체외에서 피부 자극 시험 (SIT)는 인간 표피 (RHE) 모델 재구성

Epiderm은 Matt Tech Corporation에서 개발한 정상 인간 세포 유래 체외 재구성 인간 표피 모델입니다. EC VM이 검증한 Epiderm 피부 자극 시험 프로토콜은 화장품, 원료 및 산업용 제제와 같이 인체 피부에 접촉하게 될 제품에 대해 기존의 동물 기반 시험을 대체합니다. 본 시험은 피부 자극 키트와 Epiderm 조직이 실험실에 도착하는 0일 차에 시작되며, 이후 하룻밤 동안 배양한 뒤 분석 배지로 전처리를 수행합니다.

1일 차에 표피 조직의 비정형 표면을 추정 자극 화합물에 1시간 동안 노출시킨 후, 2일 차에 세척 단계를 통해 자극제를 제거합니다. 24시간 배양 후, 배양 인서트를 신선한 배지에 옮기고 기존 배지는 방출된 사이토카인 및 케모카인 분석에 사용할 수 있습니다. 조직을 MTT라고 알려진 화합물과 반응시키면, 미토콘드리아 환원효소에 의해 암자색으로 전환되어 maoz 및 salt 분석에 사용됩니다.

세포 생존력을 판독합니다. 시료에서 진한 보라색이 나타나지 않는 것은 생존력이 감소했음을 나타냅니다. 또한, 테스트 화합물의 비색 판독값이 음성 대조군의 50% 미만일 경우, 해당 테스트 화합물은 자극제로 분류될 수 있습니다.

안녕하세요, Matt Corporation의 Helena Kava입니다. 오늘은 재구성된 인간 피부 모델인 epiderm을 이용한 인비트로(in vitro) 피부 자극 시험 절차를 보여드리겠습니다. 이 절차는 규제 요구 사항에 따라 인비보(in vivo) 급성 피부 자극 시험을 완전히 또는 부분적으로 대체하는 용도로 사용될 수 있습니다.

이 새로운 인 비트로(in vitro) 절차는 화학 물질 및 화장품 원료의 위해성 확인 및 라벨링에 사용될 수 있습니다. 이제 시작하겠습니다. Epiderm은 인간 표피 각질 형성 세포 배양에서 유래하여 인간 표피의 3차원적, 다층적 및 고도로 분화된 모델을 형성합니다.

해당 조직들은 유사분열 및 대사 활동이 활발하며, 구조적 및 생화학적으로 생체 내 대응 조직을 밀접하게 모방하고, 인간 표피와 같이 보장된 재현성을 가집니다. Epiderm은 조직화된 기저층, 가시층, 과립층 및 다층의 각질층으로 구성됩니다. 각질층에는 생체 내에서 발견되는 것과 유사한 패턴으로 배열된 세포 간 라멜라 지질층이 포함되어 있습니다.

이 조직들은 무혈청 배지에서 배양됩니다. 각 조직은 개별 세포 배양 인서트에서 성장시킵니다. 96웰 고처리량 형식을 포함한 다른 구성도 가능합니다.

조직 생산은 완료까지 약 3주가 소요되며, 이 과정의 특정 시점에 조직을 공기-액체 계면(air liquid interface)으로 올리고 조직의 APIC 표면에서 모든 액체를 제거합니다. 조직은 기저측 표면을 통해서만 영양분을 공급받으며, 이 표면은 MatTech의 독자적인 배양 배지와 접촉 상태를 유지합니다. 전형적인 Epiderm 키트는 직경 9mm의 조직이 각각 들어있는 24개의 조직 배양 인서트와 이 피부 자극 시험을 수행하기에 충분한 분석 배지를 포함하고 있습니다.

