Name: 마우스 Oocytes에 핵 전송 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: 배우세요 마우스 난모세포에서 핵 전송 기술을 이용한 세포 재프로그래밍 방법을. 이 프로토콜은 분화된 핵을 배아 상태로 재프로그래밍하여 줄기세포 연구와 재생의학에 활용하는 데 필수적인 기술을 제공합니다.

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DE는 프로토콜의 중요한 독서에 대한 그의 NT 트릭과 박사 스테판 설리번과 개렛 Birkhoff를 공유하기위한 박사 숨기기 아쿠쓰 감사하고 싶습니다.

준비 : <ol><li class="jove_step"> superovulation 및 microdrop 배아 문화의 자세한 설명은 다른 두 찾을 수 있습니다. </li><li class="jove_step"> 배아 문화 매체 microdrops (예 : KSOM, Chemicon)를 배양 접시를 준비합니다. 미네랄 오일 (미네랄 오일 일괄는 배아 문화과의 호환성을 위해 테스트해야합니다)와 커버. 37 평형 ° 공기 플러스 5% CO 2에서 C. (온습 전자 3,110 물을 외피 보육 또는 동급에서) </li><li class="jove_step"> oocytes의 격리를 위해 요리를 준비 : hepes 장소의 방울은 다른 반쪽의 요리와 HCZB 중 절반 (0.1 % W / V, 시그마) hyaluronidase &amp; CZB 버퍼. 미네랄 오일 커버. 해부 현미경의 열띤 무대에서 요리를 따뜻하게 유지. </li><li class="jove_step"> 플레이스 약 50 μ M (oocyte의 직경보다 약간 작은)의 외경의 개최 피펫, 피펫 한 자의 약 20 μ m의 개방 : 현미경을 준비합니다. 개최 pipettes는 필요한 장비, 바늘 풀러 (셔터 인 스트 루먼트)와 microforge (Narishige)로 만들어 쉽게, 그러나 그들도 Humagen에서 구입하실 수 있습니다. micropipette (내경 8 μ의 m)의 꼬리에 3-5 μ의 내 수은을로드합니다. 수은의 유출을 피하십시오. 여러 개의 작은 방울 11% 각 HCZB에 W / V PVP (polyvinylpyrrolidone) 5 μ g / HCZB에 ML cytochalasin B와 함께 요리를 준비합니다. 뚜껑은 잡고 핵의 제거의 pipettes의 움직임을 방해하지 않습니다 짧은 가장자리가로 페트리 접시의 뚜껑보다는 접시 자체를 사용합니다. HCZB 드롭에서 개최 피펫과 핵의 제거의 피펫을 맞춥니다. 개최 피펫의 끝에 조금 HZCB를 대기음. </li><li class="jove_step"> 기증자 세포의 준비는 크게 셀 유형과 조사가 수행하고자하는 실험에 따라 달라집니다. 일반적으로 기증자 세포는 같은 트립신과 같은 proteolytic 효소로 치료 및 전송까지 끈적 거림을 줄이기 위해 얼음에 보관해야합니다. </li><li class="jove_step"> 편안 hCG의 관리 후 생쥐에게 14~15시간를 안락사. 하베스트 oviducts과 따뜻한 HCZB - hyaluronidase 방울에서 그들을 해부하다. 후 약. 5 분, oocytes는 적운 세포에서 대부분 무료입니다. 그런 다음 다음 사전 equilibrated KSOM의 방울에서 추가 씻어, HCZB에서 여러 번 씻어, 그리고 핵의 제거까지 인큐베이터에 보관해야합니다. </li></ol> 핵의 제거 노는 그러한 니콘 TE200로 거꾸로 현미경에 유압 micromanipulators (Narishige)로 이루어집니다. 