형광 현장에서 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

인간 정자 핵 내의 형광 인시튜 하이브리다이제이션(Fluorescence in situ hybridization) 프로토콜은 임상 진단 분야에서 널리 도입되었습니다. 이 방법론의 응용 분야 중 하나는 정자의 배수성 스크리닝입니다. 불임 남성에게 제공되는 생식 관련 상담의 일부로서, 이러한 개인들은 일반 인구보다 수적 이상이 나타날 가능성이 더 높으며, 흔히 비정상적인 정액 지표를 보입니다.

이는 이러한 이상들이 자손에게 전달될 위험이 증가함을 의미합니다. 오늘은 13번, 18번, 21번, X 및 Y 염색체 분석을 위해 탈응축된 정자 핵에서 수행하는 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescence in situ hybridization) 프로토콜을 설명하겠습니다. 샘플을 채취한 후, 액화가 일어날 때까지 실온에서 20분 동안 방치해야 합니다. 프로토콜을 시작하려면 샘플을 원심분리 튜브로 옮겨야 합니다.

실험의 첫 번째 단계에서 사용할 용액은 37 °C로 예열한 고장성 용액과 3:1 비율의 메탄올-아세트산 혼합액입니다. 이 용액들은 즉석에서 새로 조제해야 합니다. 그 후, 시료를 1,000 ×g에서 5분 동안 원심분리할 준비를 합니다.

이제 상층액을 조심스럽게 제거하고, 전체 부피가 약 10 milliliters가 될 때까지 고장성 용액을 한 방울씩 첨가합니다. 이 튜브를 37 °C에서 30분 동안 유지한 후, 샘플을 다시 원심분리해야 합니다. 원심분리를 통해 정자가 튜브 바닥에 모이게 되며, 이를 통해 저장성 용액을 메탄올로 교체할 수 있습니다.

흰색 펠릿을 얻을 때까지 필요한 횟수만큼 메탄올 아세트산으로 교체하여 아세트산 원심분리를 반복해야 합니다. 이 과정에서 메탄올 아세트산을 더 추가해야 합니다. 최종 부피는 이후 단계에서 얻고자 하는 세포 분산 정도에 따라 조절해야 합니다.

마지막 단계는 -20°C의 메탄올에 보관된 Reed 슬라이드 위에 고정된 시료를 떨어뜨려 도말 표본을 만드는 것입니다. 추후 재탐색을 위해 정자 도말 부위가 포함된 슬라이드 영역을 표시해 두는 것이 유용합니다. 이는 슬라이드 반대편에 다이아몬드 펜슬을 사용하여 쉽게 처리할 수 있습니다. 세포 분산 상태가 최적임을 확인한 후, 슬라이드를 -20°C에서 최소 24시간 동안 보관해야 합니다.

프로토콜을 진행하기 전 단계입니다. 실험의 이 부분에서는 염화나트륨 시트르산 용액, 에탄올 시리즈, DRE, fatal 및 fide를 사용할 것입니다. 슬라이드의 해동이 완료되면, 고정된 시료를 2x SSC가 들어 있는 두 개의 코플란 자(coplan jar)에 순차적으로 담가 세척 및 탈수해야 합니다.

각 코플런(coplan) 단계마다 3분씩 소요됩니다. 그 후 슬라이드를 농도가 높아지는 순서대로 각 에탄올 코플런 병에 2분 동안 담가야 합니다. 다음 단계로 진행하기 위해서는 이 시점에서 슬라이드를 완전히 건조시켜야 합니다.

정자 핵 내의 DNA는 매우 조밀하게 응축되어 있으므로, 이를 변성시키기 전에 염색질을 탈응축시키는 과정이 필요합니다. 이는 37°C의 DTT 용액을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 제품은 정자 핵 내에서 DNA를 감싸고 있는 프로타민의 이황화 결합을 끊음으로써 작용합니다. DTT 내에서의 슬라이드 배양 시간은 해당 정액 검체의 제품 반응도에 따라 조정해야 합니다.

보통 약 8분 정도 소요되지만, 2분에서 15분까지 달라질 수 있습니다. 이 시간이 지난 후, 슬라이드를 즉시 2×SSC에 3분 동안 옮기고 다시 3분 동안 더 처리한 다음, 각 에탄올 코플란 자(coplan jar)에서 2분씩 처리해야 합니다. 프로브 하이브리드화를 위해서는 단일 DNA 가닥으로 작업하는 것이 필수적입니다. 이를 위해 프로브를 추가하기 전, 폼아마이드 용액에서 73°C로 5분간 배양하는 변성 단계가 필요합니다. 슬라이드 처리를 마무리하기 위해, 각 코플란 자에서 슬라이드를 1분 동안 담그는 최종 에탄올 용액 전이 과정이 필요합니다.

이제 슬라이드는 임상 진단을 위해 수행되는 FISH 연구의 하이브리드화 단계에 사용할 준비가 되었습니다. 가장 흔하게 분석되는 염색체로는 성염색체와 13번, 18번, 21번 염색체가 있습니다. 이러한 염색체들을 분석하기 위해 Vysis사의 다색 DNA 프로브 키트를 사용하겠습니다.

본 제품은 녹색과 아쿠아색으로 각각 표지된 염색체 X, Y 및 18의 알파 위성 영역(alpha satellite region)용 프로브 조합이 들어 있는 바이알 하나와, 녹색과 오렌지색으로 각각 표지된 염색체 13 및 21용 프로브 조합이 들어 있는 바이알 하나로 구성되어 있습니다. 첨가하는 프로브 혼합물의 부피는 하이브리드화를 원하는 영역의 크기에 따라 달라지며, 15 by 15 커버 슬라이드 기준으로는 5 µL의 부피면 충분합니다.