24개의 인서트가 중간 주입된 AGA 로즈 겔 위에 단단히 안착되어 있으며, 표준 24웰 플레이트의 각 웰에 조직이 하나씩 들어 있습니다. 화학 물질 테스트를 시작하기 전, 3~4°C의 온도에서 익일 배송 서비스를 통해 운송됩니다. EPIDERM 테스트 시스템을 사용하여, 서면 프로토콜에 설명된 대로 분석에 사용되는 모든 기구와 도구를 준비하고 멸균하십시오. 면봉과 같은 일부 재료는 멸균 포장된 상태로 제공되거나 오토클레이브 처리되어야 합니다.

포셉과 같은 기구의 멸균에는 70% ethanol을 사용해야 하며, 세척병의 멸균에는 UV 또는 감마선 조사를 사용해야 합니다. 분석에 사용되는 두 가지 핵심 용액은 미리 준비된 DPBS와 5% SDS 용액입니다. 24개의 표피 조직이 포함된 키트 하나당, 분석에는 증류수로 제조한 pH 7의 멸균 DPBS 약 2L가 사용됩니다.

멸균 DPBS는 세척액뿐만 아니라 음성 대조군으로 사용됩니다. 5% SDS를 준비하여 양성 대조군으로 사용해야 합니다. 피부 자극 시험은 EPIDERM EPI 200 SIT 키트를 수령한 후 즉시 시작합니다.

모든 키트 구성품의 무결성을 확인하고, 문제가 있을 경우 즉시 Mat Tech 사에 문의하십시오. 모든 구성품이 갖춰져 있다면 다음 단계로 진행하십시오. 테스트를 시작하려면 키트에 제공된 분석 배지가 실온에 도달하도록 하십시오. 라미나 플로우 후드 내에서 미리 가열하지 마십시오.

표피 조직 인서트 3개당 멸균된 6-well 플레이트 1개를 준비하고, 멸균 조건 하에서 각 웰에 분석 배지 0.9 milliliters를 피펫으로 분주합니다. 멸균된 공기 흐름 하에서 표피 조직이 포함된 24-well 플레이트가 담긴 플라스틱 백을 엽니다. 멸균 거즈를 제거하고 멸균 핀셋을 사용하여 표피 조직이 포함된 각 인서트를 조심스럽게 꺼냅니다.

멸균 거즈나 필터 페이퍼로 가볍게 닦아내어 인서트 외측에 남아 있는 아가로스(agarose)를 제거합니다. 그 후 5분 이내에 조직을 빈 멸균 24 웰 플레이트에 옮깁니다. 인서트를 육안으로 점검합니다.

조직의 결함이나 표면의 과도한 수분을 기록하십시오. 결함이 있는 조직이나 액체로 완전히 덮인 조직은 사용하지 마십시오.

최적의 조직 인서트. 표면이 건조해야 하며, 분리된 부분, 고르지 않은 부분 또는 표면의 과잉 액체가 없어야 합니다. 다음으로, 멸균 면봉을 사용하여 조직의 표면을 조심스럽게 건조시킵니다.

조직을 직접 만지지 않도록 주의하십시오. 표면을 건조시킨 후에는 모세관 현상만으로도 표면의 수분을 충분히 제거할 수 있습니다. 6개씩 묶인 각 행의 상단 줄에 조직 3개를 옮기십시오.

0.9 milliliter의 분석 배지를 미리 채운 웰 플레이트입니다. 인서트 아래에 갇혀 있는 기포를 제거하십시오. 다음으로 인서트가 포함된 6-웰 플레이트를 인큐베이터에 넣고 1시간 동안 둡니다.

37 °C에서 사전 배양합니다. 첫 번째 사전 배양 기간이 끝나면, 인서트를 6-well 플레이트의 상단 웰에서 하단 웰로 옮깁니다. 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 사전 배양합니다.

나머지 분석 배지를 냉장고에 넣습니다. 하룻밤 동안의 사전 배양 후, 테스트 화학 물질을 표피 조직 인서트에 처리할 수 있습니다. 화학 물질 노출 분석을 시작하기 전, 필요한 모든 장치, 용액 및 테스트 화학 물질을 실온에 둡니다.