압전의 micromanipulator (Primetech)은 조나 pellucida를 시추하는 데 사용됩니다. 플랫 - 스쳐 핵의 제거 및 전송 pipettes은 Humagen에서 구입하실 수 있습니다. 미세한 수은의 방울을 추방하여과 PVP를 aspirating하고 추방하여 깨끗하고 PVP 방울의 핵의 제거의 피펫에 기름칠을. 바늘의 끈적 거림을 방지하기 위해 같은 절차를 중 enucleated 또는 전송됩니다 oocytes 각 그룹 사이에 완료되어야합니다. HCZB - cytochalasin B 드롭에 oocytes의 작은 그룹을 놓으십시오. 그룹의 크기는 조사의 경험의 수준으로 조정해야합니다. Oocytes은 20-30 분 이상을 위해 무대에 보관해서는 안됩니다. HCZB - cytochalasin B 방울로 악기를 이동합니다. 개최 피펫과 피펫의 핵의 제거는 oocyte의 적도 평면과 정렬을 가지고 있어야합니다. 보관 피펫이 oocyte 자체보다 약간 작은 외경이있다면이 가능합니다. 다른 굴절률 metaphase 스핀들을 볼 수있을 때까지 oocyte를 돌리세요. 초보자가 스핀들을 볼 수없는 경우, metaphase 판은 효율적인 배아 발달과 호환되지 않습니다 그러나 DNA 염색 Hoechst와 자외선 조명을 사용하여 확인할 수 있습니다. 3 시방향에 metaphase 스핀들 위치하고 개최 피펫과 잘 들어요. 조나 pellucida에 침투 압전 펄스를 적용합니다. 핵의 제거의 피펫으로 metaphase 접시를 터치. metaphase 스핀들의 저항은 &#39;기분&#39;가능되면 스핀들을 기음과 바늘을 철회. 피펫과 접촉할 때 oocyte의 세포질은 유체이며, metaphase 스핀들 그러나 덩어리로 이동합니다. 스핀들과 함께 제거됩니다 세포질의 양을 줄이기 위해보십시오. oocytes의 그룹이 enucleated 후에는 배아 문화 매체를 통해 그들을 씻어 및 전송까지 배양기에 그들을 놓으십시오. 일부 enucleated oocytes는 전송하지 않아야하지만, 활성화되어야하며 핵의 제거를 제어하는​​ 역할을합니다. 몇 시간이 oocytes 것입 조각, 성공적인 핵의 제거를 말해줍니다. 핵 전송 PVP 용액 (11 % HCZB에서 PVP)에 플레이스 세포. 1 세포 단계에서 많은 클론의 체포하면 PVP 농도 5 % 이하로 인하해야합니다. 혼합 세포 잘 재치H PVP. 세포의 지름보다 약간 작은 내경을 가진 피펫과 조직을 선택하십시오. 세포의 막이 열망에 휴식한다. 어떤 경우에는 반복적인 추방과 열망뿐만 아니라 부드러운 압전 펄스의 응용 프로그램은 기증자의 세포를 휴식하는 데 사용할 수 있습니다. 기증자 세포가 잠시 후 끈적 해짐에 따라 기증자 세포의 새로운 방울이 전송되는 oocytes의 각 단체와 함께하여야한다. 곧 멤브레인을 깨는 후 깨진 기증자의 세포를 주사. 전송, oocyte 자체보다는 조나 pellucida의 적도 비행기의 적도 비행기에 초점을, 같은 비행기의 전송 및 보관 피펫 위치를. 단호의 세포질의 일부​​를 포함한 oocyte 잡아. 압전 펄스를 사용하여 조나 pellucida에 침투. 피펫의 팁을에 기증자의 핵을 가지고 다음 oocyte에 깊은 고랑을 만들고, 가까운 개최 피펫에, 거의 enucleated oocyte의 반대편에 피펫 팁 밀어. 