Name: 고도 정화 구하기 Toxoplasma gondii Oocysts (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 학습하세요 불연속 세슘 클로라이드 그라디언트를 사용하여 Toxoplasma gondii 오오시스트를 고도 정화하는 방법을 배우세요. 이 기술은 분자생물학 및 조직 배양 실험에 필수적인 고순도 오오시스트를 얻는 데 효과적입니다.

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우리는 기술 및 행정 지원을위한 논문 및 박사 아부 사이드와 린다 Ransick의 기술 검토를 위해 니콜 브링크먼와 마이클웨어 감사하고 싶습니다. 연구 개발 부분 투자와 연구에 공동 자사의 오피스를 통해 미국 환경 보호국은 EP - D - 06-096 Dynamac, 주식 회사 및 관계 부처간 합의 번호 DW - 12 - 92289801-0로하는 계약 번호 아래에 여기에서 설명한 USDA. 이것은 기관 평가의 대상 및 게시를 위해 승인되었습니다. 상호 또는 상용 제품의 언급은 보증 또는 사용에 대한 추천을 구성하지 않습니다. MJS 현재 주소 : Dynamac 주식 신시내티, OH.

<p class="jove_title"&gt; 1. 작업 일반 안전주의 사항<em&gt; T. gondii</em&gt; oocysts</p&gt;<ol&gt;<li&gt;이 작업을 할 때 모든 안전 조치를 수행하는 것이 중요합니다<em&gt; T. gondii</em&gt; oocysts. 대부분의 건강한 개인에서,<em&gt; T. gondii</em&gt; 감염이 쉽게 면역 시스템에 의해 제어되지만, 평생 감염 결과. Immunocompromised 개인 toxoplasmosis 특히 민감한 및 처리해서는 안<em&gt; T. gondii</em&gt; oocysts. 임산부도 처리하지 말아야<em&gt; T. gondii</em&gt; oocysts, 감염이 심각한 출생 결함을 일으킬 수 있기 때문에<sup&gt; 8</sup&gt;.</li&gt;<li<em&gt; T. gondii</em&gt; oocysts은 지정된 장소에서 훈련받은 인력으로 취급해야합니다. 표시 간판<em&gt; T. gondii</em&gt; oocyst 작업이 진행이 지정된 영역을 입력 다른 사람을 경고에 ​​게시해야합니다.</li&gt;<li취급시&gt;와 같은 실험 복을 적절한 개인 보호 장비 (PPE), 일회용 가운, 일회용 장갑, 적절한 눈 보호 또는 얼굴 방패를 착용<em&gt; T. gondii</em&gt; oocysts.</li&gt;<li&gt; 자주 장갑 변경하는 것이 좋습니다. 있는 모든 실험실 장비를 취급하지 마십시오<em&gt; T. gondii</em&gt; oocyst 장갑을 오염.</li&gt;<li함께 작업할 때&gt; 항상 일회용 흡수 라이너 줄지어 금속 autoclavable 트레이를 사용하여<em&gt; T. gondii</em&gt; oocysts. 사용되는 모든 랙, 튜브 등을 확인 일회성 또는 autoclavable 있습니다.</li&gt;<li&gt; 전체<em&gt; T. gondii</em&gt; 폐기물은 적어도 한 시간 동안 두 번 autoclaved해야합니다.</li&gt;<li&gt; 모든 비 일회용 장비는 (랙, 쟁반 등) 또한 적어도 하나의 시간 동안 두 번 autoclaved해야합니다.</li&gt;<li액체 대기음하는 데 사용&gt; 진공 라인은 진공 펌프의 오염을 방지하기 위해 Vacushield ™ 필터에 연결되어 있어야합니다.</li&gt;<li&gt; 모든 영향을 실험실 벤치 정상은 작업을 마친 후 소독해야합니다<em&gt; T. gondii</em&gt; oocysts. 갓 만들어진 10 %의 차아 염소 산염은 후한 작업 영역에 적용하고 건조 허용해야합니다. 지역은 다음 물로 잘 씻어서해야합니다.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. 버퍼 및 솔루션의 준비</p&gt;<ol&gt;<li&gt; 600 ML ddH에서 자당의 752.66 g을 용해하여 자당의 1 패 2.2 M 용액을 준비<sub&gt; 2</sub&gt; O. 휘저어과 자당을 해산하기 위해 가열 저어 접시를 사용하여 부드럽게 열. 일단 완전히 용해, ddH 1 L에 볼륨을 가지고<sub&gt; 2</sub&gt; O. 이것은 최소한 20 분 동안 솔루션을 autoclaving하여 살균 뒤에해야합니다.</li&gt;<li&gt; ddH 700 ML에 트리스 - HCL의 6.05 g 및 3.7 g EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하여 1L TE 버퍼 (50 MM 트리스 - HCL, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 산도 7.2 준비<sub&gt; 2</sub&gt; O, 7.2 산도를 조정 다음 ddH 1 L에 볼륨을 가지고<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;<li&gt; CsCl 그라데이션 들어, TE 버퍼의 103.25 ML과 CsCl의 21.75 g을 추가하여 1.15 (1.15 - CsCl)의 비중과 CsCl의 주식 솔루션을 준비합니다. 솔루션, 1.15 - CsCl 20 ML과 TE 30 ML을 섞는다. 