멸균 후드 내에서, 모든 비멸균 재료 병을 후드 안에 넣기 전 70% ethanol로 닦아냅니다. 음성 대조군 멸균 DPBS, 양성 대조군, 5% SDS 및 증류수 또한 후드 내의 실온 상태로 준비해 둡니다. 폐기물 수거를 위한 큰 바이알을 따로 마련합니다.

각 화학 물질당 6-웰 플레이트를 하나씩 준비하고, 상단 행의 각 웰에만 0.9 milliliters의 분석 배지를 채웁니다. 각 플레이트에 조직 번호와 화학 물질 이름을 표시합니다.

화학 물질에 노출시키기로 계획한 시간의 약 5분 전에, 전처리가 완료된 조직이 담긴 6-웰 플레이트를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 그런 다음 조직의 표면 상태를 육안으로 평가합니다.

멸균 면봉을 사용하여 모든 수분을 제거하되, 조직 표면을 누르지 마십시오. 마지막으로, 6-웰 플레이트 뚜껑에 테스트 물질의 코드 또는 이름을 표시합니다. 음성 및 양성 대조군을 각각 3회 반복 측정하는 것을 포함하여, 한 번의 테스트 과정에서 6가지 이상의 화학 물질을 테스트하지 마십시오.

이미 알려진 테스트 물질을 취급할 때는 화학 물질 도포 및 세척 간격을 1분으로 설정하십시오. 코드가 부여되었거나 알 수 없는 시료의 경우, 물질안전보건자료(MSDS)에 기재된 지침을 따르십시오. 화학 안전 가이드라인을 준수하고 환기 장치가 설치된 캐비닛을 사용하십시오.

장갑을 착용하고 눈과 얼굴을 보호하십시오. 노출 후 시험 화학물질의 세척을 용이하게 하기 위해 1분 간격으로 조직에 화학물질을 투여하며, 마지막 조직에 투여할 때까지 투여 조직이 담긴 플레이트를 층류 후드(laminar hood) 안에 보관하십시오. 조직과 시험 화합물을 다루기 위해 전체 과정 동안 벌브 형태의 팁이 달린 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 액체 화학물질을 시험하기 위한 벌브 모양의 팁은 분젠 버너의 불꽃을 이용하여 만들 수 있습니다.

액체 테스트 물질 30 µL를 조직 위에 직접 분주하고, 즉시 타이머를 시작하여 시간을 측정합니다. 조직 표면에 나일론 메쉬를 배치합니다. 타이머가 1분에 도달하면 두 번째 액체 화합물을 추가합니다. 테스트 화학 물질당 3개의 조직을 사용하며, 각 화합물을 1분 간격으로 추가해야 함을 유의하십시오.

반고체 제형을 테스트하려면, 양압 변위 피펫(positive displacement pipette)을 사용하여 30 µL를 조직 위에 직접 분주하십시오. 필요한 경우, 파스퇴르 피펫을 사용하여 화학 물질을 조직 크기에 맞게 펴 바르십시오. 고체 물질을 도포하기 직전에, 조직 표면과 테스트 화학 물질의 접촉을 개선하기 위해 25 µL의 멸균 DPBS로 조직 표면을 적신 후, 25 mg 정밀 도포 스푼에 미세하게 분쇄된 테스트 물질을 채우십시오.

고체 테스트 화학 물질을 조직 표면에 도포합니다. 필요한 경우, 멸균된 벌브 헤드 피펫을 사용하여 스푼의 내용물을 완전히 비웁니다. 인서트를 가볍게 흔들어 고체 물질이 표면에 잘 퍼지도록 합니다.