두 프로브 혼합물은 사용 편의를 위해 하이브리드화 완충액 내에서 미리 변성되어 있으므로, 탈응축 및 변성 처리된 슬라이드에 직접 첨가할 수 있습니다. 또한 이러한 실험에 사용할 수 있는 광범위한 염색체 및 로커스(locus)용의 다른 상용 프로브들도 준비되어 있습니다. 그러나 일반적으로 이러한 프로브들은 혼합물을 표적 샘플에 첨가하기 전에 사전 변성 처리가 필요합니다.

이러한 상황에서는 제조사의 지침을 따르는 것으로 충분합니다. 대상 영역을 커버 슬라이드로 덮고 고무 시멘트로 밀봉해야 합니다. 그런 다음 슬라이드를 37 °C로 예열된 하이브리드화 챔버에 넣고 해당 온도에서 6~24시간 동안 배양합니다.

프로토콜의 마지막 단계에서는 서로 다른 농도의 생리 식염나트륨 시트르산 용액과 세제 NP 40으로 구성된 두 가지 세척 용액을 사용할 것입니다. 배양 시간이 지난 후, 슬라이드를 하이브리다이제이션 챔버에서 꺼내 고무 시멘트를 제거합니다. 그런 다음 커버 슬라이드를 조심스럽게 떼어냅니다.

보여지는 바와 같이, 슬라이드를 73 °C로 미리 가온한 1차 세척액에 2분 동안 담급니다. 그 후, 실온의 2차 세척액으로 옮겨 1분 더 세척합니다. 이 두 단계의 세척 과정을 통해 비특이적 하이브리드화 신호를 제거할 수 있습니다. 두 번의 세척이 끝나면, 프로토콜의 마지막 단계를 마무리하기 위해 슬라이드가 완전히 건조될 때까지 기다려야 합니다.

이 단계에서 세포 핵의 시각화를 용이하게 하기 위해 대비 염색 제품을 첨가합니다. 이 목적으로 가장 흔히 사용되는 제품 중 하나는 dpi입니다. 첨가하는 부피는 18 by 18 커버 슬라이드를 기준으로 하이브리드화된 영역의 크기에 맞추어 조정해야 합니다.

8 µL의 DPI면 충분합니다. 커버 슬라이드는 매니큐어로 밀봉할 수 있으며, 이제 시료를 시각화할 준비가 되었습니다. 또는 추후 분석 전까지 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.

시각화에 사용할 현미경은 dpi, Texas Red, FITC용 3색 필터와 aqua, FITC, Texas Red용 단색 필터가 장착된 Olympus BX 60 에피 형광 현미경입니다. 3색 필터를 통해 X, Y 및 18번 염색체에 하이브리드화된 표본의 세 가지 염색체 신호를 표시합니다. aqua 단색 필터를 사용하면 18번 염색체의 형광 신호만 시각화할 수 있습니다. 정상적인 모든 정자에서는 이러한 신호가 하나씩 관찰되어야 합니다.

하지만 FITC 전용 단일 밴드 필터를 사용할 때, 일부 정자는 X 염색체에 해당하는 녹색 형광 신호를 나타냅니다. 녹색 신호가 없는 정자는 Y 염색체에 대한 적색 신호를 나타내어야 하며, 이는 Texas red 전용 필터를 통해 특이적으로 시각화할 수 있습니다. 3중 밴드 필터를 통해 1321 하이브리드화를 시각화함으로써, 이 두 염색체의 신호를 구분할 수 있습니다.

녹색 신호는 13번 염색체에 해당하며, FITC용 단일 밴드 필터를 사용하여 특이적으로 시각화할 수 있습니다. Texas Red용 단일 밴드 필터를 통해 21번 염색체의 신호를 특이적으로 시각화할 수 있습니다. 모든 정상 정자는 이 두 가지 프로브 각각에 대해 하나의 신호를 나타내어야 합니다.

요약하자면, 본 프로토콜의 주요 단계는 다음과 같습니다. 다시 한번 강조하지만, 고품질의 연장을 얻기 위해서는 메탄올 아세트산(methanol acetic acid)을 한 방울씩 첨가하여 고정 과정을 정확하게 수행해야 합니다. 응축 해제 과정에서 정자 응집체가 형성되는 것을 방지하려면, 정액 시료의 해당 제품에 대한 반응성에 따라 DTT 용액에서의 배양 시간을 조정해야 합니다.

정자를 DTT에 과도하게 노출시키면 프로토콜 종료 시 신호가 분산될 수 있으며, 반대로 노출이 불충분하면 프로브 하이브리다이제이션이 전혀 일어나지 않아 일부 신호가 누락될 수 있습니다. 정자 시료의 변성은 필수적이지만, 프로브 변성은 제조사의 지침에 따라 조정해야 합니다. 하이브리다이제이션 후 진행하는 두 차례의 세척 단계에서는 시간과 온도를 엄격하게 제어하는 것이 중요합니다.

온도가 너무 높거나 세척 시간이 과도하면 일부 신호가 소실될 수 있으며, 반대로 세척이 부족하면 비특이적 신호가 제거되지 않습니다. 마지막으로, 원활한 시각화와 신호 해석을 위해서는 적절한 전용 필터가 장착된 형광 현미경의 사용이 필수적입니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.