Name: 내유 이미징 창문 Dendra2 Photoswitching (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 마우스 유방 지방 패드에서 Dendra2 형광 단백질을 이용한 내유 이미징 및 포토스위칭 방법을. 이 기술은 종양 미세환경에서 암세포의 전이 행동을 실시간으로 관찰하는 데 활용됩니다.

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(; JC, JES 및 JW하는 CA100324, JvR에 U54GM064346 JES하는 CA77522, JC와 BG에 U54CA126511)이 작품은 미국 국방과 (BG 및 DK로 BC061403 BC075554로), 건강의 미국 국립 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 현미경, 이미징 상자와 F4/80 항체에 대한 J. 폴라드 (의학의 앨버트 아인슈타인 대학)의 제조에 대한 도움 M. Rottenkolber에 대한 도움말 D. Entenberg 감사합니다.

1. 내유 지방 패드로 종양 세포의 주입을 사용하여 형광 종양의 생성 : <ol><li> 80% confluency - 40 Dendra2 단백질 (세포질 마커 등) 표현 세포 라인을 성장. </li><li> PBS w / O 칼슘 2 요리 적어도 3 번 린스 + 또는 MG 2 +. </li><li> 37 10cm 요리와 부화 당 트립신 3 ML 추가 ° C 세포의 대부분은 분리하고 그것을 흔들 수있는 평면에 대한 접시를 나오기 전까지. </li><li> 접시에서 모든 세포를 씻어하고,뿐만 아니라 매트릭스를 수집하는 스크레이퍼 (고무 경찰관)을 사용합니다. PBS의 5 ML을 추가합니다. 원심 분리하는 동안 셀 나누어지는 가져가라. </li><li> 5 분 800g에 원심 분리기. </li><li> 기음 5의 농도로 PBS에 resuspend - 10X 10 6 / ML. (30 분 이내에 주입) 주입까지 얼음에 보관하십시오. </li><li> 멸균 후드 안쪽 4~5주 오래된 여성 면역 결함 쥐 (예 : SCID)이있는 케이지를 놓습니다. </li><li> 70 % 에탄올과 함께 4 (복부) 유두 주변을 스프레이. </li><li> 내유 지방 패드로 0.1 ML를 주사. 보조를 찾을 수있다면, 한 사람이 자리에 마우스를 저장할 수있는 동안 다른 삽입 내유 지방 패드 내부에 바늘. 당신이 직접 주입하는 경우, isoflurane을 사용 빛을 마취에서 마우스를 넣어. </li><li> 종양이 5~7밀리미터로 성장하였습니다되면, 내유 이미징 창 (MIW)를 삽입해야합니다. 참고 : 또는 일부 응용 프로그램에 대한, MIW이 건강 내유 지방 패드의 상단에 삽입될 수 있으며, 세포가 나중에 주입 수 있습니다. 그 접근 방식은 생리적 환경에서 transiently transfected 세포의 이미징 수 있습니다. </li></ol> 2. 내유 이미징 창 (MIW)의 매뉴얼 제작 : <ol><li> MIWs (그림 1A)는 biocompatibility를 보장하기 위해 조직 등급 플라스틱 만들어집니다. 수동 건설, 우리는 5 10cm 요리를 사용합니다. </li><li> 에 라텍스 장갑을 넣어. </li><li> 조직 문화 요리를 가열하고 온수 요리 (우리는 이것에 대한 1 인치 dremmel 비트를 사용)에 대한 둥근 하드 개체를 추진하여 곡선 표면을 creat. </li><li> 온수 면도날을 사용하여 요리의 중심을 잘라 버릴거야. </li><li> 돔 모양의 플라스틱베이스 (지름 6-7mm)의 중앙에 구멍을 만들기 위해 작은 원추 모양의 dremmel 비트를 사용합니다. </li><li> dremmel으로 샌딩하고 더욱 그것을 제출하여 플라스틱베이스의 가장자리가 완전히 부드럽게합니다. </li><li> 유리 coverslip에 대한 평면을하는 플라스틱베이스의 상단을 파일입니다. 제기, 평면의 직경 9-10mm해야합니다. </li><li> superglue를 사용하여 평평 표면에 접착제 8mm 원형 유리 coverslip (숫자 1) (cyanoacrylate 접착제). </li><li> 건조에 접착제 (15 분) 기다립니다. </li><li> 베이스의 내부에 외부 (유리가 어디)에서 펑쳐링 팔 suturing 구멍을 만들기 위해 가열 26G 바늘을 사용합니다. 