Name: 형광 현장에서 하이브리드화 (물고기) 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: 학습하세요 형광 현장 하이브리드화(FISH) 프로토콜을 사용하여 인간 정자 핵의 염색체 13, 18, 21, X, Y를 분석하는 방법을. 이 기술은 불임 남성의 비수체성 선별 및 생식 건강 평가에 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 Generalitat 드 Catalunya (2005 - SGR00437)에 의해 지원되었다. 저자는 그들의 자신의 기술 지원에 대한 감독과 격려, 그리고 J. 루카스에 대한 J. 블랑코와 F. 비달에 감사드립니다.

I. 샘플 처리 및 세포 고정 <ol><li> 액화까지 20 분 실온에서 멸균 용기에 정액 샘플을 둡니다. </li><li> 원심 분리기 튜브에 샘플을 전송하고 5 분 1천그램에 그것을 돌린다. </li><li> 부드럽게 파스퇴르 피펫을 사용하여 표면에 뜨는를 제거하고 폐기. </li><li> hypotonic 솔루션을 추가 (KCl, 0.075M) 미리 가열 10 ML의 최종 볼륨을 얻기 위해 소용돌이에 혼합하는 동안, 37 ° C 드롭에 의해 드롭. </li><li> 37 물 목욕에 튜브를 삽입 ° C를 30 분. </li><li> 5 분 1천g에서 원심 분리기. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고, decantation로 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 8 ML의 최종 볼륨을 얻기 위해 소용돌이에 혼합하는 동안 드롭하여 드롭 : 펠렛을 resuspending 후, 갓 Carnoy의 정착액을 (초산 3시 1분 메탄올) 준비 추가할 수 있습니다. </li><li> 흰색 펠렛을 얻기 위해 필요한만큼 여러 번 같은 점 6과 7을 반복합니다. </li><li> 신선한 메탄올 추가 : 초산 (3시 1분) (작은 펠릿 분들의 경우 확산 좋은 세포를 얻는 데 필요한 세포 농도 최종 음량을 조절하기 위해 드롭하여 드롭을 몇 방울이 높은 양의 샘플 반면에 충분합니다 정자가 회복의 최종 볼륨) 1-2 ML에 도달할 수 있습니다. 테스트 슬라이드 ungreased 슬라이드에 resuspended 샘플을 포기하고 위상 콘트라스트 현미경을 조사하여 만들 수 있습니다. 이것은 얻은 세포 분산을 확인하고 필요한 경우 추가로 슬라이드에, 그것을 정정 허용됩니다 드릴 것입니다. </li><li> 확장, 40cm의 최소 높이에서 드롭 unfrosted 슬라이드의 중앙에 세포 현탁액의 두 개 또는 세 방울 (이전에 그들을 degrease -20 ° C에서 메탄올에 저장).하려면 프로토콜을 통해 시료의 위치를​​ 사용하려면, 다이아몬드 연필을 사용하여 슬라이드의 반대편에있는 정자 확장을 포함하고있는 영역을 표시합니다. </li><li> 최소한 24 시간 동안 -20 ° C에서 슬라이드를 저장합니다. 참고 : 메탄올의 추가 : 초산 (3시 1분) 드롭 들러 혼합은 정자 집계의 형성을 피하기 위해 매우 중요한 단계 동안. </li></ol> II. Decondensation <ol><li> 슬라이드는 -20 ° C에 저장된는 (상온에서 그들을두고) 프로토콜과 함께 계속해서 사인을 알아낼 수 없을해야합니다. </li><li> 삼분 각 2X 호수 - 나트륨 구연 산염 솔루션 (2xSSC)로 연속 2 코플린 단지에있는 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 각 코플린 병 2 분 에탄올 세척 일련의를 통해 슬라이드를 전송합니다. , 70 % 에탄올로 시작 90%에 의해 따라 100 % 완료. 실온에서 그것을두고 슬라이드를 건조시킵니다. </li><li> 37 dithiothreitol 솔루션 슬라이드 (1,4 - dithiothreitol 5mM, 1 % 트리톤 X - 100, 2 - 아미노 -2 - (히드록시 메틸) -1,3 - propanediol 50mM)을 품어 ° 인큐베이터에서 C는 염색질을 decondense 수 있습니다. 이 제품은 마리의 정자 수야 핵에 protamines의 이황화 다리 해당 코일 DNA를 깨는하여 역할을합니다. 정자의 핵에있는 DNA가 높은 압축되기 때문에 이것은 매우 중요한 단계입니다. dithiothreitol 솔루션 (DTT)의 슬라이드의 배양 시간은이 제품에 대한 샘플의 반응에 따라 조정해야합니다. 