피펫으로 oocyte의 세포질의 매우 작은 금액을 기음, oocyte 막을 깰 수있는 하나의 약한 압전 펄스를 적용 기증자의 핵을 추출, 고랑의 오른쪽 끝에있는 세포질 막에 aspirating 동안 급속하게 바늘을 철회. 동시에 바늘을 철수하고 aspirating함으로써, NT에 의해 남겨진 구멍을 닫을 수 있어야한다. 이 &#39;구멍 제거 기술은 NT 동안 lyse oocytes의 수를 줄일 수 있습니다. KSOM에서 복원 oocytes을 씻고 1-3시간위한 배양기로 돌아갑니다. Oocyte 활성화 칼슘 무료 MCZB의 방울과 칼슘을 무료로 MCZB 플러스 10mM 시니어 2 방울과 나머지 절반과 요리 중 하나가 절반을 준비 + 및 북극 신체 압출을 억제 5 μ g / ML cytochalasin B. 30 분 평형. 5 미만 %가 공중으로 2 CO. 칼슘 무료 MCZB에 잘 NT의 배아를 세척 후 칼슘 무료 MCZB의 다른 방울의 작은 그룹에서 그들을 놓으십시오. 5~6시간에 대한 보육 및 문화에 요리를 반환합니다. 인공 인증 프로토콜 및 배아 문화 조건을 제어하려면이 아닌 enucleated oocytes를 사용해야합니다. 그들은 parthenogenetic의 배아로 개발합니다. 활성화에 따라, 장기 문화의 인큐베이터에 KSOM과 장소 배아를 통해 배아를 씻으십시오. Pronuclei가 성공적으로 전송을 나타내는,이 시점에 표시되어야합니다. 배아 문화 미디어 요리책 마스터 솔츠 무균 1 L 병에 980 ML ultrapure H 2 O로 시작 건조 구성 요소를 추가합니다 NaCl 4,760 MG (81mM) 시그마 S - 5886 KCl 360 MG (5mM) 시그마 P - 5405 MgSO 4 • 7H 2 O 290 MG (1.18mM) 시그마 M - 2773 KH 2 PO 4 160 MG (1.17mM) 시그마 P - 5655 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 2NA 40 MG (0.1mM) 시그마 E - 6635 포도당 (D) 1000 MG (5.5mM) 시그마 G - 6152 액체 구성 요소 추가 나 - 락트 산 (젖산) 5.3 ML &amp; NBSP; 시그마 44,263 Pen&#39;Strep 10 ML Gibco 15140-122 MCZB 스톡 솔츠 경우 : 소독 500 ML 마스터 소금을 (; 4 저장 ° C 3~4개월에 좋은) 필터 HCZB 스톡 솔츠 경우 : 500 ML 마스터 염 시작 (; 시그마 P - 8136 얼음 용해) 50 MG PVA 추가 30-60 분 및 필터 멸균 (; 4 저장 ° C 3 개월 동안 좋은)에 휘저어 칼슘 + + 무료 MCZB (5 % CO 2에서 oocytes 활성화를위한) 99 ML MCZB 주식 염 시작 건조 구성 요소를 추가합니다 NaHCO 3 211 MG 시그마 S - 5761 나 - pyruvate (pyruvic 산성) 3 MG 시그마 P - 4562 L - 글루타민 15mg 시그마 G - 8540 소 혈청 알부민 (BSA) 500 MG 시그마 A - 3311 모든 구성 요소까지 소용돌이가 해소되며 살균 필터. HCZB (주위 분위기에서 미세 조작에 대한) 99 ML HCZB 주식 염 시작 건조 구성 요소를 추가합니다 Hepes - 나 520 MG 시그마 H - 3784 NaHCO 3 42 MG 시그마 S - 5761 액체 구성 요소를 추가합니다 128 MM CaCl 2 (18.8g / L) 1 ML 시그마 C - 7902 1 N HCL와 7.5 산도를 조정 녹아까지 소용돌이, 멸균 필터.