구멍이 고르게 0.5 - 1mm 떨어진 coverslip의 가장자리에서, coverslip 주위에 배포해야합니다. </li><li> 5-0 suturing 바늘을 사용하여 구멍을 넓혀. </li><li> 플라스틱베이스에 구멍을 펑쳐링하면 안쪽 표면이 울퉁불퉁하게됩니다. 모래 종이를 사용하여,이 표면이 완전히 부드럽게합니다. </li><li> 작은 브러시를 사용하여 MIW에서 작은 플라스틱 입자의 장갑과 칫솔을 변경합니다. </li><li> 탈이온수로 MIW 씻으십시오. </li><li> 70 % 에탄올을 사용하여 MIW 씻으십시오. 완전히 투명하므로 유리를 청소하는 Q - 팁을 사용하십시오. 접착제 증기에서 현재 안개 장소가있다면, Q - 팁과 아세톤을 신중하게 사용합니다. </li><li> 양쪽 3 H에 대한 UV 노출에 의해 MIW를 소독. </li></ol> : 내유 이미징 창 (MIW)의 세미 매뉴얼 제작 플라스틱베이스를 조작하기 위해, 우리는 현재 실리콘 고무 주조 금형을 사용하는 것은 손으로 만든 MIWs을 사용하여 만들었습니다. 금형은 즉시 모여 다음 폴리 에스테르 수지 가득 다시 원래의 전면과 모두의 정확한 복제를 실리콘 고무의 두 부분으로 구성되어 있습니다. 액체 폴리 에스테르 수지 함께 9시 10분 혼합하여 완전히 48h에서 치료 어려운 구조 검색 결과입니다. 플라스틱은 파괴하거나 시간이 지남에 따라 노란색으로 된하지 않고 자외선 보호 및 보존됩니다. 기본이 치료되면 2.8-2.16 수동으로 만든 MIWs과 동일식으로 단계를 반복합니다. 3. MIW 삽입 : <ol><li> 4 번째 유두 주변 지역은 소형 (5-7 당연 직경) 종양이 있어야합니다 몇 일 / 주 세포 유형 (그림 1B)에 따라 종양 세포 주입 후. 얼마나 시간이 Dendra2 photoswitchable 단백질이나 다른 형광 단백질을 표현하는 세포의 주입이 사용 세포주에 따라 이후에 전달했다. 종양이 가시 괴사성하지 않아야하며, 종양의 위에 머리를 그대로 피부에 있어야합니다. 괴사성 종양과 생쥐 euthanized해야합니다. </li><li> 대한 멸균 공간을 준비 살균 후드 내부 살균 헝겊 조각을 아래로 수술 - 레이. 무균 g의 한 조각을 넣어중간에 auze하고, 주변에 몇 MIWs 및 살균 악기를하다 : 우리는 작은 표준 가위, 스프링 가위, 핀셋 microdissecting, microdissecting 집게, 바늘 홀더를 사용합니다. Q - 팁, 70 % 에탄올과 후드의 모서리에 멸균 장갑 한 병 멸균 보관. </li><li> 마우스 HBSS에 2.5 % avertin의 IP 주입 (20 μl / G)를 사용하여 멸균 모자 anesthetized하거나, 또는 10 μg / kg 케타민을 + 10 μg / g xylazine (승인 및 주문에 대한 애니멀 케어 연구소에 문의). 참고 : Avertin 솔루션 준비를해야 격주, 필터 0.22 μm의 필터와 4 500 μl aliquots으로 저장 사용하여 소독 ° C (어둠 속에서). </li><li> 작은 동물 면도기를 사용하여 종양이 위의 지역을 면도기로 머리카락을 제거합니다. </li><li> 나이르 헤어 제거 크림 (모든 약국에서 사용할 수있는)를 사용하여 머리의 나머지 부분을 제거합니다. 에탄올 담근 Q - 도움말을 사용하여 피부를 청소합니다. </li><li> 멸균 거즈로 동물을 전송하고 건조 및 감염에서 그들을 유지하는 눈 안과 연고를 적용합니다. </li><li> betadine로 피부를 소독하고 70 % 에탄올로 닦아주십시오. </li><li> 멸균 후드 내부 살균 수술 천으로에 동물을 전송합니다. </li><li> 피부에 포셉 및 컷 ~ 2mm의 절개를 사용하여 유두 바로 중간 피부를 당겨. </li><li> 해부 가위와 집게를 사용하여 피부의 근본적인 내유 지방 패드를 분리합니다. MIW의 삽입을 수용할 수있는 크기로이 분리 단계에서 피부와 구멍 스트레치. </li><li> 실수로 혈관이 sugery 도중 충돌하는 경우, 생산 / 과도한되는에서 출혈을 멈추게하는 모든 혈액을 제거하는 살균 Q - 팁을 사용합니다. </li><li> 장소에 MIW 기지와 봉합의 피부 위에 비 흡수성 나사를 사용하고 바늘을 절단 반대가되는 등 MIW를 삽입합니다. </li><li> suturing 구멍을 기입하여 피부에 MIW를 보호하는 조직 접착제 또는 cyanoacrylate 사용합니다. </li><li> TMP - SMX 항생제 믹스를 추가합니다 (Sulfamethoxazole 0.6 MG / ML, 트리 메소 프림 0.12 MG / ML) 수술 전후 3 일간 케이지 물통에. </li><li> 동물 avertin의 IP 주입 후 1 4h을위한 마취 유지됩니다. 