그 2로 15 분 거리에 따라 다를 수 있지만 일반적으로,이 시간은 8 분 정도입니다. </li><li> 즉시 각 코플린 3 분 2xSSC 두 개의 연속 코플린의 단지로 슬라이드를 전송합니다. </li><li> 각 코플린 병 (70 %, 90 % 및 100 % 에탄올) 2 분 에탄올 세척 일련의를 통해 슬라이드를 삽입하여 계속합니다. 상온에서 밖으로 건조에 슬라이드를하자. 참고 : 너무 짧은 노출이 어떤 신호의 부족을 초래 하리라는 반면, DTT에 과도한 노출은 프로 시저의 끝에 물고기 신호를 분산 나타날 수 있습니다. </li></ol> III. 이종 교잡 <ol><li> 73에서 포름 아미드 용액 (70 % Formamide/2xSSC) · 5 분 C와 코플린 병에 슬라이드를 잠복기하여 정자의 DNA를 변성. </li><li> 코플린 병 당 일분 (70 % 에탄올과 85 %를 시작하고 100 % 완료)에 대한 에탄올의 솔루션을 통해 슬라이드를 전송합니다. 상온에서 밖으로 건조하는 슬라이드를 둡니다. </li><li> 의 직접 5리터 추가 대응 준비 - 사용 15x15 커버 슬립 (AneuVysion 분석 멀티 컬러 프로브 패널 : CEP 18/X/Y 또는 LSI 21분의 13)에 프로브 혼합합니다. </li><li> 그것이 동영상에 나와있는, 대상 지역 및 프로브 혼합물을 함께 넣어 커버 슬립에 슬라이드를 조심스럽게 넣습니다. 고무 시멘트로 밀봉합니다. </li><li> 미리 예열 37에 슬라이드를 삽입 ° C 하이브리드화 챔버 (HYBrite ™) 및 6~24시간에 대한 ° C 37를 품어. 참고 : 정자 샘플의 변성이 필수적인 반면, 프로브를 denaturing의 필요성은 제조 업체에 의해 결정됩니다. 이 프로토콜에 사용되는 프로브 혼합물은 사용할 수 있으며,이 경우, 프로브 변성이 필요하지 않습니다. 프로브 혼합물의 볼륨 hybridized 영역의 크기에 따라 달라집니다. </li></ol> IV. 씻는다포스트 하이브 리다이 제이션 <ol><li> 하이브 리다이 제이션 챔버에서 슬라이드를 꺼내주세요. </li><li> 고무 시멘트를 제거하고 조심스럽게쪽으로 부드럽게 슬라이딩 커버 슬립을 빼낸다. </li><li> unspecific 하이브리드화 신호를 제거하려면 0.4xSSC/0.3 %와 코플린 병 2 분 동안 슬라이드를 장소 NP - 40 미리 예열 73 °에서 물을 욕조에 C. </li><li> 1 분 상온에서 2xSSC/0.1 % NP - 40 세척 솔루션에 슬라이드를 전송합니다. 상온에서 밖으로 건조에 슬라이드를하자. </li><li> 대상 지역 (18x18 커버 슬립 8 L)에 counterstaining 제품을 추가합니다. 사용되는 가장 일반적인 제품 4 &#39;, 6 diamidino - 2 - phenylindole (DAPI, Vysis 주식 회사)입니다. </li><li> 그것이 동영상에 나와있는, 커버 슬립 (커버 슬립이 손톱 바니와 함께 날인 수있는 하이브 리다이 제이션을 유지하기 위해)와 hybridized 지역을 커버. </li><li> 그들의 전망 분석까지 어둠 속에 -20 ° C에서 hybridized 슬라이드를 저장합니다. 이러한 조건 아래 슬라이드는 형광 신호 강도에 상당한 손실없이 12 개월 동안 저장할 수 있습니다. 참고 : 반대 unspecific 프로브 hybridizations을 씻지 않았 반면, 높은 온도 또는 과도한 세척 시간이 일부 신호의 제거에 발생할 수 있습니다. 추가 counterstaining 제품의 볼륨 충당하기 위해 하이브 리다이 제이션 영역의 크기에 따라 달라집니다. </li></ol> V. 시각화 준비는 DAPI / 텍사스 레드 / FITC와 단일 밴드 아쿠아, FITC와 텍사스 레드에 대한 필터 트리플 밴드 필터가 장착된 epifluorescence 현미경으로 평가할 수 있습니다. 표준 평가 기준은 정자의 핵 1의 올바른 평가를 따라야합니다. 염색체 X, Y 및 18 탐사선과 hybridized 준비 이러한 세 염색체에 대한 신호를 표시해야합니다. 모든 정상 마리의 정자 수야 한 파란 신호 (염색체 18에 해당), 그리고 녹색 신호 (X 베어링 마리의 정자 수야) 또는 빨간 신호 (Y - 베어링 마리의 정자 수야)를 제시해야합니다. 염색체 13, 21 염색체 13 염색체 21 붉은 신호 녹색 신호 프로브와 함께 hybridized 준비의 모든 정상 마리의 정자 수야에서 구별해야합니다.

