부상당한 쥐 척수를 복구하는 주변 신경 이식과 매트릭스 변조를 결합

말초 신경을 척수 손상 부위에 이식하기 위한 준비는 이식 7~10일 전에 PNG의 사전 퇴행을 유도하는 것으로 시작합니다. 공여 쥐의 경골 신경 분지를 절단합니다. 흡입법을 통해 경추 5번 또는 C5 부위의 반절제를 수행합니다.

공여 쥐로부터 PNG를 적출하여 병변 공동의 rostral wall에 맞닿게 배치하고, aurum을 경막에 봉합하여 고정합니다. 3주 후, C7 부위에 dorsal quadrant 병변을 만든 다음, C-H-A-B-C로 포화시킨 gel foam을 공동 내에 15분간 배치하여 glial scar의 proteoglycans를 분해합니다. 2일 후, 병변 부위 인접 부위에 C-H-A-B-C를 미세 주입하고 PNG의 원위단을 dorsal quadrant 병변에 맞닿게 배치합니다.

안녕하세요, 저는 Drexel University College of Medicine의 척수 손상 연구 센터 소장인 John Hula입니다. 저는 hula lab의 Veronica Tom 박사이며, 저는 Martha mean입니다.

Hula 연구실에서 알려드립니다. 오늘은 성체 쥐의 손상된 척수 내에 말초 신경 분절을 이식하는 절차를 시연하겠습니다. 저희 연구실에서는 척수 손상 후의 축삭 재생 및 기능 회복을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작하겠습니다. 미세 수술을 준비하기 위해 수술 스테이션을 소독하고 모든 수술 기구를 오토클레이브로 멸균하십시오. 열 차단막과 미세 지혈용 2 mm³ 미만의 작은 젤 폼 조각들을 준비하십시오.

면봉, 거즈 패드 및 수술 도구를 준비합니다. 발가락 꼬집기 테스트로 동물이 완전히 마취되었음을 확인한 후, 마취된 쥐를 준비대 위에 놓습니다. 예정된 수술 부위의 털을 넓게 깎아내고, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 무균 세척 기술에 따라 수술 부위를 세척합니다.

다음으로 쥐를 열 차단막 위에 놓고 흡입 콘으로 코와 입을 덮은 후, isof fluorine 농도를 3%로, 유량을 분당 0.2 liters로 낮춥니다. 적절한 용량의 항생제 ampicillin을 피하 주사하고 진통제 buprenorphine을 근육 주사로 투여합니다. 말초 신경(PN)은 제거 7~10일 전에 절단하여 퇴행을 촉진시키는데, 이는 신선한 신경 표본보다 축삭 성장에 더 적합한 환경을 제공합니다.

pn 절단을 시작하려면 동물을 옆으로 눕힙니다. 멸균 장갑으로 교체하고 수술 부위 주변에 멸균 수술포를 덮습니다. 대퇴골두에서 무릎까지 직선으로 절개하며, 대퇴골과 평행하게 약 3 mm 거리를 유지합니다. 피부 절개선과 동일한 선을 따라 표층 대퇴이두근을 절개하여 하부의 외측광근을 노출시킵니다.

외측광근이 노출되면 가위를 사용하여 무릎 근처의 근육에 작은 절개를 넣고 이를 대퇴골두 방향으로 연장합니다. 리트랙터(retractor)를 사용하여 외측광근을 조심스럽게 분리하여, 대퇴골과 평행하게 주행하는 좌골신경의 경골신경 및 비골신경 분지가 보일 때까지 진행합니다. 다음으로, 좌골신경의 주신경간이 확인될 때까지 이 신경 분지들을 대퇴골두 방향으로 따라갑니다.

좌골 신경의 분지 바로 아래에서 미세 핀셋을 사용하여 경골 신경 분지를 둘러싸고 있는 결합 조직 또는 신경외막을 조심스럽게 분리합니다. 이것이 더 큰 분지입니다. 경골 신경 분지가 분리되면, 6-0 실크 결찰사를 주변에 넣고 조입니다.

마이크로 가위를 사용하여 결찰 부위까지의 신경 원위부를 절단합니다. 봉합사를 외측광근(vastus lateralis muscle)에 통과시킨 후 매듭을 지어 묶습니다. 이렇게 하면 절단된 경골신경(tibial nerve) 끝부분을 쉽게 찾을 수 있는 표식 역할을 하게 됩니다.

신경을 채취합니다. 이후 외측광근을 6-0 실크 봉합사로 봉합합니다. 그다음 상완이두근을 6-0 실크 봉합사로 봉합합니다.

마지막으로, Michelle 상처 클립으로 피부를 봉합합니다. isof fluorine의 흐름을 차단하고 흡입용 노즈콘을 제거합니다. 동물을 열 차단제가 깔린 유지 케이지에 넣습니다.

동물을 홈 케이지로 돌려보냅니다. 7~10일 후 동물이 각성하여 활발해지면 PN 분절을 채취할 준비가 된 것입니다. 이식을 시작하려면 마취된 동물을 열 차단막 위에 놓으십시오.