수술은 일반적으로 ~ 45 분 걸립니다 때문에, 그것은 동물이 나중에 복구할 수 있도록하는 것이 중요합니다 : </li><li> 손 손난로 새장 바닥에 (37 ° C)을 (약국에서 사용할 수있는) 장소와 거즈로 커버. </li><li> 그것은 위장에 돌면서 걷기 시작할 때까지 패드 위에 쓰레기야. </li><li> 동물 3H 이상 의식이있다면, rehydration 위해 HBSS intraperitoneally의 0.3 ML를 삽입. </li><li> 동물은 첫 번째 영상 세션이 일어나기 전에 다음 3~4일 동안 복구할 수 있습니다. </li></ol> 4. 이미지 박스 건설 이미지 상자가 MIW 바로 현미경 목표 위에 평면 앉아 거 아닌가. 또한 isoflurane 끊임없이 공기를 통해 온도 및 마취 제어를 용이하게합니다. 상자는 플렉시 글라스로 만들어진 플라스틱 용접을 사용하여 붙어있다. 이것은 특정 현미경 단계에 대한 장착되어 있으므로 그 아래쪽의 모양은 (그림 2 Leica SP5 현미경 단계에 장착되어 상자의 구조를 보여주는) 사용 현미경에 따라 다릅니다 수 있습니다. cm의 상자의 크기 제가 아르 = 11.4 cm, W = 7.6 cm, H = 4.4 cm (그림 2A). 상자의 아래쪽은 Leica SP5 현미경 스테이지 내부에 적합한 빈 접시의 크기 12.7x8.4 cm, 두 슬라이딩 &quot;문&quot;, 원형 오프닝 (양식 5.7 X 5.7 cm_each로 구성되어 D = 2.22 cm ) 닫을 때. MIW이 열기에 맞는. 사이드 조각 중 하나가 진공으로 연결 콘센트 구멍을 포함하는 동안 전면 조각은 마취 배달을위한 입구 구멍이 포함되어 있습니다. 콘덴서와 슬라이드 홀더는 이미지 상자 배치하기 전에 제거해야합니다. 5. 이미징 박스 사용 <ol><li> isoflurane과 마취하에 동물을 놓고 눈 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 입구 구멍 (그림 2B)의 밖에서, 마취 기계에서 이미징 상자 앞에 isoflurane 배기를 연결합니다. </li><li> 이미지 상자의 콘센트 구멍에 두 번째 튜브를 연결합니다. 이 튜브는 가스 필터 다음 진공에 첨부해야합니다. </li><li> 상자 뚜껑을 열고 상자 문을 열고 동물, 아래쪽을 향하고 MIW 측면을 배치하고 상자에 문을 슬라이딩. </li><li> 상자를 잡고 MIW 기지가 개최와 그 사이에 고정되도록 바닥 문을 조정합니다. MIW의 coverslip이 수준 아래에 몇 mm해야하는 동안 MIW 기지는 이미징 박스 도어와 같은 수준으로해야합니다. 하단 문을 상자에 병렬 문을 슬라이딩 하단 사이 MIW의 위치는 coverslip (MIW의 유리 부분)이 평평하게 거짓말을 보장 있는지 확인합니다. 이것은 적절한 초점을 보장합니다. </li><li> 에있는 상자의 배치를위한 공간을 허용하는, 현미경의 목표를 낮은현미경 스테이지의 상단. </li><li> 현미경 스테이지에 상자를 삽입하고, MIW의 coverslip이 객관적 위에 있도록 무대를 조정합니다. </li><li> 목적을 집중하고 이미지를 시작합니다. </li><li> isoflurane을 사용하는 동안 동물은 호흡 주파수의 육안 검사에 의해 모니터링해야합니다. 이것은 또는 영상 모음 (이들은 데이터 수집을 방해할 수) 중에 나타나는 호흡 유물의 빈도를 모니터링하여 시각적으로 수행할 수 있습니다. MouseOx 펄스 oximetry 시스템 (스타 생명 과학 코프)가 성공적으로 사용되었습니다. 그 방법은 데이터가 동물을 확인하는 방 안에 불을 돌려하지 않고 지속적으로 수집하실 수 있습니다. 