내유 이미징 창문 Dendra2 Photoswitching

본 영상은 형광 단백질을 발현하는 종양 세포주를 마우스 유선 지방 패드에 주입하는 과정부터 시작하는 프로토콜을 설명합니다. 생체 내 영상 촬영을 위한 특수 챔버를 제작하여 동물에게 외과적으로 이식하며, 이후 영상 데이터를 획득할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Albert Einstein College of Medicine Biophotonics Center의 Dr. John Condi 및 Dr. Jeffrey Siegel 연구실의 Dr. Vic입니다.

오늘은 메모리 이미징 윈도우를 통해 DRA2가 표지된 암세포의 생체 내 광전환 및 이미징 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 종양 미세환경이 종양 세포의 운동성에 미치는 영향을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 라텍스 장갑을 착용하고 시작해 보겠습니다.

5~10cm 조직 배양 접시를 가열하고, 1인치 Dremel 비트와 같이 둥글고 딱딱한 물체를 접시에 대고 눌러 곡면을 만들어 유방 영상 창(mammary imaging window, MIW) 제작을 시작합니다. 가열된 면도날을 사용하여 접시의 중앙 부분을 잘라냅니다. 이제 작은 원뿔 모양의 Dremel 비트를 사용하여 돔 형태의 플라스틱 베이스 중앙에 직경 6~7mm의 구멍을 뚫습니다.

드레멜(Dremel)로 샌딩하고 추가로 줄질하여 플라스틱 베이스의 가장자리를 완전히 매끄럽게 만듭니다. 플라스틱 베이스의 상단을 줄질하여 유리 커버슬립을 놓을 평평한 표면을 만듭니다. 줄질로 만든 평평한 표면의 직경은 9~10 mm가 되어야 합니다.

다음으로, 8 mm 원형 유리 커버를 접착합니다. 순간접착제를 사용하여 평평한 표면에 밀착시킨 후 15분 동안 건조시킵니다. 가열된 26 G 바늘을 사용하여 베이스의 외부에서 내부 방향으로 찌름으로써 8개의 봉합 구멍을 뚫으며, 구멍들은 커버 주변에 균일하게 분포되어야 합니다.

커버슬립 가장자리에서 0.5~1mm 떨어진 곳에 밀어 넣으십시오. MIW를 탈이온수로 세척한 후, 다시 70% ethanol로 세척하십시오. 면봉을 사용하여 유리가 완전히 투명해질 때까지 닦아내십시오.

아세톤을 사용하여 접착제 증기로 인해 남은 뿌연 부분을 제거합니다. 마지막으로 MIW를 양면 각각 3시간 동안 자외선 조사하여 멸균합니다. MIW를 삽입하기 전, 종양 세포 주입의 결과로 네 번째 유두 주변 부위에 직경 5~7mm의 작은 종양이 형성되어 있어야 합니다.

1부에서는 종양에 육안으로 보이는 괴사가 없는지 확인하십시오. 종양 주변 부위의 피부가 온전하며 털이 나 있어야 합니다. 우선, 멸균 후드 내부에 멸균 포를 깔아 수술을 위한 멸균 공간을 준비하십시오.

중앙에 멸균 거즈 한 조각을 놓고 수술에 필요한 도구들을 준비합니다. 소형 및 대형 해부 가위, 스프링 가위, 미세 해부용 핀셋과 포셉, 그리고 지침기가 필요합니다. 2.5% averting으로 마우스를 마취시킨 후, 소동물용 털 제거기를 사용하여 종양 상부 부위의 털을 깎습니다. 제모 크림을 사용하여 남은 털을 제거하고 피부를 세척합니다.

에탄올을 적신 면봉을 사용합니다. 동물을 멸균 거즈 위로 옮기고, 눈이 건조해지거나 감염되는 것을 방지하기 위해 안연고를 도포합니다. Betadine으로 피부를 소독한 후 70% ethanol로 세척합니다.

멸균된 수술포를 사용하여, 핀셋으로 유두 바로 내측의 피부를 당긴 후 약 2mm 크기로 절개합니다. 박리 도구, 가위 및 핀셋을 사용하여 하부의 유선 지방 패드를 피부와 분리합니다. 분리가 완료되면 피부와 절개 부위가 확장되어 MIW를 삽입할 수 있는 크기가 됩니다.

