의 파생물로 효모 연대기의 수명 Quantifying (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 배우세요 효모의 연대기 수명을 정량화하는 고처리량 방법을 사용하여 세포 생존율을 측정하는 기술입니다. 이 방법은 진핵세포 노화 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 NIH 그랜트 1R21AG031965 - 01A1에 의해 지원되었다. MK는 노화에 엘리슨 의료 재단 신규 장학생입니다.

1 부 : 노화 문화의 작성 <ol><li> YEPD 한천 플레이트에 냉동 주식 (1 % 효모 추출물, 2% bacto - 펩톤, 2 %의 한천, 2 % 포도당)에서 관심 스트 리크 변종. </li><li> 30 ˚ C 48 시간 단일 식민지가 나타날 때까지 전지를 품어. </li><li> 테스트 튜브에 YEPD 액체 매체 5 ML (1 % 효모 추출물, 2% bacto - 펩톤, 2 % 포도당)로 하나의 식민지와 예방을 선택하십시오. </li><li> 30 밤새 문화 ˚ C 쉐이크 또는 롤러 드럼을 사용하여 지속적인 교반을 유지하면서. 그로 </li><li> 숙박 문화의 50 μL와 합성 전체 (SC) 중간 5 ML (표 1)을 예방. 일반적으로 세 SC 문화는 검사되는 각 변형에 대한 수명 분석 세중의 생물 학적 복제를 제공하기 위해 각 변형에 대한 준비가되어 있습니다. </li><li> 30 문화를 유지 ˚ C 전체 실험 (일반적으로 2 개 이상 주) 대한 롤러 드럼에 대한 끊임없는 동요와 함께. </li></ol> 2 부 : 생존 연령 지점을 촬영 SC 미디어 문화의 두 일 후에, 세포는 정지 단계에서해야하고 나이 지점 첫 촬영 준비가 된 것입니다. 이후 나이 지점은 두 개의 주 최소 2-3 일마다 이동해야합니다. 각 연령 포인트 : <ol><li> YEPD 145 μL와 각각 잘 작성하여 접종에 대한 Bioscreen 100 잘 허니콤 접시를 준비합니다. 전용 데이터 분석에 대한 세포 나중에 YEPD과 잘 채워진 적어도 하나를 남겨주십시오. </li><li> 인큐베이터에서 노화 문화를 제거합니다. </li><li> 간단히 와동 문화 중 하나를 누설하지 않도록주의하면서, 허니콤 접시에 주사하는 최초의 문화. </li><li> 혼합 문화의 5 μL를 제거하고 허니콤 판의 첫 ​​우물에 그것을 피펫. 이전과 5 μL 나누어지는을 제거한 후 각 시험관의 입으 불꽃. </li><li> 각 문화에 해당하는 위치를 잘 참고해야되는 각 고령화 문화에 대해이 절차를 반복합니다. 동일한 물론 순위는 전체 실험에​​ 걸쳐 연령 이후의 각 지점에 대해 사용해야합니다. </li><li> 예방 접종이 완료되면 30 ˚ C 배양기에 문화를 교체합니다. </li></ol> 파트 3 : Bioscreen C MBR 시스템을 로딩 <ol><li> 뚜껑을 리프팅하여 보육의 구획을 노출하고 샘플 트레이 덮개를 제거합니다. </li><li> 샘플 트레이 (하나만 번호판을 읽을 경우 왼쪽 슬롯 사용)에 새로 주사 허니콤 플레이트를 삽입합니다. </li><li> 샘플 트레이 덮개를 교체하고 보육 구획에 뚜껑을 낮추십시오. </li><li> 열전달 유체가 최소 입력 레벨 이상 있는지 확인하십시오. 낮은 경우, 제공되는 열전달 유체로 1000 μL 피펫을 사용하여 더 추가합니다. </li><li> Bioscreen 소프트웨어 &quot;EZExperiment&quot;를 사용하여, Saccharomyces cerevisiae의에 적합한 성장 곡선을 얻으려면 다음 매개 변수를 설정합니다 : <ul><li> 샘플 개수 : 미디어 또는 200 우물의 숫자를 입력 </li><li> 필터 : 420 - 580nm, 광대역 </li><li> 온도 : 30 ˚ C </li><li> 실험 기간 : 1 일, 0 시간, 0초 </li><li> 측정 간격 : 30 분 </li><li> 떨고 : 연속 떨고에, 하이 </li></ul></li><li> 수치를 시작하려면 &quot;시작&quot;을 클릭하십시오. </li></ol> 4 부 : 데이터 분석 일반적으로, 여섯 나이에 포인트는 두 주 과정을 점령하고 있습니다. 나이 포인트는 일 2, 4, 6, 9, 11, 13에서 찍은 있습니다. 실험 설계 및 테스트중인 종자에 따라서는 나이 점을 더 많거나 적은 자주 또는 2 주 이상 오래 걸릴하는 것이 바람직하다 수 있습니다. 