<ol><li>Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+chromosome+21+disomy+in+human+spermatozoa+as+determined+by+fluorescent+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

이 프로토콜은 정자 물고기 준비를위한 인간의 정액 샘플을 처리하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 남성의 염색체 이상 gametes를 분석하는 것이 가능합니다. 마리의 정자 수야 aneuploidy 심사는 기초 연구의 맥락과 불임 남성에게 주어진 생식 조언에 두 응용 프로그램이 있습니다. 임상 진단에 가장 널리 연구 염색체는 X, Y, 13, 18 및 21 염색체와 loci 광범위한 다른 상용 프로브은 사용할 수 있으며, 이러한 실험에서도 사용할 수 있지만.

<table><tbody><tr><td>1,4-디티오트레이톨 (DTT)</td><td>재료</td><td>로슈 그룹</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2-아미노-2-(히드록시메틸)-1,3-프로판디올</td><td>재료</td><td>로슈 그룹</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>재료</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100.063</td><td></td></tr><tr><td>AneuVysion&amp;#174; 다색 DNA 프로브 키트&lt;ul style=&quot;패딩: 2px;&quot;&gt;&lt;제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.&gt;20x saline-sodium citrate (20배 농축 식염-구연산나트륨 용액)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI II)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;CEP 18/X/Y DNA 프로브&lt;/li&gt;&lt;리튬(Li)&gt;NP-40&lt;/li&gt;&lt;제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.&gt;LSI 13/21 DNA 프로브&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>재료</td><td>Vysis Inc.</td><td>32-161075 &lt;ul style=&quot;패딩:2px;&quot;&gt;&lt;li&gt;30-805850&lt;/li&gt;&lt;리튬&gt;30-804941 &lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171077&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804820&lt;/li&gt;&lt;리튬(Li)&gt;30-171078&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5804R</td><td>도구</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리관</td><td>재료</td><td>Nalge Nunc international</td><td>347856</td><td></td></tr><tr><td>코플린 자(유리제)</td><td>재료</td><td>바로우월드 사이언티픽</td><td>Hellendahl (ZCT278)</td><td></td></tr><tr><td>코플린 자(플라스틱)</td><td>재료</td><td>Deltalab</td><td>191087</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 (15x15)</td><td>재료</td><td>크니틀 글레이저</td><td>4600115</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립 (18x18)</td><td>재료</td><td>니텔 글라저</td><td>4600118</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 펜슬</td><td>재료</td><td>하마허(Hammacher)</td><td>335117010</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>재료</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>재료</td><td>로슈 그룹(Roche Group)</td><td>11814320001</td><td></td></tr><tr><td>냉동고</td><td>도구</td><td>Zanussi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>장갑</td><td>재료</td><td>Sanyo</td><td>101/3300</td><td></td></tr><tr><td>HYBrite&amp;#8482;</td><td>도구</td><td>Vysis Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>침강유 (Immersion Oil)</td><td>재료</td><td>Olympus Corporation</td><td>35505</td><td></td></tr><tr><td>배양기</td><td>도구</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>재료</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>106.009</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫</td><td>재료</td><td>실험실 시스템</td><td>핀피펫 (4500000)</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁 교체</td><td>재료</td><td>Daslab</td><td>16-2001</td><td></td></tr><tr><td>매니큐어</td><td>재료</td><td>쿼-코스메틱스(Quo-cosmetics)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX60 형광 현미경</td><td>도구</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>DAPI/Texas Red/FITC용 3색 필터와 Aqua, FITC 및 Texas Red용 단색 필터가 장착되어 있습니다.</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>재료</td><td>Rubilabor</td><td>211.0230</td><td></td></tr><tr><td>위상차 현미경</td><td>도구</td><td>Nikon 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 피펫 (3ml)</td><td>재료</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>재료</td><td>Fluka</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>러버 시멘트</td><td>재료</td><td>최적 테스트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>슬라이드</td><td>재료</td><td>크니텔 글레이저(Knittel Glaser)</td><td>4520022</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 보관함</td><td>재료</td><td>Deltalab</td><td>19276.1</td><td></td></tr><tr><td>멸균 용기</td><td>재료</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>재료</td><td>PentaFerte</td><td>002022300</td><td></td></tr><tr><td>온도계</td><td>재료</td><td>Comark Instruments, Inc</td><td>KM12</td><td></td></tr><tr><td>3회 증류수</td><td>재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>재료</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>재료</td><td>B. Braun Medical</td><td>Aesculap (BD224R)</td><td></td></tr><tr><td>수직 층류 &lt;전자현미경&gt;클린벤치&lt;/em&gt;</td><td>도구</td><td>Burdinola</td><td>OR-ST 1500</td><td></td></tr><tr><td>볼텍스 믹서</td><td>도구</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15012</td><td></td></tr><tr><td>항온수조</td><td>도구</td><td>Raypa&amp;#174;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

