Name: TIRF 현미경과 망막 바이폴라 세포 이미징 Exocytosis (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 배우세요 TIRF 현미경을 이용한 금붕어 망막 바이폴라 세포의 시냅스 소포 외배출 시각화 방법입니다. FM 1-43 형광 염료 로딩과 패치 클램프 기술로 신경전달 메커니즘을 실시간 관찰할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH 그랜트 어이 14990에 의해 지원되었다.

1 부 : 해부 및 바이폴라 셀 절연 <ol><li> 표 2에 나열된 솔루션을 준비, 링거스 &#39;의 산도는 (외부) 솔루션은 NaOH와 7.4으로 조정되어야하며 내부 솔루션의 산도는 7.2 CsOH로 조정해야합니다. 알루미늄 호일과 빛으로부터 내부 솔루션을 보호하고 4를 유지 ° C를 사용까지; </li><li> 해부하기 전에 적어도 30 분 금붕어를 어두운 적응; </li><li> (; 시그마, 세인트 루이스, MO 낮은 칼슘 2 + 링거스 입력 V의 hyaluronidase, 1100 단위 / ML)과 L - 시스테인 (0.5 MG / ML 10 ML 동물이 어두운 적응하지만, hyaluronidase 5 ML 준비 낮은 칼슘 2 + 링거스) 솔루션과 papain (동결 건조된 분말, 40 단위 / ML 무게, 소화 솔루션의 5 ML 위해를 시그마, 세인트 루이스, MO); </li><li> 수술 가위로 빠르게 잘린하여 금붕어를 안락사와 11 # 메스 블레이드와 두뇌 및 척수를 파괴; </li><li> # 7 곡선 더몬트 집게의 도움으로 추가 - 안구 근육을 파괴하고 홍채 가위로 시신경을 절단하여 눈을 제거; </li><li> 필터 종이 찔린 11 # 메스 블레이드의 팁과 scleral limbus의 조각에 올려 놓으 아이 전구; </li><li> 구멍 전체가 내부 vannas의 가위의 칼날을 소개하고 거리 전체 앞쪽에 세그먼트를 잘라; </li><li> 나머지 광학 컵 위에 종이 필터의 작은 조각을 놓고 종이가 유리 유머와 흠뻑 젖어있는 권한을 부여하기 위해 압력 좀 넣으; </li><li> 그것에 연결된 망막과 필터 종이를 들고 vannas 가위 파와 시신경을 잘라; </li><li> # 7 더몬트 핀셋의 도움으로 여과지에서 망막에서 hyaluronidase 솔루션과 껍질이있는 35mm 플라스틱 문화 접시에있는 망막을 포함하는 필터 용지를 놓습니다; </li><li> 산업 소강 단일 깨끗 블레이드의 절반과 4-6 조각으로 망막 컷과 20 분 동안 hyaluronidase 용액에 앉아 보자; </li><li> 을 적용하려면 hyaluronidase를 기다리는 동안, papain으로 L - 시스테인 솔루션의 5 ML을 추가하고 액체가 투명하게 될 때까지 (약 50~10분) 앉아 보자; </li><li> 낮은 칼슘 2 + 링거스에 배 망막의 조각을 씻고 그들 30~35분에 대한 papain 솔루션에 앉히지; </li><li> 낮은 칼슘 2 + 링거스에 배 망막의 조각을 씻어 4에서 사용하기 전까지 그들을 저장할 ° 낮은 칼슘 2 포함 35mm 플라스틱 문화 접시에있는 C + 링거스; </li><li> 세포를 떼어 놓다하려면, 낮은 칼슘 2 + 링어의 500 ML를 포함하는 microcentrifuge 관에서 망막의 한 조각을 넣고 천천히 모든 공기 방울을 생산하지 않는 신중하게, 유리 분리 피펫으로 위아래로 pipetting하여 망막을 씹다. 분리의 pipettes은 알콜 램프와 유리 파스퇴르 피펫의 팁을 가열하고 약간 해부 집게의 도움으로 그것을 절곡하여 가공되며 </li><li> 이전에 적은 칼슘 2 + 링거스 2 ML 가득한 집에서 만든 녹화 실로 망막 정지 한 방울을 추가하여 플레이트 분리된 세포를. 챔버는 중앙에 원형 전체와 35 mm 플라스틱 문화 요리와 실리콘 엘라스토머 (Sylgard 184와 함께 바닥에 붙어 1.78 굴절률 유리 (PlanOptik, 독일)의 원형 coverslip의 아래쪽 절반으로 구성되어, 다우 코닝 , 미들랜드, MI). </li></ol> 2 부 : 바이폴라 셀 로딩과 와시 아웃 시냅스 vesicles의 TIRF 이미지는 최상의 매우 높은 NA의 객관적이고 민감한 카메라 객관적인 타입 TIRFM 현미경을 사용하여 수행됩니다. 실험을 위해, 우리는 EMCCD (캐스케이드 512B, 로퍼 과학, 투싼,​​ AZ)로 1.65 NA 목표 (APO x100 O HR, NA 1.65, 올림푸스, 일본)를 사용하여 선택합니다. 매우 높은 NA의 목적의 사용은 높은 굴절률 유리 coverslips 및 침지 유체 (유황과 디 - 이오도 메탄)의 사용을 요구. 우리의 조건에서, 여기 라이트는 약 50 nm의의 일정한 길이가 기하 급수적으로 부패 분야로 제한됩니다. <ol><li> 현미경 목표 높은 굴절률 액체 (M 시리즈, 굴절률 = 1.7800, Cargille 연구소 시더 그로브, NJ)의 한 방울을 추가합니다; </li><li> 현미경 목표 위에 조심스럽게 기록 챔버를 놓고 신중하게 접지 전극과 실로 superfusion 출구 파이프를 탑재; </li><li> 챔버는 세포가 싱크대와 바닥을 준수하도록 10~20분에 대한 현미경에 앉아 보자; </li><li> 그 동안에, 1mM trolox ® ((±)- 6 - 히드록시 -2 ,5,7,8 - tetramethylchromane - 2 - 카르복실산 5 ML 준비, 시그마, 세인트 루이스, 높은 K + 링거스에 MO) 솔루션 . 녹아까지 Sonicate; </li><li> 낮은 칼슘 2 + 링거스 1 MM ADVASEP - 7 (시그마, 세인트 루이스, MO) : ADVASEP - 7 세척 솔루션 15 ML을 준비합니다. ADVASEP - 7 사용 선택하고 원하는 경우 생략할 수 있습니다; </li><li> superfusion의 리튬을 정화NES 및 추가 ADVASEP - 7 세척 솔루션, 낮은 칼슘 2 + 링거스 및 제어 대타가 superfusion 시스템의; </li><li> 얇은 벽으로 둘러싸인 borosilicate 유리 (; WPI, 사라소타, 플로리다 퀵 - Fil ® TW150 - 3)에서 pipettes를 로드할 당겨. 