Name: 부상당한 쥐 척수를 복구하는 주변 신경 이식과 매트릭스 변조를 결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 14 s
Description: 배우세요 쥐 척수 손상 복구를 위한 주변 신경 이식술과 매트릭스 변조 효소 활용법을. 신경 재생 촉진 및 기능 회복 연구에 활용되는 이 기법은 재생 의학 발전에 기여합니다.

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이 작품은 NIH / NINDS 보조금 NS26380과 NS55976, 크리스토퍼와 다나 리브 재단​​과 척수 연구 다니엘 Heumann 기금에 의해 지원되었다. 의학 척수 연구 센터의 드렉셀 대학이 작업을 완료하는 데 사용되는 핵심 시설에 대한 지원을 제공합니다.

미세한 수술 1) 준비 <ol><li> 외과 역 깨끗하고 악기 및 액세서리 재료를 설정하기 전에 희석 표백 솔루션으로 살균해야합니다. 계측기 전에 수술 일일 autoclaved 및 멸균 용기에 저장됩니다. 다른 동물 절차 사이의 악기에서 병원균 및 미생물 오염 물질을 제거하는 데 사용되는 핫 비드 살균기 (파인 과학 도구)를 켭니다. </li><li> 열 장벽 플러그인은 수술하는 동안 체온을 유지하는 데 사용됩니다. 출혈을 제어하는​​ 데 사용 목화 면봉과 거즈 패드를 설정합니다. 멸균 생리 식염수에 마이크로 hemostasis 및 담가 사용하는 젤 폼의 작은 (&lt;2mm 3) 조각을 준비합니다. </li><li> Isoflurane과 유도 챔버 및 마취에 넣어 랫 (산소 증발 5 %, 유동 비율 2.0 L / 분). 챔버의 준비 테이블에 동물을 제거하고 목적으로 수술 분야에서 모피의 다양한 영역을 면도. 필드의 중앙에 70% 이소 프로필 알코올로 닦아 시작과 같은 방식으로 Polyhydroxidine 솔루션 (Xenodine)로 닦고 다음에, 바깥쪽으로 방출. 세척 3 회이 순서를 반복합니다. </li><li> 열 장벽, 표지 코 흡입 콘과 함께 입안에 플레이스 동물, 3 %와 0.2 L / 분에 유량을 I​​soflurane 줄일 수 있습니다. 근육내 주사로 하위 피부 주입 및 진통제 (Buprenorphine 0.05 밀리그램 / kg)에 의해 항생제의 적절한 투여 (암피실린)를 제공합니다. </li><li> 외과 Xenodine 솔루션 손을 문질러 물로 린스합니다. 무균 수술 가운은 외과 의사에 장착되어있을 것이다; 손을 살균 수건으로 건조 및 멸균 장갑으로 덮여 것입니다. 이 절차는이 문서에서 설명하는 각 수술에 대해 다음입니다. </li><li> 멸균 악기를 덮고 뚜껑은 조수에 의해 제거되며 악기는 의사에 의해 멸균 덮개에 뻗어있는 것입니다. </li></ol> 2) PN의 절개면은 변성을 홍보하기 <ol><li> 동물의 측면에 누워있는 직선 평행하게 유지 무릎을 향해 대퇴골의 머리에서 절개와 대퇴골에서 약 3mm합니다. 기본 vastus lateralis 근육을 노출, 피부 절개와 같은 라인을 따라 표면 팔뚝 femoris 근육으로 잘라. </li><li> 사용 가위는 무릎 근처 vastus lateralis에 작은 상처를 만들어 대퇴골의 머리 방향이를 확장합니다. 다시 가위로 가볍게 좌골 신경의 결합 tibial과 peroneal 신경 지점까지 vastus lateralis을 분리하는 것은 (대퇴골에 병렬 실행) 시각입니다. </li><li> 좌골 신경의 기본 줄기가 확인된 때까지 대퇴골의 머리 방향이 지점을 추적. 그냥 좌골 신경의 분기점 아래 (이것은 큰 지점입니다) tibial 신경 지점을 둘러싼 결합 조직 (epineurium)을 조심스럽게 분리하는 훌륭한 집게를 사용합니다. </li><li> 일단 격리된 tibial 신경 주위에 6-0 실크 봉합사를 실수로 조입니다. 끈에 주동이의 신경을 가로로 쪼개다하기 위해 마이크로 가위를 사용합니다. vastus lateralis 근육을 통해 봉합 라인을 통과하고 매듭으로 묶을. 신경이 7-10일 나중에 수확하는 때 이것은 tibial 신경의 절단 끝 쉽게 위치를 라인을 제공합니다. </li><li> 이전 접목하는 tibial 신경의 변성이 새로운 신경 준비보다는 axonal 성장을위한 더 적합한 환경을 제공합니다. </li><li> 6-0 실크 봉합과 vastus lateralis 근육을 닫습니다. 6-0 실크 봉합과 팔뚝 femoris 근육을 닫습니다. 미셸 상처 클립 피부를 닫습니다. Isoflurane의 흐름을 끄고, 열 장벽에 새장을 들고있는 흡입 코 콘과 장소 동물을 제거하고 경보 및 활성되면 가정 케이지로 돌아갑니다. </li></ol> PN 세그먼트 3) 제거 <ol><li> 위에서 설명한 목적으로 수술 분야 (1.3) 면도하고 깨끗하고 동물을 마취. 열 장벽에 동물을 배치합니다. </li><li> 상처 클립과 별도의 이전 피부 절개를 제거합니다. vastus lateralis을 폭로 표면 근육의 봉합을 통해 절단이 근육에 치료를 통해 했네요. </li><li> tibial 신경의 끝부분을 잘라 용기에서 봉합사를 제거하는 봉합 라인을 추적. tibial 신경의 15mm 길이의 epineurium을 해부하다이 말초 최종 잘리는 좋은 집게를 사용하십시오. 무균 행크스 밸런스드 소금 솔루션에 신경 세그먼트 및 담가를 제거합니다. </li><li> 이 경우 heterologous 그래프트 실험 Euthasol의 intraperitoneal 주사하여 동물을 안락사. 이것은 아래에서 설명하는 autologous 이식 실험, 다리의 근육 및 2.6에서 설명한대로 피부가 닫혀) 및 경추 척수 부상 준비 동물,있다면. </li></ol> 4) 자궁암의 hemisection 손상 및 이식 1 일 <ol><li> 동물을 마취, 면도하고 inten을 청소위에서 설명한대로 됐나요 외과 분야 (1.3). 열 장벽에 동물을 배치합니다. (1.4) 이상으로 항생제와 진통제를 관리할 수 있습니다. </li><li> 뒤통수 노치와 유수 T2 등의 척추 과정을 찾아 절개 이러한 외부 명소 사이의 전체 길이를 확인합니다. 표면 trapezius 근육의 정중선을 통해 잘라 기본 경추 rhomboideus의 근육을 구분합니다. 확장기를 삽입하여 간격 근육을 유지. </li><li> 깊은 supraspinal 근육은 척추 등의 프로세스 C4, C5와 C6에서 절단해야합니다. 사용 rongeurs는 전체 오른쪽과 척수의 왼쪽의 중간 부분을 폭로 C5의 일부 laminectomy을 수행합니다. 척수의 정중선의 랜드마크로 유명 등의 정맥을 사용합니다. </li><li> 피어스 두라 메이터에 마이크로 메스 블레이드 또는 30 게이지 바늘을 사용하여 C5 척수를 통해 절개를 확장합니다. 기본 거미막와 피아 메이터의 작은 절개를합니다. </li><li> 가져온 유리 마이크로 정맥은 조직을 분리 및 제거를 용이하게하기 위해 부드러운 압력과 마이크로 - 집게를 사용하여 척수의 지느러미, 오른쪽을 대기음 시작합니다. 지느러미에서 복부와 정중선에서 측면 meninges에 완료 2mm 긴 구멍을 만들 척수의 중간 부분과 복부를 계속 진행합니다. </li><li> hemostasis를 달성하기 위해 캐비​​티에 호수 - 절어 겔 거품을 놓습니다. </li><li> 행크스 솔루션에서 말초 신경의 세그먼트를 제거합니다. 부드럽게 근위 신경 세그먼트의 3mm과에서 epineurium 껍질 hemisection의 병변 캐비티의 주동이의 벽에이 끝을 appose. 두라 메이터에 epineurium 통해 10-0 봉합사와 세그먼트를 확보 후 두라는 이식의 이식을 통해 최종 마감 봉합. </li><li> 샌드위치 나중 지점에서 보호하고 쉽게 격리에 대한 silastic 멤브레인 (Biobrane)의 2 조각 사이의 이식. C6, C7과 T1 척추 프로세스와 함께 넣습니다. 척수 혹은 근육 조직에 말초 신경 끝을 appose하지 마십시오. </li><li> 4-0 봉합사 및 부상 클립과 밀접한 피부 절개와 레이어에 가까운 근육. </li><li> 이 경고하고 활성화되면 가정 케이지에 열 장벽과 수익 새장을 들고에 넣어 동물. </li></ol> 일 21 <ol start="11"><li> 위에서 설명한 목적으로 수술 분야 (1.3) 면도하고 깨끗하고 동물을 마취. 열 장벽에 동물을 놓고 (1.4) 이상으로 항생제와 진통제를 관리할 수 있습니다. 신경 이식을 둘러싼 silastic 멤브레인을 폭로 표면 봉합으로 잘라. 좋은 포셉 및 스프링 가위와 수술 분야에서 반영을 사용하여 silastic 막에서 신경의 조심스럽게 무료로 길이. </li><li> C7 척추 과정의 오른쪽에있는 부분 laminectomy를 수행합니다. 피어스 위와 같이 meninges (4.4)와 열망에 의해 C7 척수에서 1mm 3 등의 쿼드랑 병변 충치를 준비합니다. hemostasis를 달성하고 chondroitinase ABC로 적셔 겔 거품과 함께 대체하는 호수 - 절어 겔 거품을 사용합니다. 