형광 현장에서</em인간의 정자에서> 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies은 인간에서 가장 자주 염색체 이상입니다. 이러한 이상의 대부분은 부모의 gametogenic 과정 meiotic 오류로 인한. 인간의 남성에서 이러한 오류가 자손에게 이러한 이례적인 전송의 증가 위험을 나타내는 수치 염색체 이상과 마리의 정자 수야의 생산으로 이어질 수 있습니다. 이러한 이유로, 정자의 핵에 원위치 하이브리드화 (물고기)의 형광의 기술은 광범위하게 임상 진단의 맥락에 통합 프로토콜되고있다. 이러한 행위는 유전자의 생식 조언을 추구 환자의 gametes의 수치 염색체 이상의 주파수의 예측을 제공합니다. 지금까지 대부분의 자주 정자 생선 분석에 포함된 염색체는 염색체 X, Y, 13, 18과 21입니다. 이 비디오 문서에서는 어떻게 현미경의 결과를 시각화하는 방법에 정자 물고기 준비를 얻기 위해 진행 정자 염색질을 decondense 및 변성하는 방법, 인간의 정액 샘플을 처리하고 해결하는 방법을 단계적으로, 그리고 설명합니다. 가장 관련성이 높은 단계의 특별 연설은 최상의 결과를 달성하기 위해 주어집니다.

이 비디오 기사는 양질의 형광을 달성하기 위해 정액 샘플을 처리하는 방법을 단계적으로, 설명<em&gt; 현장에서</em인간 마리의 정자 수야에&gt; 하이브 리다이 제이션. 얻은 준비는 임상 진단의 맥락에서 aneuploidy 심사 사용할 수 있습니다.

이배수성(Aneuploidies)은 인간에게서 가장 빈번하게 발생하는 염색체 이상입니다. 이러한 이상의 대부분은 생식세포 형성 과정 중 감수분열 오류로 인해 발생하며...