이것은 데이터 분석 훨씬 쉽게되므로 각 노화 문화, 모든 연령 시점에서 같은 잘 위치에 해당하는 그러한 모든 연령 포인트에 대해 같은 순서로 허니콤 판재를로드하는 것이 중요합니다. <ol><li> Bioscreen C MBR 시스템의 출력 파일을 구합니다. 소프트웨어 &quot;EZExperiment는&quot;마이크로 소프트 엑셀뿐만 아니라 다른 소프트웨어와 호환되는 탭으로 구분된 파일로 Bioscreen 데이터를 출력합니다. 첫 번째 열에는 프로그램은 어떤 시간에 OD 측정은 Bioscreen 허니콤 플레이트 (그림 1) 각 잘 나타내는 이후 열, 실험 기간 동안 찍은. </li><li> 모든 칼럼에서 첫 번째 OD 읽기를 삭제합니다. 이 독서는 &quot;노이즈&quot;입니다. </li><li> 각 열에있는 모든 OD 값에서 혼자 YEPD와 우물의 OD 값을 빼서하여 데이터를 정상화. 이것은 미디어에 의해 배경 흡광도를 제거합니다. </li><li> 가지의 곡선을 플롯. 곡선은 나이의 기능 (그림 2)로 이동합니다. 예를 들어, 여섯 시간 동안 열 포인트 1 (허니콤 판 잘 1)에서 가지 곡선을하려하여 시간이 지남에 따라 곡선의 독특한 rightward 변화가 있습니다. </li><li> 각 잘 2 일 나이 지점의 성장 반응 속도론에 기반 복제 시간 (δ)을 계산. 공식 복제 시간을 계산하는 데 사용 IS : <img src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" alt="방정식" /> OD 1 OD 2 연속 OD 측정 및 t 1과 t 2 측정 사이의 시간을 대표하는 곳. 0.5-0.2의 OD 값 사이의 시간만을 배로 계산합니다. 이러한 가치의 평균은 잘 대해 배로 시간입니다. 0.5-0.2의 OD 값 사이의 시간만을 배로 계산합니다. 이러한 가치의 평균은 잘 대해 배로 시간입니다. 대부분의 야생 형 효모 계통 85~90분 사이의 복제 시간 값을 제공해야합니다. </li><li> 각 연령 포인트 (2 일) 연령 지점 초기에 상대적으로 가지 곡선의 시간 변화 (Δt) 계산합니다. 이 작업을 수행하는 쉬운 방법은 연령 지점 초기 시대 이후의 각 점 사이에 0.3의 OD에 도달 각에 대해 잘했습니다 시간의 길이의 차이를 결정하는 것입니다. 특정 잘 0.3의 OD에 도달하는 시간은 두 시간 포인트 bracketing OD = 0.3 사이의 시간의 함수로 아까에 해당하는 선형 회귀 방정식 (OD)에서 계산하실 수 있습니다. </li><li> 생존 곡선 (그림 3)를 생성하기 위해서는 각 연령 시점에서 살아남은 소수를 계산합니다. 100 % 생존하는 최초의 세 점 (2 일)을 정의합니다. 세 점 각각의 연속에 대한 방정식을 사용하여 %의 생존을 계산 : <img src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" alt="둘째 등식" width="245" height="115" /> S n은 생존 비율이고, Δt n은 시간 근무이며, δ n은 복제 시간입니다. </li><li> 시대의 함수로 가능한 세포의 분율 (또는 퍼센트)하려하여 생존 곡선 (그림 3B)로 각각 잘 (또는 복제 웰스)을 원하는를 생성합니다. </li><li> 각 잘 대해 생존을 통합 (SI)를 계산합니다. SI는 생존 곡선 아래의 면적으로 정의되며 수식으로 추정 수 있습니다 : <img src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" alt="방정식 3" width="400" height="79" /> 어디 연령 n은 세 점 (예 : 2, 4, 6, 9, 11, 13)이며 S N 그 연령 시점에서 생존의 가치입니다. </li><li> SI 및 생존 데이터 복제 웰스의 통계적 매개 변수를 확인합니다. 관심 일반 통계 매개 변수는 말은, 중간, 그리고 복제 생물의 각 집합에 대한 편차를 포함합니다. T - 테스트 또는 유사한 분석은 다른 실험 및 제어 그룹에 대한 SI의 pairwise 비교에 사용될 수 있습니다. 그것은 또한 생물학은 복제 평균에서 4.8에 설명되어있는 생존 곡선을 생성하는 것이 바람직하다 수 있습니다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 실험의 완료에, 당신은 여러 가지 변종이나 조건에 대한 연대기 노화 가능성을 결정하기 위해 충분한 생존 곡선 및 수행 데이터 분석을 해본 것입니다. 