5 분마다 신선한 chondroitinase - 절어 겔 거품을 제공하는 15 분 동안 병변 사이트를 처리합니다. </li><li> Silastic 막과 신경 이식의 외부 길이를 커버. 4-0 봉합하고 상처에 클립으로 피부 절개와 피상적인 근육을 닫습니다. 이 경고하고 활성화되면 가정 케이지에 열 장벽과 수익 새장을 들고에 넣어 동물. </li></ol> 일 23 <ol start="14"><li> 위에서 설명한 목적으로 수술 분야 (1.3) 면도하고 깨끗하고 동물을 마취. 열 장벽에 동물을 놓고 (1.4) 이상으로 항생제와 진통제를 관리할 수 있습니다. 신경 이식을 둘러싼 silastic 멤브레인을 폭로 표면 봉합으로 잘라. 그래프트 방해 아니라 C7 그래프트 사이트를 노출하고 척수 척수에 이식의 동격에 말초 약 1mm의 오른쪽에 chondroitinase ABC의 1μl를 microinject을 뽑아 유리 정맥과 해밀턴 주사기를 사용하지 마십시오. </li><li> 부드럽게 신경 세그먼트의 말초 2mm에서 epineurium 껍질과하면 C7의 병변 캐비티이 끝을 appose. 두라 메이터에 epineurium 통해 10-0 봉합사와 세그먼트를 고정합니다. </li><li> 4-0 봉합하고 상처에 클립으로 피부 절개와 피상적인 근육을 닫습니다. 이 경고하고 활성화되면 가정 케이지에 열 장벽과 수익 새장을 들고에 넣어 동물. </li></ol> 이식 및 말초 척수의 실천 가능성 5) Electrophysiological 녹음 <ol><li> 전기 활동이 PNG로 재생해야 axons을 통해 전달되었는지 확인하려면 우리는 먼저 노출 및 그래프트를 분리해야합니다. 특별한주의가 물리적으로 그래프트 손상을 방지하기 위해이 절차를 수행하는 동안 찍은 이것은 이식의 배치 후 Silastic 막의 사용이 중요 어디 있지해야합니다. 위에서 설명한 목적으로 수술 분야 (1.3) 면도하고 깨끗하고 동물을 마취. 플레이스 일열 장벽에서 전자 동물. </li><li> 피부를 열고 피상적인 근육을 분리 후, Silastic 멤브레인 스트립은 식별하고 조심스럽게 이식 무료로 해부하고 있습니다. </li><li> 사용 rongeurs 즉시 주동이의 및 PNG - 척수의 동격 사이트에 꼬리 지느러미 척추 프로세스를 제거합니다. 이 접근하는 동안 너무 그래프트를 방해하지 않도록 조심 해요. 두 수준에서 두라 메이터에 슬릿을 만듭니다. </li><li> C5 이식 - 척수의 동격 사이트에 약 1cm 주동이의 약 1mm의 깊이로 단일 와이어 (백금 - 이리듐 믹스) 병변에 ipsilateral 척수에 자극 전극을 삽입합니다. 양극성 전극 갈고리에 이식의 중심 부분을 조심스럽게 올려. 100μsec 기간과 10μA의 단일 자극 펄스를 제공하고 이식에 집중적인 물리 axons을 통해 여행을 실천 가능성이 있는지 확인합니다. </li><li> 갈고리 전극이 자극 전극되어 단일 와이어는 척수와 척수의 행동 잠재력을 기록하려고 시도하는 PNG의 동격에 말초 척수에 삽입되도록 연결과 전선의 위치를​​ 전환합니다. </li><li> 실험의 끝에 1 시간 총, 50Hz에서 100μsec 기간에 대한 1mA 자극의 기차를 제공합니다. 나중에 1 시간 동물을 안락사, P​​NG에서 재생 axons 활성화되었습니다 뉴런의 cFos의 immunocytochemical 검출을위한 4 % paraformaldehyde 및 프로세스 척수 조직과 perfuse. </li></ol> 6) 신경의 퇴행성 라벨 그것은 PNG와 척수에 다시 재생 axons의 anterograde 라벨링에 axons를 재생 <ol><li> electrophysiological 조치로 테스트하지 동물은 척수에 이식과 종료의 과정으로 성장 axons의 출처를 확인 할 수 있습니다. 위에서 설명한 목적으로 수술 분야 (1.3) 면도하고 깨끗하고 동물을 마취. 열 장벽에 동물을 플레이스 이상 6.1에서 설명한대로 PNG 노출. </li><li> 그 중간 지점에서 이식을 통해 절단 및 이식편의 컷 끝에서 epineurium 다시 제거하기 위해서 마이크로 가위를 사용합니다. 상처가 서로 멀리까지와 parafilm 별도의 시트에 각각 누워 반영합니다. </li><li> PNG로 축삭 공헌을 레이블 뉴런에 근위 상처 끝에 트루 블루로 적셔 젤 폼의 플레짓를 놓습니다. 척수에 이식 뒤에서 확장 레이블 axons에 말초 상처 끝에 biotinylated dextran 아민 (BDA)에 배어 젤 폼의 플레짓를 놓습니다. </li><li> 3 - 4D 나중에 동물을 안락사, 4 % paraformaldehyde과 공정 두뇌와 트루 블루 라벨 뉴런 또는 표시 axons에 대한 BDA의 histochemistry에 대한 형광 현미경을위한 척수 조직 섹션 perfuse. </li></ol> 7) 흉부 전체 절개의 상처와 이식 이것은 위의 자궁 hemisection 부상 모델에 대한 대안적인 접근 방식을 제공합니다. 여기보다 심한, 양자 부상이 생성되고 말초 신경의 세그먼트는 스팬과 부상 척수의 주동이의와 꼬리 스텀스에 병변 구멍에 넣습니다. 1 일 <ol><li> 위에서 설명한 목적으로 수술 분야 (1.3) 면도하고 깨끗하고 동물을 마취. 열 장벽에 동물을 배치합니다. (1.4) 이상으로 항생제와 진통제를 관리할 수 있습니다. </li><li> 마지막 리브의 삽입 시점에서 T12 척추 수준을 식별합니다. 척추 프로세스 T11, T10 및 T9을 통해 주동이의이 시점에서 피부 절개를합니다. 이 세 가지 프로세스에 연결된 supraspinal 근육을 통해 표면 근막을 통해 잘라. </li><li> T10 척추 프로세스의 완료 laminectomy (overlying T12 척수 세그먼트)을 수행합니다. 피어스 두라 메이터에 마이크로 메스 블레이드 또는 30 게이지 바늘을 사용하여 T12 척수를 통해 절개를 확장합니다. 기본 거미막와 피아 메이터의 작은 절개를합니다. </li><li> 가져온 유리 마이크로 정맥은 조직을 분리 및 제거를 용이하게하기 위해 부드러운 압력과 마이크로 - 집게를 사용하여, 양자 T12 척수를 대기음 시작합니다. 복부와 측면 meninges 사이에 완료하는 등 지느러미는 3mm 긴 구멍을 만들 척수의 중간 부분과 복부를 계속 진행합니다. </li><li> hemostasis를 달성하고 chondroitinase ABC로 적셔 겔 거품과 함께 대체하는 호수 - 절어 겔 거품을 사용합니다. 5 분마다 신선한 chondroitinase - 절어 겔 거품을 제공하는 15 분 동안 병변 사이트를 처리합니다. </li><li> 행크의 솔루션에서 주변 신경의 세그먼트를 제거합니다. 부드럽게 신경 세그먼트의 근위 4mm에서 epineurium을 반영하고 snugly 척수의 한쪽의 주동이의와 꼬리 스텀스 사이에 맞게 길이를 잘라. 척수의 반대쪽에 apposed 처음으로 이식할 세그먼트와 함께 두 번째 세그먼트를 놓으십시오. 봉합사 두라는 이식 이식을 통해 폐쇄와 작은로 두라 커버silastic 막의 조각. </li><li> 4-0 봉합사 및 부상 클립과 밀접한 피부 절개와 레이어에 가까운 근육. </li><li> 이 경고하고 활성화되면 가정 케이지에 열 장벽과 수익 새장을 들고에 넣어 동물. </li></ol> 3 일 <ol start="9"><li> 위에서 설명한 목적으로 수술 분야 (1.3) 면도하고 깨끗하고 동물을 마취. 열 장벽에 동물을 놓고 (1.4) 이상으로 항생제와 진통제를 관리할 수 있습니다. 그래프트 사이트를 overlying silastic 멤브레인을 폭로 표면 봉합으로 잘라. 그래프트 방해 오히려 이식에 꼬리 척수를 노출하고 척수 척수에 이식의 동격에 말초 약 1mm의 각 측면에 chondroitinase ABC의 1μl를 microinject을 뽑아 유리 정맥과 해밀턴 주사기를 사용하지 마십시오. </li><li> 4-0 봉합하고 상처에 클립으로 피부 절개와 피상적인 근육을 닫습니다. 이 경고하고 활성화되면 가정 케이지에 열 장벽과 수익 새장을 들고에 넣어 동물. electrophysiological 자극 및 기록 이상 추적으로 5 설명 라벨 부착) 6)을 수행합니다. </li></ol> 8) 대표 결과 이 절차를 최적화하면 말초 신경 세그먼트는 밀접하게 호스트 척수와 통합됩니다. 오름차순과 척골 axons을 내림차순 것은 이식편을 입력 이식편의 길이로 비교적 직선 평행의 성장과 하루에 약 1 mm의 속도로 이식의 말초 끝에 연장됩니다. chondroitinase가 주위 반흔 조직의 억제 proteoglycans를 제거하기 위해 사용되었는지 말초 끝에 도달했을 때, axons은 인접한 척수를 관통합니다. 기능성 연결은 이식 이내 axons의 자극에 척수의 신경에 의해 반응의 electrophysiological와 immunocytochemical 검출에 의해 결정됩니다. 기능 회복에 대한 해부 학적 상관 관계는 척수에 다시 신경 이식 넘어 확장이 axons의 수와 길이를 추적하여 부과됩니다.

