체외에서 피부 자극 시험 (SIT)는 인간 표피 (RHE) 모델 재구성

표피는 Matt Tech Corporation에서 개발한 인간 표피의 체외 모델을 재구성하여 파생된 정상적인 인간 세포입니다. EC VM의 검증된 표피 피부 자극 테스트 프로토콜은 사람의 피부와 접촉하는 화장품, 원료 및 산업용 제제와 같은 제품에 대한 기존의 동물 기반 테스트를 대체합니다. 이 테스트는 피부 자극 키트와 표피 조직이 실험실에 도착하는 0일차에 시작되며, 이후 하룻밤 배양 후 분석 배지를 사전 컨디셔닝합니다.

첫째 날에는 표피 조직의 비정형 표면을 자극 화합물로 추정되는 물질로 1시간 동안 노출시킨 다음 둘째 날에는 세척 단계로 자극 물질을 제거합니다. 24시간 배양 후, 배양 삽입물을 새로운 배지에 넣고 기존 배지는 방출된 사이토카인 및 케모카인을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 조직은 MTT로 알려진 화합물과 반응하며, 이 화합물은 미토콘드리아 환원효소에 의해 마오즈와 소금을 위해 짙은 자주색으로 변환됩니다.

세포 생존력에 대한 판독값을 제공합니다. 표본에 짙은 자주색이 없다는 것은 생존력 감소의 지표입니다. 그리고 테스트 화합물에 대한 칼로리 메트릭 판독값이 음성 대조군의 50% 미만인 경우 테스트 화합물은 자극제로 분류될 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 Matt Corporation의 Helena Kava입니다. 오늘은 재건된 인간 피부 모델 표피를 이용한 체외 피부 자극 테스트 절차를 보여드리겠습니다. 이 절차는 규제 요구 사항에 따라 in vivo 신속한 피부 자극 테스트의 전체 또는 부분 대체로 사용할 수 있습니다.

이 새로운 체외 절차는 화학 물질 및 원료의 위험 식별 및 라벨링에 사용할 수 있습니다. 시작하겠습니다. 표피는 인간 표피 각질 세포 배양에서 파생되어 인간 표피의 3차원, 다층적이고 고도로 분화된 모델을 형성합니다.

조직은 유사분열 및 대사 활성을 가지고 있으며, 구조적으로나 생화학적으로 생체 내 조직을 밀접하게 모방하며, 인간 표피와 같이 재현성이 보장됩니다. 표피는 조직화된 기저층, 가시 및 과립층과 다층으로 구성된 각질층으로 구성됩니다. 후자는 생체 내에서 발견되는 것과 유사한 패턴으로 배열된 세포간 lam Miller 지질층을 포함합니다.

이러한 조직은 무혈청 배지에서 배양됩니다. 개별 세포 배양 삽입물에서 성장한 각 조직. 96웰 고처리량 형식을 포함한 다른 구성을 사용할 수 있습니다.

이 과정의 특정 지점에서 조직 생산을 완료하는 데 약 3주가 소요되며, 조직을 공기 액체 계면으로 올리고 모든 액체를 조직의 APIC 표면에서 제거합니다. N Fed의 조직은 mat tech의 독점적인 배양 배지와 접촉한 상태로 남아 있는 기저측 표면을 통해서만 공급됩니다. 일반적인 Epiderm 키트에는 각 조직에 24개의 조직, 자체 조직 배양 삽입물에 직경 9mm, 이 피부 자극 테스트를 수행하기에 충분한 분석 매체가 포함되어 있습니다.

24 개의 인서트는 표준 24 웰 플레이트의 각 웰에 하나의 조직이 주입 된 매체 주입 AGA 로즈 젤에 단단히 고정되어 있으며, 화학 물질 테스트에 착수하기 전에 섭씨 3-4 도의 온도에서 야간 캐리어에 의해 선적됩니다. EPIDERM 테스트 시스템을 사용하여 서면 프로토콜에 설명된 대로 분석에 사용된 모든 기기와 도구를 준비하고 멸균합니다. 면봉과 같은 재료의 일부는 멸균 포장으로 제공되거나 고압멸균되어야 합니다.

집게와 같은 기구를 살균하려면 70% 에탄올을 사용해야 하며 UV 또는 감마선 조사는 세척병을 살균하는 데 사용해야 합니다. 분석에 사용되는 두 가지 중요한 용액은 사전 준비된 DPBS와 5% SDS 용액이어야 합니다. 증류수에서는 약 2리터의 멸균 DPBS pH 7이 24개의 표피 조직이 포함된 하나의 키트와 함께 분석에 사용됩니다.