퍼퍼 피펫 resistances는 1.5-2.5 MΩ 범위에; </li><li> 솔루션, FM1 -​​ 43 ® (Invitrogen, 칼스 배드, CA - - (4 (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromide, &quot;특별한 포장을&quot;N - (3 - triethylammoniumpropyl) -4) 준비. 첫째, FM1 -​​ 43 중 하나를 유리병 (100 MG) ® 160 μL 증류수를 추가하여 1 ㎜의 주식을합니다. 이 주식은 최대 일주일 4 ° C에 보관하실 수 있습니다. 그런 다음, FM1 - 43 5 μL를 추가 ® 1 ML 높은 K + 링거스 + 1mM trolox ® 수 있습니다. 알루미늄 호일과 빛으로부터 보호 솔루션을 4에서 보관 ° C를 사용까지; </li><li> 에 대한 현미경 명시야 조명을 켜고 그대로 바이폴라 세포에 대한 검색합니다. 약간 신경이 단단히 챔버 하단에 첨부되어 있는지 확인하기 위해 현미경 탭; </li><li> 가까운 관심 세포에 superfusion 펜을 위치하고 지속적으로 낮은 칼슘 2 + 링거스으로 준비를 perfuse; </li><li> 객실 조명을 끄고 빨간색 긴 패스 필터 (즉, RG630, 쇼트, 독일)을 추가 FM 염료 여기를 최소화하기 위해 광 경로; </li><li> FM 염료 용액 10 μL와 로딩 피펫을 채우기 micromanipulator에 피펫을 탑재하고 당신이 부하하려는 바이폴라 세포와 같은 초점 비행기에까지 압력없이 준비에 피펫을 낮추십시오. 당신은 적어도 두 전극 홀더를 확인하십시오 : FM 염색에 사용되는 한 그것은 세포 용액을 오염시킬 수 있습니다 다른 패치 클램핑 사용하거나, 수 없습니다; </li><li> 축삭 터미널에서 약 10 μm의의 거리에서 퍼퍼 오픈 위치, superfusion 시스템을 해제 및 피펫 과압을 설정하여 10 초 동안 염료 솔루션을 퍼프; </li><li> 30 초 동안 기다, 피펫을 움직이지 않고, 압력을 끄고; </li><li> 에 superfusion을 켜고 5 분 ADVASEP - 7 솔루션 챔버 목욕. 그 동안에, 목욕탕에서 호흡기의 피펫을 제거; </li><li> 5 분 후에, 낮은 칼슘 2 + 링거스로 전환하고 초과 염료의 제거를 허용하도록 25~30분 위해 챔버를 perfuse. </li></ol> 3 부 : 패치 클램핑 및 TIRFM 이미징 <ol><li> 준비가 세척하는 동안 두꺼운 벽의 borosilicate 유리 (; 서터 악기 회사 노바토, CA B150 - 86 - 10)에서 패치 pipettes를 가져옵니다. 패치 피펫 resistances은 80-10 MΩ 범위에; </li><li> 씻어가 완료되면,보기의 필드의 중앙에 축삭 터미널 장소; </li><li> 그리고 micromanipulator에 장착, 내부 솔루션 7μL와 패치 피펫을 채우기, 공기 방울, 코트 용융 치과 왁스 (커 주식 회사, 오렌지, CA 끈적 왁스)와 피펫을 없애기 위해 피펫을 탭; </li><li> 에 피펫 과압을 켜고 준비에 서서히 피펫을 낮추십시오. 앰프의 피펫 저항 정확한 피펫의 오프셋과 각 앰프 컨트롤과 함께 용량을 확인하십시오; </li><li> 링거스를 제어할 수 superfusion 스위치. 피펫과 세포 사이 gigaseal를 만들려면, 약간 세포 기관에 대한 전극의 끝부분을 터치하고 부드럽게 전극에 부정적인 압력을 적용하는 동안 피펫 과압을 해제; </li><li> 봉인 반면, 앰프에서 &quot;전체 셀&quot;모드를 선택하고 -60 MV하는 잠재력을 가지고있는 세포를 설정; </li><li> , 전체 축삭 터미널을 포함한 이미징 소프트웨어와 관심 영역을 선택 명시야 조명을 끄고, 짧게 488 nm의 레이저로 (30 MS) 터미널을 노출하여 TIRF 영상에 맞는 초점 비행기를 찾으면; </li><li> 피펫에 약간 부정적인 압력을 적용하는 동안 앰프의 &quot;기력&quot;명령을 사용하여 세포에 침투; </li><li> 셀 커패시턴스와 직렬 저항에 대한 정정하고있는 동안 관심의 전압 프로토콜을 적용 시냅스 vesicles의 영상 움직임. 이것은 전압 프로토콜 카메라 프레임 속도에 동기가이 단계에서 중요하다. 우리의 경우, 각 프레임은 30 MS 길이, 전압 변경이 값 (즉, 모든 300 MS 또는 10 프레임)의 배수에서 발생하므로, </li><li> 복구 수 있도록 재판을 사이에 최소한 40 초 정도 기다리십시오; </li><li> 에서 561 nm의 레이저를 돌려 동안 시냅스 리본의 위치를​​ 확인하려면, 사진을 찍는. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1305/fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : 실험 설정. 488 nm의 레이저 (파란색)은 목표의 뒤에 초점 비행기의 주변에 집중하고 유리 수성 매체 인터페이스에 도달하면 총 내부 반사를 앓고있다. 반사 빔에 의해 생성된 전자기장은 봇 가장 가까운 시냅스 vesicles에 로드된 형광단을 자극다음 (녹색) 형광 유리 챔버 톰. 형광등은 다음 관찰자의 눈 (묘사) 또는 CCD 카메라로 안내합니다. 몇 군데 세포의 막 잠재력은 그들을 패치 - 클램핑하여 동시 제어됩니다. 이러한 접근 방식은 수신 신호 (막 전압)와 출력의 연결 (exocytosis) 사이의 관계의 연구를 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1305/fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 : 일반적인 결과입니다. 