<ol><li>Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+the+potential+for+chronically+injured+neurons+to+regenerate+axons+into+intraspinal+peripheral+nerve+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Demonstration of the potential for chronically injured neurons to regenerate axons into intraspinal peripheral nerve grafts.</a> Exp. Neurol. 113, 1-9 (1991).</li>
<li>Ye, J. H., Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+the+chronically+injured+spinal+cord+with+neurotrophic+factors+can+promote+axonal+regeneration+from+supraspinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment of the chronically injured spinal cord with neurotrophic factors can promote axonal regeneration from supraspinal neurons.</a> Exp. Neurol. 143, 70-81 (1997).</li>
<li>Houle, J. D., Tom, V., Mayes, D., Wagoner, G., Phillips, N., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+an+autologous+peripheral+nerve+bridge+and+matrix+modification+by+chondroitinase+allows+robust+functional+regeneration+across+a+hemisection+lesion+of+the+adult+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combining an autologous peripheral nerve bridge and matrix modification by chondroitinase allows robust functional regeneration across a hemisection lesion of the adult rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 26, 7405-7415 (2006).</li>
<li>Tom, V., Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+microinjection+of+chondroitinase+ABC+following+injury+promotes+axonal+regeneration+out+of+a+peripheral+nerve+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intraspinal microinjection of chondroitinase ABC following injury promotes axonal regeneration out of a peripheral nerve graft.</a> Exp. Neurol. 211, 315-319 (2008).</li>
</ol>