조직 크기에 맞게 피펫 끝에 전용 팁(bulb head)을 장착하여 사용할 수 있습니다. 조직 표면을 누르지 마십시오. 마지막으로, 마지막 조직에 투여한 후 대조군으로서 DPBS(음성 대조군)와 5% SDS(양성 대조군)를 각각 3반복으로 조직 인서트에 적용하고, 모든 플레이트를 습도가 유지되는 37 °C 인큐베이터에서 35 ± 1분 동안 배양하십시오.

배양하는 동안 세척 단계에 필요한 모든 재료를 후드 안에 준비하십시오. 35분간의 배양이 끝나면 인큐베이터에서 모든 플레이트를 꺼냅니다. 이를 멸균 후드로 옮기고, 첫 번째 투여 조직의 화학 물질 노출 시간이 60분 동안 완료될 때까지 기다립니다.

다음으로, 세척 절차를 시작합니다. 멸균된 DPBS로 조직을 15회 헹굽니다. 잔류 시험 물질을 제거하기 위해, 조직 표면에서 1.5 centimeters 떨어진 곳에서 DPBS를 지속적으로 흘려보내 조직 인서트를 채운 후 비웁니다.

DPBS 스트림이 너무 약하면 시험 물질이 제거되지 않으므로 주의하십시오. 나일론 메쉬를 사용하여 조직 4개를 5회 세척할 때 1분 간격의 시간 차를 유지하고, 뾰족한 핀셋으로 메쉬를 조심스럽게 제거하십시오. 그 후 나머지 10회 세척을 계속 진행하고, 15회째 세척 후에는 세척병을 사용하여 인서트를 150 mL의 DPBS에 3회 완전히 담가 헹구고 흔들어 남은 시험 물질을 제거하십시오.

마지막으로 조직을 헹굽니다. 멸균된 DPBS를 사용하여 내부에서 한 번, 외부에서 한 번 인서트를 삽입합니다. 인서트를 부드럽게 흔들고 멸균 흡수지로 닦아내어 조직에서 과잉의 DPBS를 제거합니다.

다음으로, 블로팅된 조직 인서트를 어세이 배지가 미리 채워진 새로운 6-웰 플레이트로 옮깁니다. 다시 한번, 각 노출 시료의 노출 시간을 60분으로 유지하기 위해 이 모든 단계가 1분 간격 내에 완료되어야 함을 기억하십시오. 마지막 조직의 세척이 끝나면, 멸균 면봉을 사용하여 각 조직의 표면을 조심스럽게 건조시킵니다.

표면에 화학 물질의 흔적이 여전히 남아 있다면, 멸균된 면봉을 사용하여 이를 제거하십시오. 마지막으로, 조직을 인큐베이터에서 향후 24시간 동안 배양합니다. 배양 시작 시간을 방법 기록지에 기록하십시오.

또한 방법 문서 시트에 모든 다른 응용 사례를 기록하십시오. 후드 내에서 플레이트를 이동하는 Mat Tech Corporation 제공 표준 작업 절차서의 부록을 참조하십시오. 0.9 milliliter 배지가 미리 채워진 6-well 플레이트의 하단부로 인서트를 옮기십시오.

상단 열에서 배지를 수집하여 미리 라벨을 붙인 24-웰 플레이트에 옮긴 후, -20°C에 보관하십시오. 분석 전까지 배양액으로 방출된 사이토카인 및 케모카인의 분석은 선택적 단계입니다. MTT 분석을 위해 18 ± 3시간 동안 추가로 배양하십시오. 2개의 24-웰 플레이트에 화학 물질의 이름이나 코드를 기입하여 라벨을 붙이십시오.

MTT는 독성이 있으므로 취급 시 반드시 보호 장갑을 착용하십시오. MTT 농축액을 해동한 후 MTT 희석액으로 희석하여 MTT 용액을 준비합니다.