MIW 베이스 위에 피부가 놓이도록 MIW를 삽입하고 봉합하여 고정합니다. 조직 접착제나 cyanoacrylate를 사용하여 봉합 구멍을 메우고 MIW를 피부에 단단히 고정합니다. 첫 번째 영상 촬영 세션을 진행하기 전, 동물은 3~4일 동안 회복 기간을 가져야 합니다.

이미징 세션을 준비하기 위해, 이미징 박스를 활용하는 방법에 대해 설명하겠습니다. 먼저, isof fluorine으로 동물을 마취시키고 눈에 안연고를 도포합니다. 마취기에서 나오는 isof fluorine 배출관을 이미징 박스 전면에 연결합니다.

입구 구멍의 바깥쪽에 연결하십시오. 이미징 박스의 출구 구멍에 두 번째 튜브를 연결하십시오. 이 튜브는 가스 필터에 연결한 후 진공 장치에 연결해야 합니다.

다음으로, MIW가 바닥을 향하도록 동물을 내려놓습니다. 박스를 잡고 하단 도어를 조절하여 MIW 베이스가 도어 사이에 고정되어 움직이지 않게 합니다. MIW 베이스는 이미징 박스 도어와 동일한 높이에 위치해야 합니다.

MIW 커버 슬립이 이 레벨보다 수 밀리미터 아래에 있어야 하지만, 하단 슬라이딩 도어 사이의 MIW 위치가 커버 슬립이 박스의 하단 도어와 평행하게 평평하게 놓이도록 하는지 확인하십시오. 이렇게 해야 현미경 대물렌즈를 내려 현미경 스테이지 위에 박스를 놓을 공간을 확보한 후 적절하게 초점을 맞출 수 있습니다. MIW 커버 슬립이 대물렌즈 위에 오도록 스테이지를 조정하십시오.

이제 대물렌즈의 초점을 맞추고 이미징을 시작할 수 있습니다. 여기에 설명된 이미징 절차는 Leica SP five 공초점 현미경을 기준으로 하며, 사용 중인 특정 현미경에 맞춰 실험을 최적화하기 위한 가이드로 활용해야 합니다. 먼저 녹색 형광 필터를 사용하여 접안렌즈를 통해 종양을 관찰하십시오.

가시적으로 흐름이 보이며 동일한 초점 평면에 평평하게 놓여 있는 주요 혈관을 찾으십시오. 혈관 하나를 시야 중심에 배치하고 PMT 검출 모드로 전환합니다. 두 채널에 대해 순차적 이미지 수집을 설정하겠습니다.

한 채널은 488 nanometer 레이저 라인을 사용하여 세포외 기질의 산란광과 dendra two의 녹색 형태에서 나오는 방출광을 수집합니다. 두 번째 채널은 543 nanometer 레이저 라인을 사용하여 dendra two의 적색 형태에서 나오는 방출광을 수집합니다. 광전환(photo switching) 전에 3D 이미지를 수집하십시오.

다음으로, 관심 영역(region of interest) 스캔 옵션을 사용하여 405 nm 레이저 라인으로 선택한 세포 집단을 광전환(photo switch)시킵니다. 전환 과정을 모니터링하기 위해 단백질의 적색 형태에서 방출되는 형광을 수집하십시오. 이제 사전 전환 이미지와 동일한 방법으로 전환 후의 3D 이미지를 수집합니다.

이제 UV 레이저 출력을 20%로 설정하여 종양 내의 하나 이상의 영역을 포토 스위치로 전환한 후, 디지털 카메라를 사용하여 접안렌즈를 통해 녹색 및 적색 채널 모두에서 사진을 촬영합니다. 이는 이후의 이미징 세션 동안 방향을 잡는 데 도움이 됩니다. 이 이미지에서는 혈관에 대해 직교 방향으로 설정된 직사각형의 포토 스위치 영역이 관찰되며, 이 영역은 형광을 나타내지 않습니다.

광전환되지 않은 스위치 세포는 녹색으로 나타나며, 세포외 기질의 산란광은 보라색으로 나타납니다. 이 이미지는 Z축을 따라 촬영된 4개 이미지의 최대 강도 투영(maximum intensity projection) 결과입니다. 지금까지 메모리 이미징 윈도우를 통해 RA tool로 라벨링된 세포를 광전환하고 이미징하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 사용하는 것은 여러 날에 걸쳐 종양의 서로 다른 영역에서 종양 세포의 거동을 비교하는 데 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.