참고 : 각 이미지 세션 후, 동물의 복구가 거즈 또는 kimwipes의 작은 손 가열 패드를 배치하고 새장에 동물 밑에 넣어 촉진해야합니다. 참고 : 침지 목표가 MIW을 통해 이미지를 사용하는 경우, 집중 매체 (글리세롤, 물, 기름)이 이미지 창을 청소해야합니다. MIW은 이미징하는 동안 발생했을 수있는 균열 또는 기타 손해에 대해 검사해야합니다. 이것은 여러 개의 영상 세션 동안 데이터를 수집하기 위해 중요합니다. </li></ol> 6. Dendra2 - 라벨 세포 Photoswitching 및 이미징 절차는 Leica SP5 공촛점 현미경에 대한 설명, 최적화하기위한 가이드로 사용해야 다른 공촛점 현미경을 사용하거나 multiphoton 이미징가 설정할 때 초점 비행기에서 레이저의 파워, 가능한 목표 및 소프트웨어 옵션은 다양하고, 따라서 프로토콜은 아래에 설명된 귀하의 현미경에 실험. <ol><li> 녹색 형광 필터와 접안 렌즈 (10X)를 통해 종양을 관찰함으로써, 가시 흐르는와 같은 초점 평면에서 평면 누워 주요 혈관을 찾습니다. </li><li> PMT 감지 분야 및 스위치의 중앙에있는 선박 중 하나가 위치. </li><li> 두 개 채널에 대한 순차적인 이미지 모음을 설정합니다. 채널 중 하나는 488nm 레이저 라인 (10 % 전력)을 사용하고, Dendra2 (505 - 540nm)의 녹색 양식에서 세포외 기질 (480 495nm) 및 방사로부터 비산를 수집합니다. 두 번째 채널은 543nm 레이저 라인 (90% 전력)을 사용하고 Dendra2의 붉은 양식 (555 - 600nm)의 방출을 수집합니다. 3D 이미지 사전 photoswitching를 수집합니다. </li><li> 405nm 레이저 라인 (30 % 전력, 20-40 스캔)를 사용하여 셀 선택 인구 photoswitch 수있는 투자 수익 (ROI) 스캔 옵션을 사용하십시오. 전환을 모니터하기 위해 단백질의 붉은 양식의 방출을 수집합니다. </li><li> 같은 순차 루틴 6.3에서와 같이를 사용하여, 사후 전환 3D 이미지를 수집합니다. </li><li> 종양에 하나 이상의 영역을 photoswitching면, 그것은 녹색과 빨간색 두 채널 (그림 3A, B)에서 디지털 카메라를 사용하여 oculars를 통해 사진을 찍을 것이 좋습니다입니다. 이것은 이후 영상 세션 동안 방향으로 도움이 될 것입니다. 참고 : 또한 혈관이 일시적으로 형광 dextran (캐스케이드 블루 또는 알렉사 플루어 647 두 10kDa)의 꼬리 - 정맥 주사를 사용하여 표시하실 수 있습니다. 몇 시간 주사 후 dextrans은 혈관을두고 영구적으로 macrophages 레이블을 것입니다. </li></ol> 대표 결과 : 그림 3C는 혈관 (없음 형광)에 상대 orthogonally 지향 사각형 photoswitched 지역 (빨간색)를 보여줍니다. 세포외 기질의 비산이 보라색 동안 비 photoswitched 세포가 녹색입니다. 이미지가 Z 축 (20-50 μm의 깊이)을 따라 사진 네 최대 강도 투사입니다.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Ca, Mg 제외 PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 배지 (MDA-MB-231 세포)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane(Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td># NDC 10019-773-40</td><td></td></tr><tr><td>SCID 마우스</td><td>National Cancer Institute</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>배양 접시</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>주문 제작</td></tr><tr><td>원형 커버슬립 8 mm</td><td>Scientific, Inc.</td><td>8CIR-1-FIS</td><td></td></tr></tbody></table>