제대로 수행한 경우, Bioscreen C MBR 시스템에서 얻은 성장 곡선은 그림 2에 표시된 것과 비슷하게해야하고 그 결과 생존 곡선은 그림 3과 같이 사람과 유사합니다. 일반적으로, 여기에서 설명한 조건 교양 야생 형 전지 7 일의 순서에 중간 연대기의 수명을해야합니다. 생존에 상당한 변화가 다른 변종과 같은 0.05 % 포도당 미디어의 성장과 같은 몇 가지 조건 하에서 관찰이며, 평균 생존은 30 일 초과할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" alt="" /> Bioscreen 프로그램 &quot;EZExperiment&quot;에서 그림 1. 데이터 출력. 열 A는 흡광도 읽기가 찍은되는 시간을 표시합니다. 연속 열은 노화 문화에서 가져온 세포와 주사 허니콤 접시의 우물을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" alt="" /> 그림 2. 실험 과정을 통해 하나의 생물 학적 복제에서 가지 곡선. 노화 문화에 세포가 생존을 잃게으로 시간이 지남에 따라 곡선에 뚜렷한 변화가 있습니다. 초기 시점 (2 일)와 연속 시점 사이의 시간은 특정 나이에 생존을 결정합니다. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" alt="" /> 그림 3. A) 그림 1에서 가지 데이터를 사용하여 생성 생존 곡선. 2 일 시점은 100 % 생존 지점으로 설정됩니다. B) 2 계통의 최종 생존 곡선이 같은 실험에서 테스트. 이러한 생존 곡선은 생물 각 변형에 대한 복제 세 평균 viabilities을 나타냅니다. 오류 막대는 생물은 복제 시간 표준 편차를 나타냅니다. 생존 곡선 아래에있는 회색 영역은 스트레인 1 생존 통합 (SI)를 나타냅니다. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> 표 1. 연대순 노화 연구에 사용 합성 정의된 중간 (변형 backgrouND BY4743) </td></tr><tr><td> 구성 요소 </td><td> 농도 (g / L) </td></tr><tr><td> D - 글루코오스 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 효모 질소베이스 (-AA/AS) </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> 아데닌 </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L - 아르기닌 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L - Aspartic 수 소산 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L - 글루탐산 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L - 히스티딘 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L - 류신 </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> L - 라이신 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L - 메티오닌 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L - 페닐알라닌 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L - 세린 </td><td> 0.375 </td></tr><tr><td> L - 트레오닌 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L - 트립토판 </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L - 티로신 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L - 발린 </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> 유라실 </td><td> 0.1 </td></tr></tbody></table> 참고 :이 제조법은 diploid BY4743 변형에 auxotrophies를 차지하고 있습니다. 아미노산 auxotrophies은 합성 전체 매체 배 최종 농도를 추가하여 보상하여야한다.