인간 정자 핵 내의 형광 인시튜 하이브리다이제이션(Fluorescence in situ hybridization) 프로토콜은 임상 진단 분야에서 널리 도입되었습니다. 이 방법론의 응용 분야 중 하나는 정자의 배수성 스크리닝입니다. 불임 남성에게 제공되는 생식 관련 상담의 일부로서, 이러한 개인들은 일반 인구보다 수적 이상이 나타날 가능성이 더 높으며, 흔히 비정상적인 정액 지표를 보입니다.이는 이러한 이상들이 자손에게 전달될 위험이 증가함을 의미합니다. 오늘은 13번, 18번, 21번, X 및 Y 염색체 분석을 위해 탈응축된 정자 핵에서 수행하는 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescence in situ hybridization) 프로토콜을 설명하겠습니다. 샘플을 채취한 후, 액화가 일어날 때까지 실온에서 20분 동안 방치해야 합니다. 프로토콜을 시작하려면 샘플을 원심분리 튜브로 옮겨야 합니다.실험의 첫 번째 단계에서 사용할 용액은 37 °C로 예열한 고장성 용액과 3:1 비율의 메탄올-아세트산 혼합액입니다. 이 용액들은 즉석에서 새로 조제해야 합니다. 그 후, 시료를 1,000 ×g에서 5분 동안 원심분리할 준비를 합니다.이제 상층액을 조심스럽게 제거하고, 전체 부피가 약 10 milliliters가 될 때까지 고장성 용액을 한 방울씩 첨가합니다. 이 튜브를 37 °C에서 30분 동안 유지한 후, 샘플을 다시 원심분리해야 합니다. 원심분리를 통해 정자가 튜브 바닥에 모이게 되며, 이를 통해 저장성 용액을 메탄올로 교체할 수 있습니다.흰색 펠릿을 얻을 때까지 필요한 횟수만큼 메탄올 아세트산으로 교체하여 아세트산 원심분리를 반복해야 합니다. 이 과정에서 메탄올 아세트산을 더 추가해야 합니다. 최종 부피는 이후 단계에서 얻고자 하는 세포 분산 정도에 따라 조절해야 합니다.마지막 단계는 -20°C의 메탄올에 보관된 Reed 슬라이드 위에 고정된 시료를 떨어뜨려 도말 표본을 만드는 것입니다. 추후 재탐색을 위해 정자 도말 부위가 포함된 슬라이드 영역을 표시해 두는 것이 유용합니다. 이는 슬라이드 반대편에 다이아몬드 펜슬을 사용하여 쉽게 처리할 수 있습니다. 세포 분산 상태가 최적임을 확인한 후, 슬라이드를 -20°C에서 최소 24시간 동안 보관해야 합니다.프로토콜을 진행하기 전 단계입니다. 실험의 이 부분에서는 염화나트륨 시트르산 용액, 에탄올 시리즈, DRE, fatal 및 fide를 사용할 것입니다. 슬라이드의 해동이 완료되면, 고정된 시료를 2x SSC가 들어 있는 두 개의 코플란 자(coplan jar)에 순차적으로 담가 세척 및 탈수해야 합니다.각 코플런(coplan) 단계마다 3분씩 소요됩니다. 그 후 슬라이드를 농도가 높아지는 순서대로 각 에탄올 코플런 병에 2분 동안 담가야 합니다. 다음 단계로 진행하기 위해서는 이 시점에서 슬라이드를 완전히 건조시켜야 합니다.정자 핵 내의 DNA는 매우 조밀하게 응축되어 있으므로, 이를 변성시키기 전에 염색질을 탈응축시키는 과정이 필요합니다. 이는 37°C의 DTT 용액을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 제품은 정자 핵 내에서 DNA를 감싸고 있는 프로타민의 이황화 결합을 끊음으로써 작용합니다. DTT 내에서의 슬라이드 배양 시간은 해당 정액 검체의 제품 반응도에 따라 조정해야 합니다.보통 약 8분 정도 소요되지만, 2분에서 15분까지 달라질 수 있습니다. 이 시간이 지난 후, 슬라이드를 즉시 2×SSC에 3분 동안 옮기고 다시 3분 동안 더 처리한 다음, 각 에탄올 코플란 자(coplan jar)에서 2분씩 처리해야 합니다. 프로브 하이브리드화를 위해서는 단일 DNA 가닥으로 작업하는 것이 필수적입니다. 이를 위해 프로브를 추가하기 전, 폼아마이드 용액에서 73°C로 5분간 배양하는 변성 단계가 필요합니다. 슬라이드 처리를 마무리하기 위해, 각 코플란 자에서 슬라이드를 1분 동안 담그는 최종 에탄올 용액 전이 과정이 필요합니다.이제 슬라이드는 임상 진단을 위해 수행되는 FISH 연구의 하이브리드화 단계에 사용할 준비가 되었습니다. 가장 흔하게 분석되는 염색체로는 성염색체와 13번, 18번, 21번 염색체가 있습니다. 이러한 염색체들을 분석하기 위해 Vysis사의 다색 DNA 프로브 키트를 사용하겠습니다.본 제품은 녹색과 아쿠아색으로 각각 표지된 염색체 X, Y 및 18의 알파 위성 영역(alpha satellite region)용 프로브 조합이 들어 있는 바이알 하나와, 녹색과 오렌지색으로 각각 표지된 염색체 13 및 21용 프로브 조합이 들어 있는 바이알 하나로 구성되어 있습니다. 