멸균 DPBS는 네거티브 컨트롤 및 세척 솔루션 역할을 합니다.5% SDS를 준비하고 포지티브 컨트롤로 사용해야 합니다. 피부 자극 분석은 EPIDERM EPI 200 SIT 키트를 받는 즉시 시작됩니다.

모든 키트 구성 요소의 무결성을 확인하고 모든 것이 있는 경우 우려 사항이 있는 경우 즉시 Mat Tech Corporation에 연락하여 다음 단계로 진행하십시오. 테스트를 시작하려면 키트와 함께 제공된 분석 매체가 실온에 도달하도록 합니다. 층류 후드를 예열하지 마십시오.

3개의 표피 조직 삽입물마다 1개의 멸균 6웰 플레이트를 준비하고 멸균 조건에서 각 웰에 0.9ml의 분석 배지를 피펫합니다. 멸균 공기 흐름 아래에서 표피 조직이 들어 있는 24웰 플레이트를 들어 있는 비닐 봉지를 엽니다. 멸균 거즈를 제거하고 멸균 집게를 사용하여 표피 조직이 들어 있는 각 삽입물을 조심스럽게 꺼냅니다.

멸균 거즈 또는 여과지에 부드럽게 두드려 인서트 바깥쪽에 부착된 잔여 아로를 제거합니다. 그런 다음 5분 이내에 빈 멸균 24웰 플레이트에 조직을 넣습니다. 삽입물을 육안으로 검사합니다.

표면의 조직 결함 및 과도한 수분을 기록합니다. 결함이 있는 조직이나 조직을 사용하지 마십시오. 액체로 완전히 덮여 있습니다.

최적의 조직 삽입. 표면이 건조해야 하며 표면에 분리, 고르지 않은 부품 또는 과도한 액체가 없어야 합니다. 그런 다음 멸균 면봉을 사용하여 조직 표면을 조심스럽게 말리십시오.

티슈를 직접 만지지 마십시오. 모세관 효과는 표면을 건조시킨 후 표면의 수분을 제거하기에 충분합니다. 조직 3개를 6개마다 맨 윗줄로 옮깁니다.

0.9ml 분석 매체로 미리 채워진 웰 플레이트. 인서트 아래에 갇힌 기포를 제거합니다. 다음으로, 삽입물이 들어 있는 6개의 웰 플레이트를 1시간 동안 인큐베이터에 넣습니다.

섭씨 37도에서 사전 배양. 첫 번째 사전 배양 기간이 끝나면 상부 웰의 인서트를 6개의 웰 플레이트의 하단 웰로 옮깁니다. 하룻밤 동안 사전 배양을 위해 플레이트를 인큐베이터에 다시 놓습니다.

나머지 분석 매체를 냉장고에 넣습니다. 하룻밤 전 배양 후 테스트 화학 물질을 표피 조직 삽입물에 적용할 수 있습니다. 화학 물질 노출 분석을 시작하기 전에 필요한 모든 장치, 용액 및 테스트 화학 물질을 실온에 놓습니다.

멸균 후드에서 모든 비멸균 재료 병을 후드 내부에 넣기 전에 70% 에탄올로 닦으십시오. 네거티브 컨트롤, 멸균 DPBS 포지티브 컨트롤 및 5% SDS 및 증류수는 후드와 실온에 넣어야 합니다. 큰 바이알은 폐기물을 위해 따로 보관해야 합니다.

1 6을 준비합니다. 웰당 0.9ml의 분석 매체로만 상단 행을 채워 각 화학 물질당 웰 플레이트. 각 플레이트에 조직 번호와 화학 이름을 표시합니다.

화학 물질에 대한 계획된 노출 약 5분 전. 인큐베이터에서 전처리 조직이 들어 있는 6개의 웰 플레이트를 제거합니다. 그런 다음 조직 표면을 시각적으로 평가합니다.

멸균 면 팁을 사용하여 수분을 제거하고 티슈 표면을 누르지 마십시오. 마지막으로 6개의 웰 플레이트 뚜껑에 테스트 재료 코드 또는 이름을 표시합니다. 한 번의 테스트 실행에서 각각 세 번씩 음성 및 양성 대조군을 포함하여 6개 이상의 화학 물질을 테스트하지 마십시오.

알려진 테스트 물질을 취급하기 위해 화학 도포와 1분의 세척 간격을 사용하십시오. 코드화되거나 알려지지 않은 샘플에 대해 물질 안전 데이터 시트 또는 MSDS에 제공된 지침을 따르십시오. 화학 안전 지침을 따르고 통풍이 잘 되는 캐비닛을 사용하십시오.