<ol><li> 실험의 재현성을 위해 그것은 척수 손상의 수준이 동물에서 동물로 일관하는 것이 중요합니다. 따라서 laminectomy에 해당하는 척추 프로세스를 식별하는 것이 중요 그것을 것입니다. 우리가이 연구에 대한 hemisection이나 절개의 병변 모델을 사용하기 때문에 병변의 크기 또는 특정 척추 책자가 부상하거나 목숨이 붙어 있는지 아무런 모호함이 없습니다. </li><li> 그것이 axons의 안쪽으로의 성장을 지원하는 여러 neurotrophic 요소를 만들어 Schwann 세포를 활성화하기 때문에 주변 axons이 시작의 소화 성장 재생의 axons을위한 공간을 제공하고 있기 때문에 주변 신경을 이식하기 전에 미리 퇴화한 것이 필요합니다. </li><li> 컷의 초기 배치는 척수 조직에 대한 이식의 끝나에 밖 그래프트의 축삭의 성장을 최적화하는 (그래프트를 손상시키지 않고) 단단히하여야한다. 주변 신경 척수에 이식하고 봉합과 이식을 확보 직접 동격이 중요합니다. </li><li> 그래프트 사이트 주변의 세포외 기질을 수정 chondroitinase를 ...

<table><tbody><tr><td>10-0 실크 봉합사</td><td>ArosSurgical</td><td>T5A10N10</td><td></td></tr><tr><td>6-0 실크 봉합사</td><td>McKesson</td><td>2693</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>McKesson</td><td>483549</td><td></td></tr><tr><td>cFos 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7799</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 덱스트란 아민</td><td>Invitrogen</td><td>D7135</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀 (.3mg/ml)</td><td>McKesson</td><td>12496075701</td><td></td></tr><tr><td>콘드로이티나제 ABC</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>100332-1A</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol</td><td>웹스터 수의학(Webster Veterinary)</td><td>07-805-9296</td><td></td></tr><tr><td>Hanks 균형염 용액</td><td>Cellgro</td><td>21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>이소플루레인</td><td>Henry Schein</td><td>209-1966</td><td></td></tr><tr><td>미셸 상처 클립</td><td>Fine Science Tools</td><td>12040-02</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrace 키트</td><td>Invitrogen</td><td>N7167</td><td></td></tr><tr><td>트루 블루(True Blue)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5891</td><td></td></tr><tr><td>제노다인</td><td>웹스터 수의학(Webster Veterinary)</td><td>92201</td><td></td></tr><tr><td>고온 비드 멸균기</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>강제 운동 휠</td><td>Lafayette Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TreadScan 시스템</td><td>클레버 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>무한 지평 충격 장치</td><td>정밀 시스템 및 계측 장비</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자기 자극 장치</td><td>Magstim</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