첨가하는 프로브 혼합물의 부피는 하이브리드화를 원하는 영역의 크기에 따라 달라지며, 15 by 15 커버 슬라이드 기준으로는 5 µL의 부피면 충분합니다.두 프로브 혼합물은 사용 편의를 위해 하이브리드화 완충액 내에서 미리 변성되어 있으므로, 탈응축 및 변성 처리된 슬라이드에 직접 첨가할 수 있습니다. 또한 이러한 실험에 사용할 수 있는 광범위한 염색체 및 로커스(locus)용의 다른 상용 프로브들도 준비되어 있습니다. 그러나 일반적으로 이러한 프로브들은 혼합물을 표적 샘플에 첨가하기 전에 사전 변성 처리가 필요합니다.이러한 상황에서는 제조사의 지침을 따르는 것으로 충분합니다. 대상 영역을 커버 슬라이드로 덮고 고무 시멘트로 밀봉해야 합니다. 그런 다음 슬라이드를 37 °C로 예열된 하이브리드화 챔버에 넣고 해당 온도에서 6~24시간 동안 배양합니다.프로토콜의 마지막 단계에서는 서로 다른 농도의 생리 식염나트륨 시트르산 용액과 세제 NP 40으로 구성된 두 가지 세척 용액을 사용할 것입니다. 배양 시간이 지난 후, 슬라이드를 하이브리다이제이션 챔버에서 꺼내 고무 시멘트를 제거합니다. 그런 다음 커버 슬라이드를 조심스럽게 떼어냅니다.보여지는 바와 같이, 슬라이드를 73 °C로 미리 가온한 1차 세척액에 2분 동안 담급니다. 그 후, 실온의 2차 세척액으로 옮겨 1분 더 세척합니다. 이 두 단계의 세척 과정을 통해 비특이적 하이브리드화 신호를 제거할 수 있습니다. 두 번의 세척이 끝나면, 프로토콜의 마지막 단계를 마무리하기 위해 슬라이드가 완전히 건조될 때까지 기다려야 합니다.이 단계에서 세포 핵의 시각화를 용이하게 하기 위해 대비 염색 제품을 첨가합니다. 이 목적으로 가장 흔히 사용되는 제품 중 하나는 dpi입니다. 첨가하는 부피는 18 by 18 커버 슬라이드를 기준으로 하이브리드화된 영역의 크기에 맞추어 조정해야 합니다.8 µL의 DPI면 충분합니다. 커버 슬라이드는 매니큐어로 밀봉할 수 있으며, 이제 시료를 시각화할 준비가 되었습니다. 또는 추후 분석 전까지 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.시각화에 사용할 현미경은 dpi, Texas Red, FITC용 3색 필터와 aqua, FITC, Texas Red용 단색 필터가 장착된 Olympus BX 60 에피 형광 현미경입니다. 3색 필터를 통해 X, Y 및 18번 염색체에 하이브리드화된 표본의 세 가지 염색체 신호를 표시합니다. aqua 단색 필터를 사용하면 18번 염색체의 형광 신호만 시각화할 수 있습니다. 정상적인 모든 정자에서는 이러한 신호가 하나씩 관찰되어야 합니다.하지만 FITC 전용 단일 밴드 필터를 사용할 때, 일부 정자는 X 염색체에 해당하는 녹색 형광 신호를 나타냅니다. 녹색 신호가 없는 정자는 Y 염색체에 대한 적색 신호를 나타내어야 하며, 이는 Texas red 전용 필터를 통해 특이적으로 시각화할 수 있습니다. 3중 밴드 필터를 통해 1321 하이브리드화를 시각화함으로써, 이 두 염색체의 신호를 구분할 수 있습니다.녹색 신호는 13번 염색체에 해당하며, FITC용 단일 밴드 필터를 사용하여 특이적으로 시각화할 수 있습니다. Texas Red용 단일 밴드 필터를 통해 21번 염색체의 신호를 특이적으로 시각화할 수 있습니다. 모든 정상 정자는 이 두 가지 프로브 각각에 대해 하나의 신호를 나타내어야 합니다.요약하자면, 본 프로토콜의 주요 단계는 다음과 같습니다. 다시 한번 강조하지만, 고품질의 연장을 얻기 위해서는 메탄올 아세트산(methanol acetic acid)을 한 방울씩 첨가하여 고정 과정을 정확하게 수행해야 합니다. 응축 해제 과정에서 정자 응집체가 형성되는 것을 방지하려면, 정액 시료의 해당 제품에 대한 반응성에 따라 DTT 용액에서의 배양 시간을 조정해야 합니다.정자를 DTT에 과도하게 노출시키면 프로토콜 종료 시 신호가 분산될 수 있으며, 반대로 노출이 불충분하면 프로브 하이브리다이제이션이 전혀 일어나지 않아 일부 신호가 누락될 수 있습니다. 정자 시료의 변성은 필수적이지만, 프로브 변성은 제조사의 지침에 따라 조정해야 합니다. 하이브리다이제이션 후 진행하는 두 차례의 세척 단계에서는 시간과 온도를 엄격하게 제어하는 것이 중요합니다.온도가 너무 높거나 세척 시간이 과도하면 일부 신호가 소실될 수 있으며, 반대로 세척이 부족하면 비특이적 신호가 제거되지 않습니다. 마지막으로, 원활한 시각화와 신호 해석을 위해서는 적절한 전용 필터가 장착된 형광 현미경의 사용이 필수적입니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.시청해 주셔서 감사합니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