MTT는 빛에 민감하므로 빛으로부터 보호하고 2~3시간 이내에 사용하십시오. MTT는 시간이 지남에 따라 분해되므로, 24웰 플레이트의 각 웰에 MTT 배지 300 µL를 피펫으로 분주합니다. 이제 인큐베이터에서 6웰 플레이트를 꺼냅니다.

블로팅 페이퍼로 인서트 바닥의 액체를 닦아낸 후, MTT가 미리 채워진 24웰 플레이트로 옮깁니다. 24웰 플레이트를 인큐베이터에 넣고 3시간 동안 배양합니다. MTT 판독값의 편차를 방지하기 위해 3시간의 배양 시간을 엄격히 준수해야 하며, MDS에 MTT 배양 시작 시간을 기록하는 것을 잊지 마십시오. MTT 배양이 완료되면, 독성 폐기물 트랩이 장착된 석션 펌프를 사용하여 모든 웰에서 MTT 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.

웰을 DPBS로 다시 채운 후 흡입하여 제거합니다. 이 세척 과정을 두 번 더 반복하며, 마지막 흡입 후에는 조직이 건조한지 확인하십시오. 세척이 끝나면 인서트를 새로운 24웰 플레이트로 옮기고, 각 인서트에 2 mL의 추출액을 조심스럽게 피펫팅하여 인서트를 침전시킵니다.

액위가 인서트의 상단 가장자리보다 높아져 양쪽 모두에서 조직이 완전히 잠기게 됩니다. 추출물 손실과 증발을 막기 위해 히트 실러 또는 파라필름을 사용하여 24웰 플레이트를 밀봉하십시오. 방법 기록지에 추출 시작 시간을 기록하고, 플레이트 쉐이커에서 완만하게 흔들어주며 상온에서 최소 2시간 동안 추출합니다. 추출 기간이 완료되면, 주사 바늘이나 팁 끝이 둥근 파이펫을 사용하여 인서트를 뚫고 추출물이 인서트가 들어있던 웰로 흘러 들어가게 하십시오.

천공된 인서트를 폐기하고, 웰 안의 용액이 균질해질 때까지 피펫으로 세 번 위아래로 섞어줍니다. 각 조직에 대해 120 RPM으로 설정된 플레이트 셰이커를 사용할 수도 있습니다. 블루 포르마 용액 200 µL씩 두 분량을 96-웰 평저 마이크로타이터 플레이트로 옮깁니다.

공시료(blank)를 위해 이 비디오 프로토콜에 제공된 스프레드시트의 고정 플레이트 설계에 따라 중복 시료를 옮깁니다. ISO propanol을 사용하여 96-웰 플레이트 분광광도계로 레퍼런스 필터 없이 570 nanometers 파장에서 광학 밀도(OD)를 측정합니다. 결과값의 자동 계산을 위해 결과를 스프레드시트에 입력합니다.

첨부된 프로토콜에 설명된 대로 시험 화학 물질의 간섭으로 인한 보정 사항을 고려하며, 시험 화학 물질은 자극성 물질로 표시됩니다. 분광 광도 분석 후 조직 생존율이 50% 이하인 경우, NC 조직의 OD 570은 1 이상 2.5 이하입니다. 또한 음성 대조군 조직의 백분율로 표시된 PC 조직의 평균 생존율은 20% 미만이며, 동일하게 처리된 3개 반복군의 개별 조직 생존율 백분율로부터 계산된 SD는 18% 미만입니다. 세포 생존율 값이 50% 미만으로 나타나는 화합물은 자극성 물질로 간주될 수 있습니다.

지금까지 재구성된 인간 피부 모델인 Epiderm을 사용하여 검증된 60분 및 42시간 피부 자극 시험을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 시험의 대부분이 무균 또는 무균 상태에서 진행된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 방법의 수정이 필요하거나 절차 단계에 대해 더 자세한 설명이 필요한 경우, 주저하지 말고 저희에게 연락하여 도움과 조언을 구하시기 바랍니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.