왼쪽 절연 금붕어 바이폴라 세포의 명시야 이미지. 오른쪽 상단 : 바이폴라 세포 축삭 터미널에서 시냅스 vesicles의 TIRF 이미지가 1-43 FM 탑재 ® 및 488 nm의 레이저 (FM 염색)와 몇 군데. 오른쪽 하단 : 561 NM 레이저와 패치 세포 및 이미징 축삭 터미널 후 동일한 터미널 이미지. 시냅스 리본은 rhodamine 기반 RIBEYE 바인딩 펩타이드 (Rpep_rhod)에 의해 표시됩니다. 표 1 : 특정 시약 및 장비. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 유형 </td><td> 제조 업체 </td><td> 목록 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> - </td><td> 에어 테이블 </td><td> 뉴 포트 주식 회사 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> IX70 </td><td> 거꾸로 현미경 </td><td> 올림푸스 </td><td> - </td><td> 명시야의 텅스텐 램프와 TIRF위한 측면 오프닝 포트가 장착된 </td></tr><tr><td> TH4 - 100 </td><td> 램프 전원 </td><td> 올림푸스 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> FF498_581 - Di01 </td><td> 이색성 필터 </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> NF01 - 405_488_568 </td><td> 배출 필터 </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> APO x100 O HR </td><td> 목표 </td><td> 올림푸스 </td><td> - </td><td> NA 1.65 </td></tr><tr><td> RG630 </td><td> 레드 글래스 필터 </td><td> 쇼트 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 488 NM 레이저 </td><td> 응집 성의 </td><td> - </td><td> 최소 전력으로 사용 </td></tr><tr><td> - </td><td> 셔터 </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM - D1 </td><td> 셔터 드라이버 </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 561 NM 레이저 </td><td> Melles Griot </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 셔터 </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM - D3 </td><td> 셔터 드라이버 </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 재관류 압력 키트 </td><td> Superfusion 시스템 </td><td> 과학 자동화 </td><td> 09-04 </td><td> - </td></tr><tr><td> 재관류 펜 </td><td> Superfusion 시스템 </td><td> 과학 자동화 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Valvelink 8 </td><td> Superfusion 시스템 컨트롤러 </td><td> 과학 자동화 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 캐스케이드 512B </td><td> EM CCD 카메라 </td><td> 로퍼 과학 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Metamorph 7.1 </td><td> 이미징 소프트웨어 </td><td> 분자 장치 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> EPC - 9 </td><td> 패치 클램프 증폭기 </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 펄스 </td><td> 앰프 소프트웨어 </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MP - 285 </td><td> Micromanipulator </td><td> 서터 악기 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 전극 홀더 </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> 1.5 mm OD 유리, 2 단위 </td></tr><tr><td> 퀵 - Fil ® TW150 - 3 </td><td> Borosilicate 유리 모세관 </td><td> WPI </td><td> - </td><td> 필라멘트없이 </td></tr><tr><td> B150 - 86-10 </td><td> Borosilicate 유리 모세관 </td><td> 서터 악기 </td><td> - </td><td> 필라멘트와 함께 </td></tr><tr><td> P - 97 </td><td> Microelectrode의 풀러 </td><td> 서터 악기 </td><td> - </td><td> 3x3 상자 필라멘트, 환경 챔버가 장착된 </td></tr><tr><td> - </td><td> 압력 진공 공기 펌프 </td><td> 토마스 과학 </td><td> 7893B05 </td><td> pipettes을위한 챔버 및 압력에서 액체를 제거하기 위해 진공을 만듭니다 </td></tr><tr><td> MatLab R2008a </td><td> 분석 소프트웨어 </td><td> MathWorks </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 353001 </td><td> 35mm 플라스틱 문화 요리 </td><td> 매 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 높은 굴절률 유리 </td><td> PlanOptik </td><td> - </td><td> 굴절률 488 NM = 1.78 </td></tr><tr><td> 시리즈 M </td><td> 높은 굴절률의 액체 </td><td> Cargille 실험실 </td><td> - </td><td> 굴절률 = 1.78 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> 실리콘 엘라스토머 키트 </td><td> 다우 코닝 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 글루타티온 </td><td> Tripeptide </td><td> EMD 화학 </td><td></td><td> 무료 radica내 청소 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> 효소 </td><td> 시그마 </td><td> H6254 </td><td> 유형 V </td></tr><tr><td> L - 시스테인 </td><td> 아미노산 </td><td> Fluka </td><td> 30,090 </td><td> papain을 활성화 </td></tr><tr><td> Papain </td><td> 효소 </td><td> Fluka </td><td> 76,220 </td><td> Carica 파파야에서 </td></tr><tr><td> Trolox ® </td><td> 수용성 비타민 E </td><td> 시그마 </td><td> 56,510 </td><td> 자유 라디칼 스캐빈저 </td></tr><tr><td> ADVASEP - 7 </td><td> Sulfonated B - 사이클로 덱스트린 유도체 </td><td> 시그마 </td><td> A3723 </td><td> FM 1-43 감소 ® 배경 형광 </td></tr><tr><td> FM 1-43 ® </td><td> 형광 염료 </td><td> Invitrogen </td><td> T35356 </td><td> &quot;특수 포장&quot; </td></tr><tr><td> 스티키 왁스 </td><td> 피펫 코팅 에이전트 </td><td> 커 주식 회사 </td><td> - </td><td> 피펫 커패시턴스를 감소 </td></tr></tbody></table> 표 2 :이 연구에서 사용 생리 솔루션을 제공합니다. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 물질 </td><td> 낮은 칼슘 2 + 링거스 </td><td> 제어 링거스 </td><td> 하이 K + 링거스 </td><td> 내부 솔루션 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 MM </td><td> 120 MM </td><td> 97.5 MM </td><td> - </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2.5 MM </td><td> 2.5 MM </td><td> 25 MM </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 ㎜ </td><td> 1 ㎜ </td><td> 1 ㎜ </td><td> 4 MM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0.5 MM </td><td> 2.5 MM </td><td> 2.5 MM </td><td> - </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 MM </td><td> 10 MM </td><td> 10 MM </td><td> 10 MM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.75 MM </td><td> - </td><td> - </td><td> 0.5 MM </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 10 MM </td><td> 10 MM </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 글루타티온 </td><td> 2 MM </td><td> 2 MM </td><td> - </td><td> 1 ㎜ </td></tr><tr><td> CH 3 CSO 3 S * </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 100 MM </td></tr><tr><td> TEACl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 MM </td></tr><tr><td> ATP - MG </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 MM </td></tr><tr><td> GTP - 리 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 ㎜ </td></tr><tr><td> Rpep -로드 &#39;** </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 5 MM </td></tr><tr><td> 음량 </td><td> 200 ML </td><td> 100 ML </td><td> 5 μL </td><td> 100 μL </td></tr></tbody></table> * 세슘 methanesulfonate. ** RIBEYE 바인딩 펩타이드 : rhodamine + EQTVPVDLSVARDR - cooh (MW 1997.75).