<ol><li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEggan%2C+K+%22Mammalian+and+Avian+Transgenesis-+New+Approaches%22">Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches</a>. Pease, S., Lois, C. , Springer. (2006).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%22">Manipulating the mouse embryo</a>. Press, C. S. H. L. , (2003).</li>
<li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394, 369-374 (1998).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

프로토콜 부분에 추가적인 버퍼의 성분을 확인하시기 바랍니다.

마우스 oocytes에 핵 전송

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

unfertilized oocyte에 핵 송금은 차별화된 세포로 발달 잠재력을 복원할 수 있습니다. 이것은 개발, 차별과 노화 기본 프로세스가 아니라 유전자 공정보다 epigenetic는 것을 보여줍니다. 이러한 프로세스의 안팎이 없게 짠 천성은 재생 의학에서 기초 연구에 흥미로운 관점을 열고, 그리고 더 먼 미래 인치 마우스에서 배아 줄기 세포는 복제 preimplantation 스테이지 배아에서 파생된 수 있습니다. 이러한 배아 줄기 세포는 성인 유기체의 모든 세포 유형을 일으키다 수있는 능력이 있습니다. 중요한 것은,이 세포는 기증자에게 유전자 동일합니다. 인간에 ​​적용되는 경우,이 환​​자에서 줄기 세포의 파생을 허용합니다. 이러한 세포는 다음 환자의 영향을 세포 유형으로 차별하고 체외에서 공부하거나, 손상되었거나없는 세포를 대체하는 데 사용할 수 있습니다. 그것이 핵 프로그래밍의 원리에 대한 정보를 알려줄 수로 마우스에 핵 이전의 연구는 중요한 남아 있습니다. 이 영화와 함께 프로토콜이 마우스에 핵 이전을 학습 수 있도록 도와 드리기위한 것입니다, 처음에 교수 야나기 (와카야마 외. 1998)의 그룹에있는 방법을 개발했습니다.

이 영화와 프로토콜은 핵 이전을 학습 수 있도록 도와 드리기위한 것입니다.

마우스 Oocytes에 핵 전송

미수정 난자로의 핵 이식은 분화된 세포의 발달 능력을 회복시킬 수 있습니다. 이는 ...의 기저에 있는 과정들이...