부상당한 쥐 척수를 복구하는 주변 신경 이식과 매트릭스 변조를 결합

Combining Peripheral Nerve Grafting and Matrix Modulation to Repair the Injured Rat Spinal Cord

척수 (SCI)에 충격 부상은 뉴런, 모터 및 감각 신경 섬유 (축삭) 경로와 두뇌와의 통신 장애의 장애의 죽음을 초래합니다. 우리 연구의 목표 중 하나는 병변 사이트를 통해 연결을 복원하는 축삭 재생을 촉진하는 것입니다. 이를 위해 우리는 좌골 신경의 세그먼트가 하나 척수의 손상까지 사이에 직접 배치하거나 병변에 걸쳐 다리를 양식하는 데 사용되는 기술을 접목 주변 신경 (PN)을 개발하였습니다. 다른 신경 조직의 이식에 비해이 방법 몇 가지 장점이 있습니다, 재생의 axons은 특정 타겟 지역으로 이동 수 있으며, 재생 axons의 숫자 및 소스 쉽게 기술을 추적에 의해 결정됩니다, 그라 프트는 측정 electrophysiological 실험에 사용할 수 기능 회복은 이식에 axons과 관련된, 그리고 이식 거부의 가능성을 줄이기 위해 autologous 용기를 사용할 수 있습니다. 우리가 실험실에서 우리는 유사한 결과를 모두 autologous (기증자와 수신자가 같은 동물 아르)와 heterologous (기증자와받는 사람이 다른 동물) 이식을 수행했습니다. 이 접근법은 급성과 만성 모두 부상 상황에서 성공적으로 사용되었습니다. PN 그래프트의 말초 끝에 도달 재생 axons은 종종 척수로 다시 연장하지 않는, 그래서 우리는 SCI의 주변 흉터 조직과 관련된 억제 분자를 저하하는 chondroitinase의 microinjections을 사용합니다. 동시에 우리는 외인성 성장과 영양 분자를 제공하면 척수에 이상 거리 axonal regrowth을 장려하는 것으로 나타났습니다. 몇 개월 이식 후 우리는 척수 부상 동물의 기능의 회복을 평가하기 위해 해부 학적 행동 및 electrophysiological 테스트의 다양한 수행합니다. 이 실험 방식 (마우스, 쥐, 고양이) 부상의 다른 수준에서 서로 다른 종에 여러 척수 손상 모델에 성공적으로 사용되었습니다. 중요한 것은, 주변 신경을 접목 방법은 급성과 만성 부상 뉴런의 재생을 증진 효과가있다.

척수 충격 부상은 두뇌와 통신을 방해. 잃어버린 연결을 복원하려면 우리는 장거리 성장을 촉진 억제 분자를 제거하는 neurotrophic 요인과 매트릭스 - modulating 효소와 함께 재생 섬유의 하층을 제공하는 주변 신경 이식을 활용한다.

척수 손상(SCI)은 뉴런의 사멸, 운동 및 감각 신경 섬유(축삭) 경로의 단절, 그리고 ...의 중단을 유발합니다.