<ol><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport%2C+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li>
<li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li>
</ol>

빛이 거리와 함께 기하 급수적으로 방울 년부터 2) 목적 형 TIRF 현미경의 장점은 1) 그함으로써 빛을 - 오브 - 초점 밖으로 최소화 목적의 초점 평면 내의 좁은 지역에 여기 광을 제한함으로써 우수한 광학 sectioning을 제공한다는 점입니다 , 수직 방향으로 움직임은 형광 강도의 변화로 모니터링할 수 있으며, 높은 수치 조리개 목적 1.5을 통해 3) 효율적인 조명 컬렉션. 기술의 주요 단점은 그것이 전자 현미경의 ultrathin 섹션와 대략적으로 비슷 세포 표면, 100 &amp; NM 내에서 일어나는 이미징 이벤트로 제한됩니다 것입니다. 따라서 이러한 이벤트의 시각화는 유리에 준수 막의 패치에 가까운 시냅스 리본의 존재와 vesicles의 성공 로딩에 단단히 유리에 준수되는 세포에 매우 다릅니다. 우리 프로토콜은 양극성 세포 시냅스 터미널 2,6 이내 vesicles의 총 수를만이 1-2%의 로딩이 가능합니다. 그 말씀을 통해 우리가 이미지 수있는 사람보다 세포의 표면에서 일어나는 많은 이벤트가...