<ol><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29(2008).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73(2003).</li>
<li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113(2008).</li>
<li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055(2004).</li>
</ol>

여기에서 설명한 높은 처리량 연대기 수명 분석은 높은 정확성과 정밀도와 변종 다수의 고령화 잠재력을 quantifying위한 효과적인 방법입니다. 식민지 - 형성 단위 (예 3 참조) 계산에 의해 생존을 결정하는 고전적인 방법을 통해이 방법의 주요 사전은 높은 해상도의 성장 곡선을 얻기 위해 같은 Bioscreen C MBR 시스템으로 쉐이크 / 보육 / 플레이트 읽기 장치의 사용이다 각 나이 가리 킵니다. 낮은 처리량 연대기 수명의 assays와 직접 비교,이 방법은 크게 4 분석할 수 샘플의 수를 증가하면서 비교 (이상) 정밀도를 달성하기 위해 표시되었습니다. 위에서 설명한 방법은 노화 연구에 대한 일반적으로 사용되는 문화 조건 변경 연대기 장수 유전자 변종을 검사에 적합합니다. 이 방법은 쉽게 다른 문화와 같은 호흡기 성장에 사전 적응 (글리세롤 탄소 소스) 5, 물속에 유지 보수보다는 만료 미디어와 같은 조건,...

<table><tbody><tr><td>Bacto 펩톤</td><td>시약</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 효모 추출물</td><td>시약</td><td>BD Biosciences</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>Difco 한천</td><td>시약</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base (아미노산 및 황산암모늄 제외)</td><td>시약</td><td>MidSci</td><td>J630-500G</td><td></td></tr><tr><td>아미노산</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>황산암모늄</td><td>시약</td><td>Spectrum</td><td>AM185</td><td></td></tr><tr><td>덱스트로스</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Bioscreen C MBR 기기</td><td>도구</td><td>Growth Curves USA</td><td>5101370</td><td></td></tr><tr><td>Bioscreen 100-웰 허니콤 플레이트</td><td>도구</td><td>Growth Curves USA</td><td>9502550</td><td></td></tr></tbody></table>

지드 셀의 파생물로 효모 연대기의 수명 quantifying

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

신진 효모<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; 노화 연구 분야에서 중요한 모델 생물로 입증되었습니다<sup&gt; 1</sup&gt;. replicative 및 연대기 생활에 걸쳐이 효모에서 노화 연구에 사용이 설립 패러다임입니다. Replicative 노화가 단일 효모 어머니 세포가 노화하기 전에 생산 딸 세포의 숫자로 정의되며 연대기 노화 시간이 세포의 길이에 의해 정의 것은 아닌 나누어, 정지 같은 상태에서 살아남을 수<sup&gt; 2</sup&gt;. 우리는 연대순 수명의 양적 측정을위한 높은 처리량 방법을 개발했습니다. 이 방법은 선동 아래 정의된 중간에서 일정한 온도에서 세포를 노화 포함됩니다. 각 연령 시점에서 세포의 하위 인구 노령화 문화에서 제거되며 풍부한 성장 매체에 주사. 고해상도의 성장 곡선은 다음 Bioscreen C MBR 시스템을 사용하는 세 세포의 하위 인구 얻을 수 있습니다. 알고리즘은 다음 각 연령 시점에서 성장 반응 속도론에 따라 각 하위 인구 가능한 세포의 상대적인 비율을 결정하기 위해 적용됩니다. 이 방법은 재현성과 정밀도를 유지하면서 다른 연대기 수명의 assays에 비해 실질적으로 더 적은 시간과 자원이 필요합니다. 이 분석의 높은 처리량 자연은 좀더 복잡한 유기체에 추가 테스트를위한 새로운 장수 수정자를 식별하는 대규모 유전 및 화학 스크린을 허용해야합니다.