동물이 완전히 마취되었는지 확인한 후, 상처 클립을 제거하고 피부 절개 부위를 벌립니다. 피부를 쉽게 벌려 오염을 방지할 수 있으므로 해당 부위를 미리 제모할 필요는 없을 수 있습니다. 털을 절개할 필요가 없으므로, 표층 근육의 봉합선을 절개하여 외측광근을 노출시킨 다음 이 근육의 봉합선을 절개합니다.

봉합선을 따라 경골 신경의 절단단까지 추적하여 신경에서 봉합사를 제거하십시오. 미세 핀셋을 사용하여 경골 신경 15 millimeter 길이의 신경외막을 박리하고, 이 원위단을 절단하십시오. 절단된 신경 분절을 제거하여 멸균된 Hank's balanced salt solution에 담그십시오.

이제 다음 단계인 척수 손상 유도를 통해 PN 이식을 준비하겠습니다. 이식은 자가 이식 또는 동종 이식으로 진행될 수 있습니다. 마취된 쥐를 열 차단막 위에 놓고, 이전 섹션에서 설명한 대로 항생제와 진통제를 투여한 후 HEMI 절단 척수 손상을 유도합니다. 먼저 후두와와 돌출된 T2 등쪽 척추 돌기를 찾으십시오.

이러한 외부 지표 사이의 전체 길이에 따라 절개합니다. 표층 승모근의 정중선을 절개하고 그 아래의 경추 주변 근육들을 분리합니다. 근육들이 벌어진 상태를 유지하도록 리트랙터를 삽입합니다.

심부 척수상근을 C4, C5, C6의 배측 척추 돌기에서 절단해야 합니다. R-쥬어(R jurors)를 사용하여 C5의 부분 엽절제술을 시행함으로써 척수의 우측 전체와 좌측 내측 부분을 노출시킵니다. 척수 중앙선의 기준점으로 두드러진 배측 정맥을 활용하십시오.

다음으로, 마이크로 메스 날을 사용하여 경막을 뚫고 C5 척수까지 절개선을 확장합니다. 당겨진 유리 마이크로 캐뉼라를 사용하여 아래의 지주막하 공간과 연질막에 작은 절개를 가합니다. 조직을 분리하고 제거를 용이하게 하기 위해 부드러운 압력과 마이크로 포셉을 사용하여 척수의 우측 배측을 흡입하기 시작합니다.

척수의 중간 및 복측 부분으로 계속 진행하여, 등측에서 복측까지 그리고 정중선에서 외측 뇌수막까지 완전히 관통하는 2 mm 길이의 공동을 생성합니다. HEMI 구역 병변 공동에 식염수에 적신 겔 폼(gel foam)을 넣습니다. 지혈을 위해, 이전에 수확하여 Hank 용액에 보관해 두었던 말초 신경 분절을 꺼냅니다.

신경 분절의 근위부 3mm 지점에서 신경외막(epineurium)을 부드럽게 잡고, 이 끝단을 HEMI 절단 병변 공동의 吻側(rostral) 벽에 맞닿게 합니다. 신경외막에서 경막(dura mater)으로 10-0 봉합사를 이용해 분절을 고정합니다. 그다음, 이식된 그라프트 끝단 위로 경막을 봉합하여 닫고, 두 조각의 셀라스틱(celastick) 탄성 막 사이에 그라프트를 끼워 고정합니다.

이식물을 C6, C7 및 T1 척추 돌기 옆에 배치하십시오. 신경의 원위단이 척수나 근육 조직에 맞닿지 않도록 하십시오. 4-0 봉합사로 근육을 층별로 봉합하고, 상처 클립으로 피부 절개 부위를 폐쇄하십시오.

마지막으로, 동물을 열 차단 장치가 있는 유지 케이지에 넣은 후 원래의 케이지로 되돌립니다. 동물이 깨어나 활동하기 시작하면, PN 이식편의 원위단에 도달한 재생 축삭이 척수 내로 다시 뻗어 나가지 못하는 경우가 많습니다. 따라서 손상 부위 주변의 흉터 조직을 분해하기 위해 콘드로이틴 ACE를 미세 주입합니다.

이 절차는 PN 이식 21일 후에 수행하며, 우선 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 그런 다음 상처 클립을 제거하고 이전에 설명한 대로 항생제와 진통제를 투여합니다. 미세 핀셋과 스프링 가위를 사용하여 표면 봉합사를 절개하고 신경 이식물을 둘러싸고 있는 탄성막을 노출시킵니다.

탄성 막에서 신경의 길이를 조심스럽게 분리합니다. 신경을 수술 부위에서 젖혀둡니다. C7 척추 돌기의 우측에서 부분 척추궁 절제술을 시행합니다.

마이크로 메스 날로 뇌막을 뚫고 흡입을 통해 C7 척수 부위에 1mm³ 크기의 등쪽 사분면 병변 공동을 형성합니다. 지혈을 위해 식염수에 적신 겔 폼을 병변 공동에 넣습니다. 그 후, 겔 폼을 콘드로이틴 나제(chondroitin nace)에 적신 것으로 교체합니다.