tirf 현미경과 망막 바이폴라 세포 이미징 exocytosis

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

총 내부 반사율 형광 (TIRF) 현미경은 유리 같은 높은 굴절률 물질에 가까운 형광 분자의 선택적 이미징에 의해 세포막에서 일어나는 사건의 연구를 수있게 해주는 기술입니다<sup&gt; 1</sup&gt;. 이 문서에서는, 우리는 금붕어 망막으로부터 격리 망막 바이폴라 세포의 시냅스 vesicles의 이미지 exocytosis이 기술을 적용할 수 있습니다. 이 뉴런들은 대형 축삭 터미널로 인해 이런 종류의 연구에 매우 적합합니다. 양극성 세포를 클램핑 동시에 패치함으로써, 사전 시냅스 전압과 시냅스 릴리스 사이의 관계를 조사 수 있습니다<sup&gt; 2,3</sup&gt;. 양극성 세포 터미널 내부 시냅스 vesicles가에 의해 형광 염료 (FM 1-43 ®)와 함께 로드된 공동 피고 높은 K를 포함하는 염료와 닮은 솔루션<sup&gt; +</sup시냅스 터미널에&gt; 집중. 이것은 세포를 depolarizes하고 glutamatergic vesicles에 endocytosis와 결과의 염료 이해를 촉진. 약 30 분 거리에 여분의 염료를 세척 후, 전지는 패치가 고정되어와 488 nm의 레이저와 동시에 몇 군데 것에 대해 준비가되어 있습니다. 패치 피펫 솔루션은 시냅스 리본 단백질 RIBEYE을 선택 바인딩 rhodamine 기반의 펩티드를 포함<sup&gt; 4</sup&gt; 단말기가 561 nm의 레이저로 몇 군데있을 때이를 구체적으로 리본을 라벨. 이것은 활성 영역의 정확한 현지화 및 추가 - 시냅스 이벤트에서 시냅스의 분리 수 있습니다.

이 비디오에서는, 우리는 총 내부 반사율의 형광 (TIRF) 현미경을 사용하여 금붕어 망막 바이폴라 세포에서 단일 시냅스 소포의 exocytosis와 인​​신 매매를 라벨 및 시각화하는 방법을 보여줍니다.