내유 이미징 창문 dendra2 photoswitching

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

단일 셀 해상도 마우스 및 쥐의 유방 종양의 지난 10 년, intravital 현미경<sup&gt; 1-4</sup&gt;는 마이 그 레이션, 침략과 종양 세포의 intravasation로 전이성 행동의 메커니즘에 중요한 통찰력을 초래했다<sup&gt; 5, 6</sup&gt;, angiogenesis<sup&gt; 3</sup&gt; 그리고 면역 세포 응답<sup&gt; 7-9</sup&gt;. 우리는 최근 생활 생쥐에서 여러 intravital 이미징 세션을 통해 이미지 orthotopic 내유 carcinomas하는 기술을보고<sup&gt; 10</sup&gt;. 이를 위해, 우리는 Dendra2위한 내유 이미징 창 (MIW) 및 최적화된 이미지 매개 변수를 개발<sup&gt; 11</sup&gt; photoswitching 및 이미징<em&gt; 생체내에</em&gt;. 여기, 우리는 MIW, 사용자 지정 기본 이미지 상자를 사용하여 Dendra2 - 라벨 종양 세포의 종양 및 이미징 위에 MIW 삽입의 제조에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 이미지 종양의 독특한 microenvironments에서 종양 세포의 전이성 동작을하는 데 사용하고 혈관, 종양 세포와 호스트 세포의 장기 이미징을 허용하실 수 있습니다.

내유 이미징 창을 통해 Dendra2 - 라벨 종양 세포의 Intravital photoswitching 및 추적은 우리가 이미지 일 timescale 이상 선택 종양의 microenvironments에서 종양 세포의 전이성 동작을 수있는 기술입니다.

내유 이미징 창문 Dendra2 Photoswitching

지난 10년 동안, 단일 세포 해상도로 마우스 및 랫드의 유방 종양을 관찰하는 생체 내 현미경 검사(intravital microscopy)1-4를 통해 ...에 대한 중요한 통찰을 얻을 수 있었습니다.