장갑을 착용하고 노출 후 테스트 화학 물질의 헹굼을 용이하게 하기 위해 1분 간격으로 화학 물질로 눈과 얼굴 투여 조직을 보호하고, 마지막 조직이 투여될 때까지 복용량 조직이 있는 플레이트를 층류 후드에 보관하십시오. 피펫을 지나는 전구는 조직 및 테스트 화합물을 조작하기 위해 절차 전반에 걸쳐 사용됩니다. 분젠 버너 화염은 액체 화학 물질을 테스트하기 위해 전구 모양의 팁을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

30마이크로리터의 액체 테스트 제품을 조직 바로 위에 분배하고 즉시 타이머를 시작하여 카운트업을 수행합니다. 타이머가 1분에 도달하면 두 번째 액체 화합물을 첨가하십시오. 테스트 화학 물질당 3개의 조직을 사용하고 1분 간격으로 각 화합물을 추가하는 것을 기억하십시오.

반고체를 테스트하려면 용적식 피펫을 사용하여 30마이크로리터를 조직 위에 직접 분배합니다. 필요한 경우 조직의 크기에 맞게 목초지 피펫으로 화학 물질을 펴십시오. 고체 물질을 적용하기 직전에 조직 표면을 25마이크로리터의 멸균 DPBS로 적셔 조직 표면과 테스트 화학 물질의 접촉을 개선하고 25밀리그램의 날카로운 도포 스푼에 미세한 분쇄 테스트 재료를 채웁니다.

조직 표면에 고체 테스트 화학 물질을 도포합니다. 필요한 경우 피펫을 지나는 멸균 전구를 사용하여 숟가락을 완전히 비우십시오. 표면에 고체가 퍼지는 것을 개선하기 위해 인서트를 부드럽게 흔듭니다.

티슈 크기와 일치하도록 파이펫을 지나는 전구를 사용할 수도 있습니다. 조직 표면을 누르지 마십시오. 마지막으로, 마지막 조직을 투여한 후 조직 삽입물에 DPBS를 음성 대조군으로 적용하고 5%SDS를 삼중으로 적용하고 35분 이상 또는 1분 동안 모든 플레이트를 가습된 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮깁니다.

이 인큐베이션 중에는 세탁 단계에 필요한 모든 재료를 후드에 넣으십시오. 35분 배양 후 인큐베이터에서 모든 플레이트를 제거합니다. 멸균 후드에 넣고 첫 번째 투여 조직에 대한 화학 물질 노출이 완료될 때까지 60분 동안 기다립니다.

다음으로 세탁 절차를 시작하십시오. 멸균 DPBS로 조직을 15회 헹굽니다. 잔류 테스트 재료를 제거하려면 조직 표면에서 1.5cm 떨어진 곳에 공급되는 DPBS의 일정한 흐름을 사용하여 조직 삽입물을 채우고 비우십시오.

DPBS 스트림이 너무 약하지 않거나 테스트 물질이 제거되지 않는지 확인하십시오. 나일론 메쉬로 4개의 티슈를 5회 세척하는 데 1분 간격을 유지하고 뾰족하고 날카로운 집게로 메쉬를 조심스럽게 제거하는 것을 잊지 마십시오. 그런 다음 10번째 15회 후에도 나머지 15회 세척을 계속하고 인서트를 완전히 담근 세척 병을 사용하여 헹구고 150ml의 DPBS를 사용하여 헹구고 흔들어 나머지 테스트 재료를 제거합니다.

마지막으로 티슈를 헹굽니다. 멸균 DPBS로 내부에서 한 번, 외부에서 한 번 삽입합니다. 삽입물을 부드럽게 흔들고 멸균 압지에 묻혀 조직에서 과도한 DPBS를 제거합니다.

다음으로, 블로트된 조직 삽입물을 이전에 분석 매체로 미리 채워진 새로운 6웰 플레이트로 옮깁니다. 다시 말하지만, 이러한 모든 단계는 노출된 각 노출에 대해 60분의 노출 시간을 유지하기 위해 1분 간격 내에 수행되어야 합니다. 마지막 조직을 헹군 후 멸균 면봉으로 각 조직의 표면을 조심스럽게 건조시킵니다.

표면에 미량의 화학 물질이 여전히 남아 있으면 멸균 면봉을 사용하여 제거해 보십시오. 다음 24시간 동안 인큐베이터에서 조직을 마지막으로 배양합니다. 배양 시작 시간을 Methods 문서 시트에 기록하십시오.

또한 분석법 문서 시트에 모든 다른 응용 프로그램을 기록하십시오. Mat Tech Corporation에서 제공하는 표준 작동 절차의 부록으로 후드의 플레이트를 이동합니다. 인서트를 0.9ml 매체로 미리 채워진 6웰 플레이트의 아래쪽 부분으로 옮깁니다.