TIRF 현미경과 망막 바이폴라 세포 이미징 Exocytosis

전반사 형광(TIRF) 현미경법은 선택적인...을 통해 세포막에서 일어나는 사건들을 연구할 수 있게 해주는 기술입니다.

이 절차는 성체 금붕어 눈 뒷부분의 신경 조직인 신경 망막의 해부로 시작됩니다. 망막을 효소 용액에 35분 동안 두고, 세척한 후 화염 연마된 유리 피펫으로 처리하여 세포를 해리시킵니다. 그 다음 세포를 고굴절 유리 커버슬립 위에 도말하고 플라스틱 조직 배양 접시에 장착합니다.분리된 양극세포는 축삭 말단의 뚜렷한 형태학적 특징을 통해 식별합니다. FM 1 43이 포함된 용액을 10초 동안 퍼프(puff) 처리한 후, 염료를 씻어내기 전 30초 동안 대기합니다. 30분간 세척한 후 세포를 패치 클램프(patch clamp)하고 TIRF 현미경으로 이미징합니다.안녕하세요, 저는 예일 대학교 의과대학 세포 및 분자 생리학과의 ZEC Lab 소속 Christina Jovi입니다. 오늘 저희는 TIRF 현미경을 사용하여 살아있는 망막 양극세포의 엑소사이토시스를 연구하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 시냅스 방출 메커니즘을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.그럼 시작하겠습니다. 먼저 해부 전 금붕어를 최소 30분 동안 암적응시킵니다. 머리를 절단하고 안구를 적출한 후, 안구 하나를 거름종이 위에 올리고 11번 메스 날 끝을 사용하여 공막 연변부를 천자합니다. 천자된 구멍 내부로본나 가위(bonna scissors)를 사용하여 전안부를 전체적으로 절제합니다. 다음으로 남은 안배(optic cup) 위에 작은 필터 페이퍼 조각을 올려놓고 압력을 가합니다. 유리체를 흡수시킨 후, 망막이 부착된 필터 페이퍼를 들어 올리고 VNA 가위를 사용하여 시신경을 절단합니다.망막이 포함된 여과지를 고알루론 용액이 담긴 35mm 플라스틱 배양 접시에 넣고, 7번 Dumont 핀셋을 사용하여 여과지에서 망막을 벗겨냅니다. 다음으로, 산업용 탄소강 외날 칼날의 절반을 사용하여 망막을 4~6조각으로 자르고, 히알루로니다아제가 효과를 낼 때까지 20분 동안 히알루로니다아제 용액에 둡니다. 기다리는 동안 파파인에 L-시스테인 용액 5mL를 추가하고 액체가 투명해질 때까지 약 5~10분 동안 둡니다. 망막 조각들을 저칼슘 링거 용액으로 3회 세척한 후, 파파인 용액에 30~35분 동안 둡니다.파파인 용액에서 35분 동안 배양한 후, 망막 조각을 3회 세척합니다. 세척한 조각들을 저칼슘 링거액(low calcium ringers)이 담긴 35mm 플라스틱 배양 접시로 옮기고, 세포 해리를 시작할 때까지 해당 접시를 12~14°C에서 보관합니다.먼저, 분젠 버너를 사용하여 유리 파스퇴르 피펫(glass PEs) 또는 피펫의 끝부분을 가열한 후, 해부용 포셉으로 끝을 살짝 구부려 해리용 피펫을 제작합니다. 저칼슘 링거액이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 망막 조각을 넣고, 제작한 해리용 피펫으로 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 망막을 천천히 해리시킵니다. 기포가 생기지 않도록 주의하면서, 망막 현탁액 한 방울을 저칼슘 링거액이 채워진 수제 기록 챔버에 떨어뜨려 분리된 세포를 도말합니다.챔버는 중앙에 원형 구멍이 뚫린 35 밀리미터 플라스틱 배양 접시의 하단 절반과, 바닥에 접착된 굴절률 1.78 유리의 원형 커버슬립으로 구성됩니다. 해부 및 양극 세포 분리가 완료되었으므로, 양극 세포 로딩 및 세척을 시작할 준비가 되었습니다. 이 실험에서는 매우 높은 수치 구경 렌즈와 민감한 카메라가 장착된 대물렌즈형 전반사 형광 현미경을 사용하는 것이 가장 좋습니다.이 영상에서는 1.65 수치구경 대물렌즈와 전자 증배 전하결합소자(EMCCD)를 사용할 것입니다. 먼저, 고굴절률 액체 한 방울을 현미경 대물렌즈에 추가합니다. 기록 챔버를 현미경 대물렌즈 위에 놓습니다.접지 전극과 표면 관류 배출관을 챔버에 조심스럽게 장착합니다. 세포가 가라앉아 바닥에 부착될 수 있도록 챔버를 현미경 위에 10분에서 20분 동안 그대로 둡니다. 그 다음, 표면 관류 라인을 퍼지하고 세척액을 추가합니다.저칼슘 링거액과 대조군 링거액을 과관류 시스템에 주입합니다. 현미경의 명시야 조명을 켜고 손상되지 않은 양극세포를 찾습니다. 뉴런이 챔버 바닥에 단단히 부착되어 있는지 확인하기 위해 현미경을 가볍게 두드립니다.슈퍼퓨전 펜을 손상되지 않은 세포 가까이에 배치하고 저칼슘 링거액으로 준비물을 지속적으로 관류합니다. 이제 실내 조명을 끄고 광경로에 적색 장파장 필터를 추가하여 형광 염료의 여기를 최소화합니다. 로딩 피펫에 10 µL의 형광 염료 용액을 채웁니다.마이크로 매니퓰레이터에 장착한 후, 선택한 bilar cell과 동일한 초점 평면에 올 때까지 과압(over pressure) 옵션을 사용하지 않고 표본 위로 내립니다. 퍼퍼(puffer) 개구부를 축삭 말단에서 약 10 micrometers 거리에 위치시킵니다. 슈퍼퓨전(superfusion) 시스템을 끄고, 피펫의 과압을 켜서 염료 용액을 10초 동안 분사합니다.이제 과압(over pressure)을 끄고 피펫을 움직이지 않은 상태에서 30초 동안 기다립니다. 그다음 슈퍼퓨전(superfusion) 시스템을 켜고 세척액으로 챔버를 5분 동안 세척합니다. 그동안 배스(bath)에서 퍼퍼 피펫(puffer pipette)을 제거합니다.5분 후, SUPERFUSION 시스템을 저칼슘 링거액으로 전환하여 25~30분 동안 관류함으로써 과잉 염료를 제거합니다. 양극 세포의 로딩과 세척이 완료되면, 패치 클램핑 및 T-I-R-F-M 이미징을 시작할 준비가 된 것입니다. 세척이 완료된 후, 패치 피펫이 염료에 오염되는 것을 방지하기 위해 전극 홀더를 교체하십시오.축삭 말단을 시야 중심에 위치시킵니다. 패치 피펫에 내부 용액 7 µL를 채웁니다. 피펫을 가볍게 두드려 기포를 제거합니다.용융된 치과용 왁스로 코팅한 후 마이크로 매니퓰레이터에 장착합니다. 피펫의 가압 밸브를 켜고 피펫을 준비물 위로 천천히 내립니다. 피펫의 저항을 확인하고 필요한 교정을 수행합니다.다음으로, 초융합 시스템(superfusion system)을 제어 링거액(control ringer solution)으로 설정한 후, 전극 팁을 세포체에 살짝 접촉시켜 피펫과 세포 사이에 기가씰(giga seal)을 형성합니다. 피펫의 과압(over pressure)을 끈 상태에서, 씰이 형성된 전극에 부드럽게 음압을 가합니다. 앰플리파이어에서 홀셀(whole cell) 모드를 선택하고 세포 유지 전위(holding potential)를 -60 mV로 설정합니다.이제 이미징 소프트웨어를 사용하여 축삭 말단 전체를 포함하는 관심 영역(ROI)을 선택하십시오. 명시야 조명을 끄고 488 nanometer 레이저를 말단에 짧게 조사하십시오. TIRF 이미징을 위한 적절한 초점 평면을 찾으십시오.다음으로, 피펫에 약간의 음압을 가하면서 증폭기의 zap 명령을 사용하여 세포막을 파괴하고, 세포 정전용량과 직렬 저항을 보정합니다. 그런 다음 시냅스 소낭의 이동을 이미지화하는 동안 전압 프로토콜을 적용합니다. 회복 시간을 갖기 위해 시행 간에 최소 40초 동안 대기합니다.먼저, 명시야 현미경으로 양극세포를 선택합니다. 그런 다음 배율을 높여 해당 축삭 말단에 형광 염료를 주입합니다. 30분 동안 세척한 후, 형광 글루타메이트성 소포의 이동과 함께 주입된 말단을 현미경으로 촬영할 수 있습니다.여기에서는 패치 피펫을 통해 리본 아이 결합 펩타이드를 도입하며, 이를 통해 561 nm 레이저로 이미징할 때 시냅스 리본의 위치를 확인할 수 있습니다. 그런 다음 세포를 탈분극시키고 488 nm 레이저로 소포의 이동을 이미징합니다. 지금까지 망막 양극 세포를 분리하여 플레이트에 도말하고 형광 염료를 로딩하는 방법과, 이 뉴런들을 패치 클램프하고 동시에 TIRF 현미경으로 이미징하는 방법을 보여드렸습니다.이 절차를 수행할 때, 세포가 레이저에 과도하게 노출되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 시청해주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 우리는 전기 생리학 및 Ca2 + 이미징에 적합 한천 - 임베디드 망막 조각의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 하나 하나 presynaptic 신경 터미널 직접 패치 - 클램프 녹음을 사용하여 망막 microcircuits의 리본 형태의 시냅스를 공부하실 수 있습니다.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