본 영상은 형광 단백질을 발현하는 종양 세포주를 마우스 유선 지방 패드에 주입하는 과정부터 시작하는 프로토콜을 설명합니다. 생체 내 영상 촬영을 위한 특수 챔버를 제작하여 동물에게 외과적으로 이식하며, 이후 영상 데이터를 획득할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Albert Einstein College of Medicine Biophotonics Center의 Dr. John Condi 및 Dr. Jeffrey Siegel 연구실의 Dr. Vic입니다.오늘은 메모리 이미징 윈도우를 통해 DRA2가 표지된 암세포의 생체 내 광전환 및 이미징 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 종양 미세환경이 종양 세포의 운동성에 미치는 영향을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 라텍스 장갑을 착용하고 시작해 보겠습니다.5~10cm 조직 배양 접시를 가열하고, 1인치 Dremel 비트와 같이 둥글고 딱딱한 물체를 접시에 대고 눌러 곡면을 만들어 유방 영상 창(mammary imaging window, MIW) 제작을 시작합니다. 가열된 면도날을 사용하여 접시의 중앙 부분을 잘라냅니다. 이제 작은 원뿔 모양의 Dremel 비트를 사용하여 돔 형태의 플라스틱 베이스 중앙에 직경 6~7mm의 구멍을 뚫습니다.드레멜(Dremel)로 샌딩하고 추가로 줄질하여 플라스틱 베이스의 가장자리를 완전히 매끄럽게 만듭니다. 플라스틱 베이스의 상단을 줄질하여 유리 커버슬립을 놓을 평평한 표면을 만듭니다. 줄질로 만든 평평한 표면의 직경은 9~10 mm가 되어야 합니다.다음으로, 8 mm 원형 유리 커버를 접착합니다. 순간접착제를 사용하여 평평한 표면에 밀착시킨 후 15분 동안 건조시킵니다. 가열된 26 G 바늘을 사용하여 베이스의 외부에서 내부 방향으로 찌름으로써 8개의 봉합 구멍을 뚫으며, 구멍들은 커버 주변에 균일하게 분포되어야 합니다.커버슬립 가장자리에서 0.5~1mm 떨어진 곳에 밀어 넣으십시오. MIW를 탈이온수로 세척한 후, 다시 70% ethanol로 세척하십시오. 면봉을 사용하여 유리가 완전히 투명해질 때까지 닦아내십시오.아세톤을 사용하여 접착제 증기로 인해 남은 뿌연 부분을 제거합니다. 마지막으로 MIW를 양면 각각 3시간 동안 자외선 조사하여 멸균합니다. MIW를 삽입하기 전, 종양 세포 주입의 결과로 네 번째 유두 주변 부위에 직경 5~7mm의 작은 종양이 형성되어 있어야 합니다.1부에서는 종양에 육안으로 보이는 괴사가 없는지 확인하십시오. 종양 주변 부위의 피부가 온전하며 털이 나 있어야 합니다. 우선, 멸균 후드 내부에 멸균 포를 깔아 수술을 위한 멸균 공간을 준비하십시오.중앙에 멸균 거즈 한 조각을 놓고 수술에 필요한 도구들을 준비합니다. 소형 및 대형 해부 가위, 스프링 가위, 미세 해부용 핀셋과 포셉, 그리고 지침기가 필요합니다. 2.5% averting으로 마우스를 마취시킨 후, 소동물용 털 제거기를 사용하여 종양 상부 부위의 털을 깎습니다. 제모 크림을 사용하여 남은 털을 제거하고 피부를 세척합니다.에탄올을 적신 면봉을 사용합니다. 동물을 멸균 거즈 위로 옮기고, 눈이 건조해지거나 감염되는 것을 방지하기 위해 안연고를 도포합니다. Betadine으로 피부를 소독한 후 70% ethanol로 세척합니다.멸균된 수술포를 사용하여, 핀셋으로 유두 바로 내측의 피부를 당긴 후 약 2mm 크기로 절개합니다. 박리 도구, 가위 및 핀셋을 사용하여 하부의 유선 지방 패드를 피부와 분리합니다. 분리가 완료되면 피부와 절개 부위가 확장되어 MIW를 삽입할 수 있는 크기가 됩니다.MIW 베이스 위에 피부가 놓이도록 MIW를 삽입하고 봉합하여 고정합니다. 조직 접착제나 cyanoacrylate를 사용하여 봉합 구멍을 메우고 MIW를 피부에 단단히 고정합니다. 