말초 신경을 척수 손상 부위에 이식하기 위한 준비는 이식 7~10일 전에 PNG의 사전 퇴행을 유도하는 것으로 시작합니다. 공여 쥐의 경골 신경 분지를 절단합니다. 흡입법을 통해 경추 5번 또는 C5 부위의 반절제를 수행합니다.공여 쥐로부터 PNG를 적출하여 병변 공동의 rostral wall에 맞닿게 배치하고, aurum을 경막에 봉합하여 고정합니다. 3주 후, C7 부위에 dorsal quadrant 병변을 만든 다음, C-H-A-B-C로 포화시킨 gel foam을 공동 내에 15분간 배치하여 glial scar의 proteoglycans를 분해합니다. 2일 후, 병변 부위 인접 부위에 C-H-A-B-C를 미세 주입하고 PNG의 원위단을 dorsal quadrant 병변에 맞닿게 배치합니다.안녕하세요, 저는 Drexel University College of Medicine의 척수 손상 연구 센터 소장인 John Hula입니다. 저는 hula lab의 Veronica Tom 박사이며, 저는 Martha mean입니다.Hula 연구실에서 알려드립니다. 오늘은 성체 쥐의 손상된 척수 내에 말초 신경 분절을 이식하는 절차를 시연하겠습니다. 저희 연구실에서는 척수 손상 후의 축삭 재생 및 기능 회복을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작하겠습니다. 미세 수술을 준비하기 위해 수술 스테이션을 소독하고 모든 수술 기구를 오토클레이브로 멸균하십시오. 열 차단막과 미세 지혈용 2 mm³ 미만의 작은 젤 폼 조각들을 준비하십시오.면봉, 거즈 패드 및 수술 도구를 준비합니다. 발가락 꼬집기 테스트로 동물이 완전히 마취되었음을 확인한 후, 마취된 쥐를 준비대 위에 놓습니다. 예정된 수술 부위의 털을 넓게 깎아내고, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 무균 세척 기술에 따라 수술 부위를 세척합니다.다음으로 쥐를 열 차단막 위에 놓고 흡입 콘으로 코와 입을 덮은 후, isof fluorine 농도를 3%로, 유량을 분당 0.2 liters로 낮춥니다. 적절한 용량의 항생제 ampicillin을 피하 주사하고 진통제 buprenorphine을 근육 주사로 투여합니다. 말초 신경(PN)은 제거 7~10일 전에 절단하여 퇴행을 촉진시키는데, 이는 신선한 신경 표본보다 축삭 성장에 더 적합한 환경을 제공합니다.pn 절단을 시작하려면 동물을 옆으로 눕힙니다. 멸균 장갑으로 교체하고 수술 부위 주변에 멸균 수술포를 덮습니다. 대퇴골두에서 무릎까지 직선으로 절개하며, 대퇴골과 평행하게 약 3 mm 거리를 유지합니다. 피부 절개선과 동일한 선을 따라 표층 대퇴이두근을 절개하여 하부의 외측광근을 노출시킵니다.외측광근이 노출되면 가위를 사용하여 무릎 근처의 근육에 작은 절개를 넣고 이를 대퇴골두 방향으로 연장합니다. 리트랙터(retractor)를 사용하여 외측광근을 조심스럽게 분리하여, 대퇴골과 평행하게 주행하는 좌골신경의 경골신경 및 비골신경 분지가 보일 때까지 진행합니다. 다음으로, 좌골신경의 주신경간이 확인될 때까지 이 신경 분지들을 대퇴골두 방향으로 따라갑니다.좌골 신경의 분지 바로 아래에서 미세 핀셋을 사용하여 경골 신경 분지를 둘러싸고 있는 결합 조직 또는 신경외막을 조심스럽게 분리합니다. 이것이 더 큰 분지입니다. 경골 신경 분지가 분리되면, 6-0 실크 결찰사를 주변에 넣고 조입니다.마이크로 가위를 사용하여 결찰 부위까지의 신경 원위부를 절단합니다. 봉합사를 외측광근(vastus lateralis muscle)에 통과시킨 후 매듭을 지어 묶습니다. 이렇게 하면 절단된 경골신경(tibial nerve) 끝부분을 쉽게 찾을 수 있는 표식 역할을 하게 됩니다.신경을 채취합니다. 이후 외측광근을 6-0 실크 봉합사로 봉합합니다. 그다음 상완이두근을 6-0 실크 봉합사로 봉합합니다.마지막으로, Michelle 상처 클립으로 피부를 봉합합니다. isof fluorine의 흐름을 차단하고 흡입용 노즈콘을 제거합니다. 동물을 열 차단제가 깔린 유지 케이지에 넣습니다.동물을 홈 케이지로 돌려보냅니다. 7~10일 후 동물이 각성하여 활발해지면 PN 분절을 채취할 준비가 된 것입니다. 이식을 시작하려면 마취된 동물을 열 차단막 위에 놓으십시오.동물이 완전히 마취되었는지 확인한 후, 상처 클립을 제거하고 피부 절개 부위를 벌립니다. 피부를 쉽게 벌려 오염을 방지할 수 있으므로 해당 부위를 미리 제모할 필요는 없을 수 있습니다. 털을 절개할 필요가 없으므로, 표층 근육의 봉합선을 절개하여 외측광근을 노출시킨 다음 이 근육의 봉합선을 절개합니다.봉합선을 따라 경골 신경의 절단단까지 추적하여 신경에서 봉합사를 제거하십시오. 미세 핀셋을 사용하여 경골 신경 15 millimeter 길이의 신경외막을 박리하고, 이 원위단을 절단하십시오. 절단된 신경 분절을 제거하여 멸균된 Hank's balanced salt solution에 담그십시오.이제 다음 단계인 척수 손상 유도를 통해 PN 이식을 준비하겠습니다. 이식은 자가 이식 또는 동종 이식으로 진행될 수 있습니다. 마취된 쥐를 열 차단막 위에 놓고, 이전 섹션에서 설명한 대로 항생제와 진통제를 투여한 후 HEMI 절단 척수 손상을 유도합니다. 먼저 후두와와 돌출된 T2 등쪽 척추 돌기를 찾으십시오.이러한 외부 지표 사이의 전체 길이에 따라 절개합니다. 표층 승모근의 정중선을 절개하고 그 아래의 경추 주변 근육들을 분리합니다. 근육들이 벌어진 상태를 유지하도록 리트랙터를 삽입합니다.심부 척수상근을 C4, C5, C6의 배측 척추 돌기에서 절단해야 합니다. R-쥬어(R jurors)를 사용하여 C5의 부분 엽절제술을 시행함으로써 척수의 우측 전체와 좌측 내측 부분을 노출시킵니다. 척수 중앙선의 기준점으로 두드러진 배측 정맥을 활용하십시오.다음으로, 마이크로 메스 날을 사용하여 경막을 뚫고 C5 척수까지 절개선을 확장합니다. 당겨진 유리 마이크로 캐뉼라를 사용하여 아래의 지주막하 공간과 연질막에 작은 절개를 가합니다. 조직을 분리하고 제거를 용이하게 하기 위해 부드러운 압력과 마이크로 포셉을 사용하여 척수의 우측 배측을 흡입하기 시작합니다.척수의 중간 및 복측 부분으로 계속 진행하여, 등측에서 복측까지 그리고 정중선에서 외측 뇌수막까지 완전히 관통하는 2 mm 길이의 공동을 생성합니다. HEMI 구역 병변 공동에 식염수에 적신 겔 폼(gel foam)을 넣습니다. 지혈을 위해, 이전에 수확하여 Hank 용액에 보관해 두었던 말초 신경 분절을 꺼냅니다.신경 분절의 근위부 3mm 지점에서 신경외막(epineurium)을 부드럽게 잡고, 이 끝단을 HEMI 절단 병변 공동의 吻側(rostral) 벽에 맞닿게 합니다. 신경외막에서 경막(dura mater)으로 10-0 봉합사를 이용해 분절을 고정합니다. 그다음, 이식된 그라프트 끝단 위로 경막을 봉합하여 닫고, 두 조각의 셀라스틱(celastick) 탄성 막 사이에 그라프트를 끼워 고정합니다.이식물을 C6, C7 및 T1 척추 돌기 옆에 배치하십시오. 신경의 원위단이 척수나 근육 조직에 맞닿지 않도록 하십시오. 4-0 봉합사로 근육을 층별로 봉합하고, 상처 클립으로 피부 절개 부위를 폐쇄하십시오.마지막으로, 동물을 열 차단 장치가 있는 유지 케이지에 넣은 후 원래의 케이지로 되돌립니다. 동물이 깨어나 활동하기 시작하면, PN 이식편의 원위단에 도달한 재생 축삭이 척수 내로 다시 뻗어 나가지 못하는 경우가 많습니다. 따라서 손상 부위 주변의 흉터 조직을 분해하기 위해 콘드로이틴 ACE를 미세 주입합니다.이 절차는 PN 이식 21일 후에 수행하며, 우선 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 그런 다음 상처 클립을 제거하고 이전에 설명한 대로 항생제와 진통제를 투여합니다. 미세 핀셋과 스프링 가위를 사용하여 표면 봉합사를 절개하고 신경 이식물을 둘러싸고 있는 탄성막을 노출시킵니다.탄성 막에서 신경의 길이를 조심스럽게 분리합니다. 신경을 수술 부위에서 젖혀둡니다. C7 척추 돌기의 우측에서 부분 척추궁 절제술을 시행합니다.마이크로 메스 날로 뇌막을 뚫고 흡입을 통해 C7 척수 부위에 1mm³ 크기의 등쪽 사분면 병변 공동을 형성합니다. 지혈을 위해 식염수에 적신 겔 폼을 병변 공동에 넣습니다. 그 후, 겔 폼을 콘드로이틴 나제(chondroitin nace)에 적신 것으로 교체합니다.A BC. 병변 부위를 15분 동안 처리하며, 5분마다 chondroitin이 함침된 새로운 겔 폼을 제공합니다. 신경 이식편의 외부 길이를 scholastic membrane으로 덮습니다. 표층 근육은 4-0 봉합사로, 피부 절개 부위는 wound clip으로 봉합합니다.동물을 열 차단막이 있는 유지 케이지에 넣고, 동물이 의식을 회복하고 활동적으로 움직이면 원래의 케이지로 돌려보냅니다. 이틀 후, 즉 PN 이식 23일 후에 동물에 대해 다시 수술을 실시하여 척수에 chondroitin NA를 미세 주입합니다. 이전과 마찬가지로 마취된 동물로부터 상처 클립을 제거하고 항생제와 진통제를 투여합니다.표면 봉합사를 절개하여 신경 이식물을 둘러싸고 있는 탄성 막을 노출시킵니다. 이식물을 건드리지 않고 C7 이식 부위를 노출합니다. 그런 다음 유리 캐뉼라가 장착된 Hamilton 주사기를 사용하여, 이식물과 척수가 접합된 지점에서 말단 방향으로 약 1mm 떨어진 척수의 우측에 1µL의 chondroitin ace A BC를 미세 주입합니다.신경 분절의 원위부 2mm에서 EUR을 조심스럽게 벗겨내고, 이 끝단을 C7 손상 부위의 공동에 맞닿게 합니다. 신경외막을 통해 10-0 봉합사로 해당 분절을 경막에 고정합니다. 표층 근육은 4-0 봉합사로 봉합하고 피부 절개 부위는 상처 클립으로 폐쇄합니다.동물을 열 차단제가 깔린 유지 케이지에 넣고, 의식이 회복되어 활동적으로 움직이면 원래의 케이지로 돌려보냅니다. 이 절차가 최적화되면 말초 신경 분절이 호스트 척수와 밀접하게 통합되어, 이식편으로 재생되는 척수 축삭을 시각화할 수 있게 됩니다. 우리는 상행 및 하행 경로에 대해 biotinylated dextrin amine 또는 BDA를 사용하여 이식편을 확산 충전하였습니다.척수 축삭은 일반적으로 이식물로 진입하여 이식물의 길이에 평행하게 비교적 직선으로 성장하며, 하루에 약 1mm의 속도로 이식물의 원위단까지 뻗어 나갑니다. 말초 신경 축삭은 인접한 척수로 침투합니다. 원위단에 도달했을 때 주변 흉터 조직에서 억제성 프로테오글리칸을 제거하기 위해 chondroitin NACE를 사용한 경우, vehicle로 처리한 대조군에서는 처리 후 숙주 조직으로 뻗어 나가는 말초 신경 축삭이 매우 적습니다.하지만 원위부 인터페이스를 콘드로이틴으로 처리한 경우, 훨씬 더 많은 수의 축삭이 이식물에서 나와 척수를 재지배합니다. 동물당 15~20개의 절편 중 축삭 성장이 관찰된 이 하나의 대표 절편에서 보여주는 것과 같이, 이 막대그래프는 콘드로이틴 처리 후 축삭 성장이 유의미하게 증가했음을 보여줍니다. 이식물 내 축삭에 전기 자극을 주어 척수 신경세포에서 시냅스 마커를 면역화학적으로 검출함으로써, 이식된 이식물과 호스트 척수 사이의 기능적 연결성을 평가할 수 있습니다.원위부 접합 부위를 포함하는 이 척수 영역을 비오틴화 덱스트린 아민(녹색)과 시냅스 마커인 시냅신(적색)으로 면역세포화학 염색하였습니다. 화살표는 마커의 공국소화가 일어난 영역을 나타내며, 이는 이식편에서 재생된 일부 섬유가 기능적인 시냅스 접촉을 형성했음을 보여줍니다. 이식편과 척수 뉴런 간의 기능적 연결성은 CFOs 발현 분석을 통해 또한 입증되었습니다. 원위부 인터페이스 너머의 숙주 뉴런을 시냅스 자극한 후, 이 시냅스 간 활성 마커는 이식 부위와 같은 쪽(ipsilateral) 조직에서 많은 CFOs 양성 뉴런으로 확인될 수 있으며, 고배율에서 관찰하면 이식 부위의 반대쪽(contralateral) 조직에서는 CFOs 양성 뉴런이 거의 관찰되지 않습니다.지금까지 척수 손상 후 재생을 촉진하기 위해 말초 신경 이식물을 이식하기 전, 척수 손상 부위를 준비하는 방법을 살펴보았습니다. 이 시술을 수행할 때는 이식 전 충분한 신경 길이를 확보하는 것과 이식물을 척수 손상 부위에 밀착시켜 배치하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 설명을 마칩니다.시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