상단 행에서 매체를 수집하고 사전 라벨링된 24웰 플레이트에 편집을 파이프로 삽입한 다음 섭씨 영하 20도에 놓습니다. 분석 전까지는, 배양 배지로 방출된 사이토카인 및/또는 케모카인의 분석은 선택 사항입니다. 화학 이름 또는 코드가 있는 MTT 분석 라벨 2 24 웰 플레이트에 대해 18시간에서 3시간 이상 또는 마이너스 3시간 동안 배양을 계속합니다.

MTT는 독성이 있으므로 반드시 보호 장갑을 착용하십시오. 취급 할 때. MTT 농축액을 해동하고 MTT 희석제로 희석하여 MTT 용액을 준비합니다.

MTT는 빛에 민감하므로 빛으로부터 보호하고 2-3시간 이내에 사용하십시오. MTT는 시간이 지남에 따라 분해되기 때문에 24웰 플레이트의 각 웰에서 300마이크로리터의 MTT 매체를 피펫으로 만듭니다. 이제 인큐베이터에서 6개의 웰 플레이트를 제거합니다.

압지에 인서트 바닥을 닦고 MTT가 미리 채워진 24웰 플레이트로 옮깁니다. 24웰 플레이트를 인큐베이터에 넣고 3시간 동안 배양합니다. MDS에서 MTT 배양 시작 시간을 기록하는 것을 잊지 마십시오 다른 MTT 판독값을 얻지 않도록 3시간의 배양 시간을 엄격히 준수하십시오 MTT 배양이 완료되면 독성 폐기물 트랩이 있는 흡입 펌프를 사용하여 모든 우물에서 MTT 매체를 부드럽게 흡입합니다.

우물을 DPBS로 다시 채우고 흡인합니다. 다시 말하지만, 이 헹굼을 두 번 더 반복하고 마지막 흡인 후 조직이 건조한지 확인하십시오. 세척 후 인서트를 새로운 24웰 플레이트로 옮기고 각 인서트에 2ml의 추출물 용액을 부드럽게 피펫팅하여 인서트를 담그십시오.

레벨은 인서트의 위쪽 가장자리 위로 올라가 양쪽의 조직을 완전히 덮습니다. 추출 및 증발을 억제하기 위해 히트 실러 또는 파라폼을 사용하여 24웰 플레이트를 밀봉합니다. 분석법 문서 시트에 추출 시작 시간을 기록하고 플레이트 셰이커에서 부드럽게 흔들면서 실온에서 최소 2시간 동안 추출합니다.추출 기간이 완료된 후 피펫을 지나는 주사 바늘 또는 전구로 삽입물을 뚫고 추출물이 삽입물이 채취된 웰로 흘러 들어가도록 합니다.

구멍이 뚫린 삽입물을 버리고 균질해질 때까지 웰의 용액을 위아래로 세 번 피펫팅합니다. 각 조직별로 120RPM으로 설정된 플레이트 셰이커도 사용할 수 있습니다. 파란색 포마와 용액의 200마이크로리터 부분 표본 2개를 96웰 평평한 바닥 마이크로 타이터 플레이트로 옮깁니다.

블랭크에 대한 이 비디오 프로토콜과 함께 제공되는 스프레드시트에 제공된 고정 플레이트 설계에 따라 복제본을 전송합니다. ISO 프로판올을 사용하여 광학 밀도 또는 OD를 판독하고 기준 필터를 사용하지 않고 570나노미터의 파장을 사용하여 96웰 플레이트 분광 광도계를 판독합니다. 결과 자동 계산을 위해 스프레드시트에 결과를 입력합니다.

함께 제공되는 프로토콜에 설명된 대로 테스트 화학 물질 간섭으로 인한 수정을 설명하면 테스트 화학 물질은 자극성으로 표시됩니다. 분광 광도 분석에 따라 조직 생존율 비율이 50% 이하인 경우 NC 조직의 OD five 70은 1 이상, 2.5 이하입니다. 그리고 음성 대조군 조직의 백분율로 표시되는 PC 조직의 평균 생존율은 20% 미만이며, 동일하게 처리된 3개의 리플리컨트의 개별 백분율 조직 변동성에서 계산된 SD는 18% 미만이며, 세포 생존율 값을 생성하는 화합물이 50% 미만인 화합물은 자극 물질로 간주될 수 있습니다.

재구성된 인간 피부 모델로 검증된 60분, 42시간 피부 자극 테스트를 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 표피덤. 이 절차를 수행 할 때 테스트의 주요 부분이 멸균 또는 정화조 조건에서 수행된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 방법 수정이 필요하거나 절차 단계에 대한 더 나은 설명이 필요한 경우 주저하지 말고 당사에 연락하여 도움과 조언을 받으십시오.

그게 다야. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.