첫 번째 영상 촬영 세션을 진행하기 전, 동물은 3~4일 동안 회복 기간을 가져야 합니다.이미징 세션을 준비하기 위해, 이미징 박스를 활용하는 방법에 대해 설명하겠습니다. 먼저, isof fluorine으로 동물을 마취시키고 눈에 안연고를 도포합니다. 마취기에서 나오는 isof fluorine 배출관을 이미징 박스 전면에 연결합니다.입구 구멍의 바깥쪽에 연결하십시오. 이미징 박스의 출구 구멍에 두 번째 튜브를 연결하십시오. 이 튜브는 가스 필터에 연결한 후 진공 장치에 연결해야 합니다.다음으로, MIW가 바닥을 향하도록 동물을 내려놓습니다. 박스를 잡고 하단 도어를 조절하여 MIW 베이스가 도어 사이에 고정되어 움직이지 않게 합니다. MIW 베이스는 이미징 박스 도어와 동일한 높이에 위치해야 합니다.MIW 커버 슬립이 이 레벨보다 수 밀리미터 아래에 있어야 하지만, 하단 슬라이딩 도어 사이의 MIW 위치가 커버 슬립이 박스의 하단 도어와 평행하게 평평하게 놓이도록 하는지 확인하십시오. 이렇게 해야 현미경 대물렌즈를 내려 현미경 스테이지 위에 박스를 놓을 공간을 확보한 후 적절하게 초점을 맞출 수 있습니다. MIW 커버 슬립이 대물렌즈 위에 오도록 스테이지를 조정하십시오.이제 대물렌즈의 초점을 맞추고 이미징을 시작할 수 있습니다. 여기에 설명된 이미징 절차는 Leica SP five 공초점 현미경을 기준으로 하며, 사용 중인 특정 현미경에 맞춰 실험을 최적화하기 위한 가이드로 활용해야 합니다. 먼저 녹색 형광 필터를 사용하여 접안렌즈를 통해 종양을 관찰하십시오.가시적으로 흐름이 보이며 동일한 초점 평면에 평평하게 놓여 있는 주요 혈관을 찾으십시오. 혈관 하나를 시야 중심에 배치하고 PMT 검출 모드로 전환합니다. 두 채널에 대해 순차적 이미지 수집을 설정하겠습니다.한 채널은 488 nanometer 레이저 라인을 사용하여 세포외 기질의 산란광과 dendra two의 녹색 형태에서 나오는 방출광을 수집합니다. 두 번째 채널은 543 nanometer 레이저 라인을 사용하여 dendra two의 적색 형태에서 나오는 방출광을 수집합니다. 광전환(photo switching) 전에 3D 이미지를 수집하십시오.다음으로, 관심 영역(region of interest) 스캔 옵션을 사용하여 405 nm 레이저 라인으로 선택한 세포 집단을 광전환(photo switch)시킵니다. 전환 과정을 모니터링하기 위해 단백질의 적색 형태에서 방출되는 형광을 수집하십시오. 이제 사전 전환 이미지와 동일한 방법으로 전환 후의 3D 이미지를 수집합니다.이제 UV 레이저 출력을 20%로 설정하여 종양 내의 하나 이상의 영역을 포토 스위치로 전환한 후, 디지털 카메라를 사용하여 접안렌즈를 통해 녹색 및 적색 채널 모두에서 사진을 촬영합니다. 이는 이후의 이미징 세션 동안 방향을 잡는 데 도움이 됩니다. 이 이미지에서는 혈관에 대해 직교 방향으로 설정된 직사각형의 포토 스위치 영역이 관찰되며, 이 영역은 형광을 나타내지 않습니다.광전환되지 않은 스위치 세포는 녹색으로 나타나며, 세포외 기질의 산란광은 보라색으로 나타납니다. 이 이미지는 Z축을 따라 촬영된 4개 이미지의 최대 강도 투영(maximum intensity projection) 결과입니다. 지금까지 메모리 이미징 윈도우를 통해 RA tool로 라벨링된 세포를 광전환하고 이미징하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 사용하는 것은 여러 날에 걸쳐 종양의 서로 다른 영역에서 종양 세포의 거동을 비교하는 데 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 이식된 두개골 창을 통해 마우스 모델에서 사전 주입된 암세포의 생체 내 이미징을 수행합니다. 이 고해상도 타임 랩스 이미징 기술을 통해 살아있는 쥐에서 암세포의 동적 거동을 연구할 수 있습니다.