효모의 연대순의 노화는 고정 단계에서 시간과 관련된 세포 생존 능력의 상실을 말합니다. 여기 양적 효모 연대기 수명을 결정하는 높은 처리량 방법을 설명합니다.

지드 셀의 파생물로 효모 연대기의 수명 Quantifying

출아 효모인 Saccharomyces cerevisiae는 노화 연구 분야에서 중요한 모델 생물임이 입증되었습니다 1. 복제 및...

노화 배양물은 30 °C에서 지속적인 교반 상태로 시험관에 보관됩니다. 롤러 드럼을 사용하여 각 노화 배양물로부터 세포 분량을 취해 YEPD 배지가 담긴 바이오 스크린 허니콤 플레이트의 웰에 접종합니다. 바이오 스크린 CMBR 장비는 허니콤 플레이트를 24시간 동안 배양 및 진탕시키며 각 웰의 광학 밀도를 측정합니다.바이오 스크린에서 출력된 데이터를 통해 30분 간격의 성장 곡선을 생성할 수 있으며, 이를 이용하여 각 노화 배양액의 생존율을 계산할 수 있습니다. 24시간 배양 후 허니콤 플레이트 웰 내의 세포 밀도는 원래 노화 배양액의 생존율에 따라 달라질 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 워싱턴 대학교 병리학과 Matt Capline 박사님 연구실의 Chris Murakami입니다.오늘은 노화 세포의 외성장을 이용하여 효모의 연대적 수명을 정량화하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 유전적 요인과 환경적 요인이 효모의 수명에 어떻게 영향을 미치는지 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.노화 배양물을 준비하려면, 먼저 냉동 보관된 효모 균주를 YEPD 평판 배지에 도말하고 30 °C에서 48시간 동안 또는 단일 콜로니가 나타날 때까지 배양합니다. 단일 콜로니가 나타나면, 개별 콜로니를 채취하여 5 mL의 YEPD 액체 배지에 접종합니다.시험관에서 30 °C의 롤러 드럼을 이용해 하룻밤 동안 배양하여 지속적인 교반 상태를 유지한다. 하룻밤 배양이 끝나면, 각 배양액 50 µL를 사용하여 5 mL의 합성 완전 배지(synthetic complete medium)에 접종한다. 일반적으로 분석 중인 각 균주에 대해 세 개의 SC 배양액을 준비하여, 수명 분석의 생물학적 3반복(triplicate biological replication)을 수행한다. 배양 후 2일이 지난 시점부터 일반적으로 2주 이상 지속되는 전체 실험 기간 동안, 롤러 드럼을 이용해 30 °C에서 지속적으로 교반하며 배양액을 유지한다.SC 배지에서 세포가 정지기(stationary phase)에 도달하면 첫 번째 연령 지점의 샘플을 채취할 준비가 된 것입니다. 이후의 연령 지점 샘플은 최소 2주 동안 2~3일마다 채취해야 합니다. 이 절차를 시작하려면 바이오 스크린(bio screen)을 준비하십시오.각 웰에 145 µL의 YEPD를 채워 접종용 100웰 허니콤 플레이트를 준비합니다. 이후 데이터 분석을 위해 세포 없이 Y

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연구

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생물학

이 문서에서 우리는 효모 어머니 세포의 replicative의 수명을 측정하는 일반적인 프로토콜을 제시한다.

버딩 효모에 Replicative 수명 측정

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변동 테스트를 통해 측정 된 사카로 미세스 세 레비 시아 젊은 세포에서 돌연변이 비율이 상이한 연령의 증식 및 모 세포의 돌연변이 빈도를 예측하는데 사용된다. 자기 정렬 및 유동 세포 계측법은 다음 예측 돌연변이 주파수에서 모든 편차를 식별하기 위해 실제 돌연변이 주파수와 어머니 세포의 나이를 측정하는 데 사용됩니다.

어머니 세포 및 변동 시험의 자기 정렬을 결합에서 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성을 분석합니다 사카로 미세스 세 레비 시아

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