다리의 움직임과 감각을 조절하는 노출된 온전한 오른쪽 좌골 신경이 있는 마취된 쥐를 예로 들어 보겠습니다.신경 분절을 절제하여 틈을 만들고 신경 축삭을 절단하고 신호 전달을 방해합니다.절단된 원위 축삭이 악화되어 특수한 신경 복구 또는 슈완 세포가 분리됩니다.마이크로채널이 있는 부드러운 튜브인 생체 공학 전도성 신경 스캐폴드를 절단된 양쪽 끝에서 신경의 외층인 신경외막에 봉합합니다.신경 말단 근처에 쌍을 이루는 전극을 이식하여 피부 아래의 와이어를 목 뒤쪽으로 통과시킵니다.지속적인 전기 자극을 가하여 스캐폴드에 부드러운 펄스를 전달합니다.퇴행성 원위 말단의 슈완 세포는 스캐폴드로 이동하여 마이크로채널을 따라 정렬됩니다.이 세포는 근위부에서 축삭 확장을 자극하는 성장 인자를 방출합니다.축삭이 확장됨에 따라 슈완 세포는 지질이 풍부한 미엘린 막으로 축삭을 감싸 신호 전달을 복원합니다.이것은 신경 복구를 위한 스캐폴드와 전기 자극의 잠재력을 보여줍니다.