마우스 모델의 두개창 기반 생체 내 이미징: 쥐 모델의 뇌에서 사전 주입된 암세포의 행동을 연구하기 위한 이미징 기술

여기에서는 관내 주사를 통해 토끼 유선에 시약을 국부적으로 전달하는 기술에 대해 설명합니다. 또한 조영제의 고해상도 초음파 이미징을 통한 시각화 및 전달 확인을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

토끼 유선으로 관내 배달

관심 조직/기관 및 피부에 직접 접착할 수 있는 광학적으로 투명한 실리콘 창을 사용하여 장기간 생체 내 이미징을 위한 접근법이 제시됩니다. 이 창문은 현재 현장에서 사용되는 다른 창문보다 저렴하고 다재다능하며 외과 적 삽입은 동물에게 제한된 염증과 고통을 유발합니다.

투명한 실리콘 윈도우를 통한 종방향 생체 내 이미징

이 프로토콜은 교체 가능한 뚜껑 (R.MIW)이있는 새로운 유방 이미징 창을 설명합니다. R.MIW의 이식 후 생체 내 현미경 검사는 다른 발달 단계에서 세포 해상도로 건강하고 병든 유선의 종방향 및 다일 이미징을 허용합니다.

교체 가능한 뚜껑이있는 유방 이미징 창을 사용하는 종방향 생체 내 현미경 검사

여기에 설명된 생체내 영상화 방법은 대사 보조인자 NAD(P)H로부터의 콜라겐 초고조파 생성 및 내인성 형광을 이용하여 표지되지 않은 종양 미세환경을 종양, 기질 및 혈관 구획으로 비침습적으로 분절하여 4D 생체내 영상의 심층 분석을 한다.

유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법

본 프로토콜은 레이저 스캐닝 컨포칼 및 다광자 현미경에 의한 수유 마우스 유선의 생체 내 이미징을 위한 손쉬운 기술을 설명합니다.

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland(유선의 생체 내 세포내 현미경)

우리는 쥐 췌장의 세포 내 해상도 이미징을 위한 안정화된 유치 광학 창의 외과적 이식을 위한 프로토콜을 제시하여 건강한 췌장과 병든 췌장에 대한 연속 및 종단 연구를 가능하게 합니다.

쥐 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창

대뇌 피질의 혈류 역학은 2 광자 현미경과 설치류 동물의 꼬리 정맥에 주입 이미징 형광 dextran의 염료에 의해 생체내에서 공부하실 수 있습니다. 이 비디오는 어떻게 유리 커버 두개골 윈도우 준비를 통해 마우스의 네크로 텍스의 이미지 혈류 역학을 보여줍니다.

두개골의 창문을 통해 네크로 텍스의 혈류의 2 광자 이미징을위한 방법

가벼운 현미경이 작동하는 방법에 대한 철저한 이해를해야하는 세포 생물학에 대한 기본적인 도구이며, 어떻게 서로 다른 애플 리케이션에 정렬해야하며, 어떻게 최대 이미지 형성 용량 및 해상도를 얻기 위해 필요한 경우가 유지되어야합니다. 현미경의 구성 요소는 여기에 자세히 설명되어 있습니다.

라이트 현미경의 주요 구성 요소

루시페라제 표현 내유 종양 세포는 생쥐의 subcutaneously 이식 및 비 invasively 종단 연구에 종양이 성장과 발전을 모니터 광학 이미징을 사용하여 시각입니다.

IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

배우세요 마우스 유방 지방 패드에서 Dendra2 형광 단백질을 이용한 내유 이미징 및 포토스위칭 방법을. 이 기술은 종양 미세환경에서 암세포의 전이 행동을 실시간으로 관찰하는 데 활용됩니다.

내유 이미징 창문 Dendra2 Photoswitching

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