출처: Daniele, F., et. SH-SY5Y 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 평가하기 위한 al TIRFM 및 pH 민감성 GFP 프로브: 세포 이미징 및 데이터 분석. J. Vis. 특급. (2015). 이 동영상은 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용하여 형광단 태그가 지정된 시냅스 소포를 시각화하는 인간 신경모세포종 세포의 이미징을 보여줍니다. 세포는 먼저 형광 모드에서 초점을 맞춥니다. 그런 다음 내부 전반사를 달성하기 위해 조정이 이루어지며, 멤브레인 근처의 형광단을 선택적으로 여기시키는 소멸파를 생성합니다. TIRF 이미징 전에 획득 매개변수가 구성되고 샘플링 주파수가 설정됩니다.

전반사(Total Internal Reflection) 형광 현미경을 사용한 세포 이미징

출처: Winkle, CC, et al. 축삭 분지 및 신경 형태 형성 동안 원형질막 전달의 역할을 정의하기 위해 결합된 방법론을 활용합니다. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 피질 뉴런의 엑소 사이크 이벤트를 시각화하기 위한 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 보여줍니다. pH에 민감한 녹색 형광 단백질(GFP) 마커는 소포 융합 시 형광을 발하며, 선택적 TIRF 여기는 타임랩스 이미징에서 막-근위 엑소사이토시스를 포착합니다.

엑소 세포 사건의 시각화를 위한 전반사 형광 현미경 

편광 기반의 전반사 형광 현미경 (pTIRFM)은 세포막 역학의 실시간 감지를 할 수 있습니다. 이 문서는 규제 세포 외 유출 동안 막 리모델링의 연구 pTIRFM의 구현을 설명합니다. 기술은 직접적으로 또는 간접적으로 막 형상의 변화를 수반 세포 생물학의 다른 프로세스에 일반화이다.

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

Clathrin-mediated endocytosis는 빠르고 매우 역동적인 과정으로 신호 수용체를 포함한 많은 단백질을 내부화합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 내포세포 이벤트의 동역학을 직접 시각화합니다. 이는 내포세포 기전의 핵심 구성원이 서로 어떻게 협력하는지, 그리고 단백질 화물이 이 과정에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 필수적입니다.

TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

이 논문은 synaptobrevin2-pHluorin 구조체 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 방법을 제공합니다. 이미지 처리 및 데이터 분석을 위해 개발된 전략도 보고됩니다.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

여기 우리는 규제 exocytosis의 라이브 셀 이미징 방법 선발. 이 메서드는 기자로 서 FITC-dextran, 리소좀과 관련 된 세포에 축적을 활용 합니다. 이 간단한 메서드는 또한 유전자 조작 하기 어려운 셀에 규제 exocytosis의 다른 모드 사이 구별 수 있습니다.

이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서

생체 내 이미징은 건강 및 질병 생물학 연구를위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 표준 2 광자 현미경으로 마우스 망막의 경공 영상을 설명합니다. 또한 망막의 여러 세포 코호트를 형광으로 표지하는 다양한 생체 내 이미징 방법을 보여줍니다.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

이 연구는 광수용체 세포체를 제거함으로써 면역조직화학, in situ hybridization 및 전기생리학 실험을 위해 더 빠른 항체 확산과 내부 망막 뉴런에 대한 패치 피펫 접근을 개선할 수 있는 대체 편평 장착 망막 제제를 제시합니다.

척추동물 망막의 내부 핵층 뉴런 연구를 위한 개선된 평판 준비로서의 망막 분할

본 논문은 회전 원반 공초점 현미경을 사용하여 망막에서 미세아교세포 운동성과 시냅스 후 눈점과의 접촉을 시각화하고 정량화하는 방법을 시연합니다.

병든 쥐 망막에서 미세아교세포 역학과 시냅스와의 상호작용에 대한 실시간 영상 및 특성 분석

배우세요 TIRF 현미경을 이용한 금붕어 망막 바이폴라 세포의 시냅스 소포 외배출 시각화 방법입니다. FM 1-43 형광 염료 로딩과 패치 클램프 기술로 신경전달 메커니즘을 실시간 관찰할 수 있습니다.

TIRF 현미경과 망막 바이폴라 세포 이미징 Exocytosis

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