fluorescence-in-situ-hybridization-fish-protocol-in-human-sperm

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

이 문서는 단일 셀 생선 blastomere 핵 확산에 대한 기술 및 현장 하이브 리다이 제이션과 임상 설정에서 미리 주입 유전자 진단 (PGD)에 적용되는 신호 골을에 적합한 프로브의 선택을 설명합니다.

사전 이식 유전자 진단 생선

형광성의<em&gt; 현장에서</em모기의 Mitotic의 염색체에&gt; 하이브리드

여기 우리는 전체 마운트 형광을...

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

여기 3D 현미경 및 분석 (3D immuno-DNA의 물고기)에 의해 다음 DNA 생선의 immunofluorescence와 DNA 시퀀스에 의한 히스톤 수정의 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

3D 원자력기구의 변화를 공부하기 위해 3D 보존 된 계면 핵에 결합 Immunofluorescence와 DNA의 물고기

우리가 직접 라벨 형광 프로브를 사용하여 3D DNA 물고기에 의해 핵 구조를 분석하기위한 강력하고 다양한 프로토콜을 설명합니다.

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

제브라 피쉬, 작은 열대어, 척추 발달과 질병 중 유전자 기능 연구를위한 대중적인 모델이되고있다. 표적 유전자의 시간적, 공간적 표현에 의해 결정될...

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광은 세포 내에서 네이티브 환경에서의 핵산을 검출 할 수 있습니다. 우리는 여기에 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는 데 사용할 수있는 FISH에 의해 RNA와 DNA의 결합, 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

결합 된 DNA-RNA 형광<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화 (물고기) 차별화 된 여성 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는

이 프로토콜은 제브라피쉬 배아 절편의 현장 혼성화와 면역조직화학을 결합하여 이미지를 얻는 방법을 설명합니다. 저온 절개 전에 제자리 하이브리드화를 수행한 후 항체 염색을 수행했습니다. 항체가 부족한 경우 제브라피쉬에서 두 유전자의 발현 패턴을 감지하는 것이 유용합니다.

현장 Cryosectioned Zebrafish 배아에서 면역조직화학과 결합된 혼성화

간단한 해부학적 구조를 감안할 때 Anopheles 고환은 정자 형성을 연구하기 위한 좋은 세포학적 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 이 생물학적 과정을 조사하는 데 사용되는 기술인 전체 마운트 형광 in situ 교잡과 정자 생산에 관여하는 유전자에 돌연변이가 있는 형질전환 균주의 표현형을 설명합니다.

Anopheles 모기의 정자 형성을 연구하기 위한 전체 장착 형광 In Situ 교잡

학습하세요 형광 현장 하이브리드화(FISH) 프로토콜을 사용하여 인간 정자 핵의 염색체 13, 18, 21, X, Y를 분석하는 방법을. 이 기술은 불임 남성의 비수체성 선별 및 생식 건강 평가에 필수적입니다.

형광 현장에서 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

더 많은 동영상 탐색