A BC. 병변 부위를 15분 동안 처리하며, 5분마다 chondroitin이 함침된 새로운 겔 폼을 제공합니다. 신경 이식편의 외부 길이를 scholastic membrane으로 덮습니다. 표층 근육은 4-0 봉합사로, 피부 절개 부위는 wound clip으로 봉합합니다.

동물을 열 차단막이 있는 유지 케이지에 넣고, 동물이 의식을 회복하고 활동적으로 움직이면 원래의 케이지로 돌려보냅니다. 이틀 후, 즉 PN 이식 23일 후에 동물에 대해 다시 수술을 실시하여 척수에 chondroitin NA를 미세 주입합니다. 이전과 마찬가지로 마취된 동물로부터 상처 클립을 제거하고 항생제와 진통제를 투여합니다.

표면 봉합사를 절개하여 신경 이식물을 둘러싸고 있는 탄성 막을 노출시킵니다. 이식물을 건드리지 않고 C7 이식 부위를 노출합니다. 그런 다음 유리 캐뉼라가 장착된 Hamilton 주사기를 사용하여, 이식물과 척수가 접합된 지점에서 말단 방향으로 약 1mm 떨어진 척수의 우측에 1µL의 chondroitin ace A BC를 미세 주입합니다.

신경 분절의 원위부 2mm에서 EUR을 조심스럽게 벗겨내고, 이 끝단을 C7 손상 부위의 공동에 맞닿게 합니다. 신경외막을 통해 10-0 봉합사로 해당 분절을 경막에 고정합니다. 표층 근육은 4-0 봉합사로 봉합하고 피부 절개 부위는 상처 클립으로 폐쇄합니다.

동물을 열 차단제가 깔린 유지 케이지에 넣고, 의식이 회복되어 활동적으로 움직이면 원래의 케이지로 돌려보냅니다. 이 절차가 최적화되면 말초 신경 분절이 호스트 척수와 밀접하게 통합되어, 이식편으로 재생되는 척수 축삭을 시각화할 수 있게 됩니다. 우리는 상행 및 하행 경로에 대해 biotinylated dextrin amine 또는 BDA를 사용하여 이식편을 확산 충전하였습니다.

척수 축삭은 일반적으로 이식물로 진입하여 이식물의 길이에 평행하게 비교적 직선으로 성장하며, 하루에 약 1mm의 속도로 이식물의 원위단까지 뻗어 나갑니다. 말초 신경 축삭은 인접한 척수로 침투합니다. 원위단에 도달했을 때 주변 흉터 조직에서 억제성 프로테오글리칸을 제거하기 위해 chondroitin NACE를 사용한 경우, vehicle로 처리한 대조군에서는 처리 후 숙주 조직으로 뻗어 나가는 말초 신경 축삭이 매우 적습니다.

하지만 원위부 인터페이스를 콘드로이틴으로 처리한 경우, 훨씬 더 많은 수의 축삭이 이식물에서 나와 척수를 재지배합니다. 동물당 15~20개의 절편 중 축삭 성장이 관찰된 이 하나의 대표 절편에서 보여주는 것과 같이, 이 막대그래프는 콘드로이틴 처리 후 축삭 성장이 유의미하게 증가했음을 보여줍니다. 이식물 내 축삭에 전기 자극을 주어 척수 신경세포에서 시냅스 마커를 면역화학적으로 검출함으로써, 이식된 이식물과 호스트 척수 사이의 기능적 연결성을 평가할 수 있습니다.

원위부 접합 부위를 포함하는 이 척수 영역을 비오틴화 덱스트린 아민(녹색)과 시냅스 마커인 시냅신(적색)으로 면역세포화학 염색하였습니다. 화살표는 마커의 공국소화가 일어난 영역을 나타내며, 이는 이식편에서 재생된 일부 섬유가 기능적인 시냅스 접촉을 형성했음을 보여줍니다. 이식편과 척수 뉴런 간의 기능적 연결성은 CFOs 발현 분석을 통해 또한 입증되었습니다. 원위부 인터페이스 너머의 숙주 뉴런을 시냅스 자극한 후, 이 시냅스 간 활성 마커는 이식 부위와 같은 쪽(ipsilateral) 조직에서 많은 CFOs 양성 뉴런으로 확인될 수 있으며, 고배율에서 관찰하면 이식 부위의 반대쪽(contralateral) 조직에서는 CFOs 양성 뉴런이 거의 관찰되지 않습니다.

지금까지 척수 손상 후 재생을 촉진하기 위해 말초 신경 이식물을 이식하기 전, 척수 손상 부위를 준비하는 방법을 살펴보았습니다. 이 시술을 수행할 때는 이식 전 충분한 신경 길이를 확보하는 것과 이식물을 척수 손상 부위에 밀착시켜 배치하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 설명을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.