전기 자극과 결합된 생체 공학 전도성 스캐폴드를 사용한 신경 복구

출처: Zweckberger, K., et al. 실험적 경추 척수 손상에서 신경 전구 세포와 자가 조립 펩타이드의 시너지 사용.  J. Vis. 경험. (2015).이 프로토콜은 쥐 모델에서 척수 손상 복구를 위한 표적 주사 접근법을 보여줍니다. 여기에는 자가 조립 펩타이드(SAP)를 병변 코어에 전달하여 지지 스캐폴드를 만든 다음 병변 주위에 신경 전구 세포(NPC)를 주입하여 조직을 리모델링하는 작업이 포함됩니다.

쥐 모델에서 척수 복구를 위한 자가 조립 펩타이드 및 신경 전구체 세포 주입

출처: Svientek, SR, et al. 성체 쥐에서 복합 재생 말초 신경 인터페이스(C-RPNI)의 제작.  J. Vis. 경험. (2020).이 비디오는 말초 신경 손상의 쥐 모델에서 복합 재생 말초 신경 인터페이스(C-RPNI)의 외과적 구성을 보여줍니다. 이 절차에는 절개된 비골 신경을 근육 이식편에 부착하고 이를 진피 피부 이식편으로 오버레이하여 신경 재생을 촉진하는 과정이 포함됩니다. 시간이 지남에 따라 운동 및 감각 뉴런은 이식편 내에서 연결을 재확립하여 기능적 신경근 및 감각 구조의 형성을 가능하게 합니다.

신경 손상의 쥐 모델에서 복합 재생 말초 신경 인터페이스의 구성

성장 인자를 함유하는 피브린 매트릭스는 완전한 척수 절개 부위로 그라프 신경 줄기 세포를 유지하기 위해 사용되었다. 이식 세포가 완전히 병변 캐비티를 채우고 장거리 호스트 척수로 축삭을 확장 신경 세포를 포함한 여러 신경 세포 유형으로 분화.

중증 척수 손상 후 섬유소 및 성장 인자 칵테일 신경 줄기 세포의 생존 및 분화 촉진

자가조립 펩타이드(SAP)와 신경전구세포(NPC)를 성장 인자와 함께 사용하여 경추 척수 손상을 치료하는 것은 재생과 회복을 촉진하는 유망한 접근 방식입니다. 경추 SCI의 타박상/압박 동맥류 클립 랫 모델과 수액 주입 및 NPC 이식을 포함하는 복합 치료가 확립되었습니다.

실험 경추 척수 손상의 신경 전구체 세포 및 자기 조립 펩티드의 시너지 사용

심각한 척수 손상은 종종 조직 결함을 초래합니다. 급성 손상 후 및 완전한 척수 절개 후 5주 후에 기계적 마이크로 커넥터 시스템의 이식을 통해 쥐의 조직 적응, 재생 반응 및 기능 개선을 촉진하기 위해 이러한 격차를 성공적으로 메우기 위한 두 가지 가능성이 설명됩니다.

실험 전략은 급성 및 만성 병변 후 부상 척수에서 큰 조직의 차이를 극복하기

이 문서는 완전 한 transection 후 척수 젊고 아름 다운 여자와 채우기 Schwann 세포 (SCs)와 다리 하 고 격차에 걸쳐 축 삭 재생을 촉진 주사 지하실 멤브레인 매트릭스 사이 빈 도관을 삽입 하는 기법을 설명 합니다.

PVDF TrFE 도관 격차에 걸쳐 축 삭 재생을 촉진 하 Transected 쥐 척수 젊고 아름 다운 여자를 다리 안에 이식 Schwann 세포

다음 원고는 복합 재생 말초 신경 인터페이스(C-RPNI)라고 불리는 생물학적, 폐쇄 루프 신경 피드백 시스템을 개발하기 위한 새로운 방법을 설명합니다. 이 구조는 주변 신경과 통합하여 원심성 모터 신호를 증폭하는 동시에 구심성 감각 피드백을 제공하는 기능을 가지고 있습니다.

성인 쥐의 복합 재생 말초 신경 인터페이스 (C-RPNI)의 제조

이 원고는 근육 커프 재생 말초 신경 인터페이스 (MC-RPNI)라고하는 생물학적 말초 신경 인터페이스를 개발하기위한 혁신적인 방법을 제공합니다.  이 수술 구조는 관련 말초 신경의 운동 원심성 신호를 증폭하여 운동 의도의 정확한 감지와 외골격 장치의 잠재적 제어를 용이하게 할 수 있습니다.

온전한 말초 신경 신호의 증폭을 위한 근육 커프 재생 말초 신경 인터페이스

electrophysiologic 연구 신생아 마우스 척수의 고립의 데모.

척수 전기 생리학

배우세요 쥐 척수 손상 복구를 위한 주변 신경 이식술과 매트릭스 변조 효소 활용법을. 신경 재생 촉진 및 기능 회복 연구에 활용되는 이 기법은 재생 의학 발전에 기여합니다.

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