저희 연구 그룹은 리프로그래밍에 관심이 있기 때문에 핵 이식(Nuclear transfer)을 수행합니다. 이는 분화된 핵이 배아 상태로 리프로그래밍될 수 있다는 점에서 매우 흥미로운 과정입니다. 여기 준비된 시약들은 SUM과 HCCV이며, 이것은 hyaluronidase입니다.먼저 배양 접시를 준비하며, 이는 CO2 농도를 맞추기 위해 인큐베이터에 넣을 것입니다. 미네랄 오일로 덮인 여러 개의 방울들이 있으며, 이를 통해 CO2 분위기를 보정합니다.이제 HCZB 한 방울을 떨어뜨립니다. 이는 세척용으로 사용됩니다. 이는 고농도이며 다시 미네랄 오일로 덮여 있습니다.이 높은 수치는 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 처리하면 감소합니다. 여기 이 부분은 단순히 HCCP 드롭입니다. 이것들은 세척용입니다.이 과정은 O 측면에서 ulu 세포를 제거하기 위한 것입니다. 이 단계에서는 가열이 진행되므로, 제가 돌아와 쥐의 오일 징후를 확인하고 모든 부위를 미네랄 오일로 덮을 때까지 온도가 올라갈 것입니다. 여기 있는 PVP 드롭은 바늘 세척 및 세포 투입용이며, 이것은 HCCB와 Cyla B입니다. 그리고 여기서 조작을 수행하겠습니다.여기 바늘 색상이 보입니다. 지금 바늘을 하나 뽑겠습니다. 네, 아주 얇고 적당한 바늘이 준비되었습니다.지금 보시는 것은 마이크로 포지(micro forge)입니다. 적절한 크기의 홀딩 피펫을 만들기 위해 바늘을 특정 위치에서 절단해야 합니다. 유리 구슬을 가열한 후, 바늘을 내려 유리 구슬에 녹여 붙이면 바늘이 부러지게 됩니다.이것을 밀어냅니다. 부러진 바늘의 상태가 완벽한 것을 볼 수 있습니다. 이제 여기 아래로 내려가서, 열을 올립니다.이제 유리 구슬이 붉게 변하며 녹기 시작합니다. 유리 구슬을 밀면 곡선 형태가 만들어집니다. 이 정도면 충분합니다. 이제 제거하겠습니다.보시는 것처럼, 이제 바늘을 삽입합니다. 방금 홀딩 피펫을 이 헤드에 장착했습니다. 이제 이를 다시 현미경에 삽입하십시오.마이크로 피펫과 모세관이며, 수은이 채워져 있습니다. 이 팁에 수은을 채웠습니다. 여기 모세관에 수은을 채웁니다.내부에 삽입합니다. 바늘을 이 헤드 부분에 고정하십시오. 꽉 조인 후, 뒤로 당깁니다.여기서 시계 방향으로 돌리면 수은이 앞으로 밀려나와 확인할 수 있습니다. 이제 팁을 오일에 넣습니다. 보이죠? 이제 바늘을 아래로 이동시켜 시야를 확보하겠습니다.수은 방울을 약간 배출하고 QVP를 일부 흡입합니다. 그렇게 하시면 됩니다. 그런 다음 다시 위로 올리십시오.HCCB로 가서 구멍 아래로 이동합니다. 마우스 피펫인 P로 향합니다. 여기에 삽입할 모세관을 준비해야 합니다. 감사합니다. 됐습니다. 좋습니다.모세관을 준비합니다. 그리고 파이프 안에 넣습니다.저는 스위스에서 왔으며, 1년 전 이 연구를 시작하며 K 교수님 연구실에 합류하여 핵 이식 기술을 배우기 시작했습니다. 이곳은 정말 훌륭한 곳이며, 여기서 연구할 수 있어 매우 기쁩니다. 물론 이 실험은 매우 복잡하여 진행 과정에서 많은 문제가 발생할 수 있습니다.따라서 실험을 시작할 때, 핵 형성 과정이나 전이 과정 중에 많은 세포가 용해되는 것과 같은 문제에 직면할 수 있습니다. 또는 성공적으로 전이를 수행했음에도 불구하고 세포가 발달하지 않는 경우도 있으며, 여기에는 항상 수많은 이유가 있을 수 있습니다.모든 사이트의 배양 시스템부터 시작하시면 됩니다. 따라서 배양 시스템과 인큐베이터를 테스트하기 위해 유전적 대조군이나 일부 수정란과 같은 대조군이 항상 필요합니다. 그리고 현미경 사용 기술 또한 숙달해야 합니다.따라서 측면을 안정적으로 접종한 후 다시 옮길 수 있을 때까지 많은 연습이 필요합니다. 이는 단순히 연습의 문제이며, 숙달되기까지 몇 주 또는 몇 달이 걸릴 수 있습니다. 그 외의 과정이 완료되면 장기간의 실험을 진행할 준비가 된 것입니다.따라서 이를 위해 하루 전체를 비워두는 것이 좋습니다. 또한 초기에 까다로운 부분 중 하나는 마우스 피펫팅입니다. 기포가 생기지 않도록 잘 조절하고 시야를 놓치지 않아야 하며, 특히 클론을 손상시키지 않도록 주의해야 합니다. 왜냐하면 luscita의 외층이 열려 있어, 마우스 작업을 할 때 클론이 손상되어 해당 sonar lucita 밖으로 유출될 가능성이 있기 때문입니다.따라서 마우스 파이프에 오일이 들어가지 않도록 주의해야 합니다. 너무 세게 빨아들이거나 불지 않도록 해야 하며, 이러한 기술은 비교적 쉽게 습득할 수 있습니다.

Research

연구

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배우세요 마우스 난모세포에서 핵 전송 기술을 이용한 세포 재프로그래밍 방법을. 이 프로토콜은 분화된 핵을 배아 상태로 재프로그래밍하여 줄기세포 연구와 재생의학에 활용하는 데 필수적인 기술을 제공합니다.

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