솔루션 B의 경우, 1.15 - CsCl 30 ML 및 페놀 레드 솔루션의 12.5 μl와 TE 20 ML을 섞는다. 솔루션 C 들어, 1.15 - CsCl (표 1) 40 ML과 TE 10 ML을 섞는다.</li&gt;<li&gt; ddH 800 ML에 NaOH의 40g를 용해하여 수산화 나트륨 (NaOH)의 1L 1 N 솔루션을 준비<sub&gt; 2</sub&gt; O. 일단 해산, ddH 1 L에 볼륨을 가지고<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;<li&gt; H의 1 패 2퍼센트 (부피로) 솔루션을 준비<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</subH의&gt; 혼합 20 ML<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; ddH의 980 ML과<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. 자당 플로트</p&gt;<ol&gt;<li&gt;의 배설물 정지 10 ML 추가<em&gt; T. gondii</em&gt; oocysts에 2% H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; 50 ML 원뿔 원심 튜브에. 그것은 배설물 서스펜션과 같이 이전에 설명한 자당의 부양 절차를 통해 미리 처리된 시료를 말합니다 있다고 지적해야합니다<sup&gt; 8</sup&gt;. 배설물 샘플을 처음에 감염된 고양이를 수확하는 경우 그들은 같은 참조 8 설명된 자당 플로트를 통해 처리됩니다. 이 추가 자당 플로트 추가 CsCl 정제 과정 이월 지저분한 이물질을 최소화하고 순수한을 얻을 필요가 있습니다<em&gt; T. gondii</em가능&gt; oocysts.</li&gt;<li&gt; 2 % H를 무력화<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; 배설물로 정지 1 N NaOH 6 ML (3 / 5 볼륨)을 추가하여. vortexing하여 잘 섞는다.</li&gt;<li&gt; 배설물로 정학 1.1 M의 최종 농도를 생성 2.2 M의 자당의 동일한 볼륨 (16 ML)를 추가하고 vortexing하여 잘 섞는다.</li&gt;<li&gt; 조심스럽게 10 ML ddH와 함께 자당 / 배설물 서스펜션을 오버레이<sub&gt; 2</sub&gt; O는 10 ML의 피펫을 사용합니다. 없이 브레이크와 함께 실온에서 20 분 1,200 XG에 현탁액을 원심 분리기.</li&gt;<li&gt; 조심스럽게 상단 물과 계면 레이어를 수집하고 피펫을 소용돌이 치는 않고 공기 물 인터페이스에서 pipetting하여 새 50 ML 원뿔 원심 튜브로 전송할 수 있습니다. 계면 층을 수집하면서 자당의 carryover를 최소화하는 것이 중요합니다.</li&gt;<li&gt; 튜브를 vortexing하여 나머지 자당 / 배설물 펠렛 솔루션을 섞습니다.</li&gt;<li&gt; 반복 3.4 및 3.5 단계를 반복합니다.</li&gt;<li&gt; ddH과 함께 50 ML에 두 oocyst의 계면 솔루션의 볼륨을 가져와<sub&gt; 2</sub&gt; O와 실온에서 10 분 2,000 XG에서 튜브를 원심 분리기.</li&gt;<li&gt; 함께 5 ML TE 버퍼와 풀 oocyst 중지와 각 튜브의 표면에 뜨는 및 resuspend 알약을 대기음. 총 풀링 볼륨은 10 ML해야합니다.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. CsCl 기울기</p&gt;<ol&gt;<li&gt; 신중 18 autoclavable, 무딘 엔드 게이지, 강철 바늘, 그리고 2 웨이 스톱 콕과 함께 50 ML의 주사기를 사용하여 각 레이어를 underlaying하여 50 ML 폴리 카보 네이트 오크 리지 관에서 불연속 CsCl 그라디언트를 준비합니다. 참고 : 페놀 레드가 쉽게 그라디언트 레이어 (표 1)를 구분하는 솔루션 B에 추가됩니다.</li&gt;<li&gt; 천천히 아래 나열된 순서에 따라 튜브에 다음 솔루션을 추가합니다. 이것은 유량 이상 0.5 ML / 초를 초과하지 말아야 것을인지해야합니다.<ol&gt;<liTE / oocyst 서스펜션 샘플&gt; 10 ML</li&gt;<li&gt; 8 ML 솔루션</li&gt;<li&gt; 8 ML 솔루션 B</li&gt;<li&gt; 8 ML 솔루션 C</li&gt;</ol&gt;</li&gt;<li&gt; 4 60 분 °없이 브레이크와 C에 대해 12000 XG에있는 오크 리지 튜브를 원심 분리기. 고정 각도 로터의 사용은 허용하지만, 측면이나 튜브를 따라 최소한의 지저분한 부스러기 얼룩과 정지 샘플에서 oocysts를 더 잘 분리 양동이 결과를 스윙 고속. 얼룩의 정도는 배설물로 정학의 구성에 따라 다릅니다 때문에 그것은 배설물로 정학 매우 더러운 경우이 CsCl 그라디언트을 수행하기 위해 필요할 수 있습니다.</li&gt;<li&gt; 다음 원심 분리, 지저분한 이물질로 오염을 최소화하기 위해 솔루션 A와 B 사이의 흰색 / 불투명 oocyst 포함하는 밴드를 수집, 그라데이션을 방해하지 않고 oocyst 밴드에 직접 가서 10 ML의 피펫을 사용하여 oocyst의 계면를 수집합니다. 새로운 50 ML 원뿔 원심 튜브에 oocyst 계면을 전송합니다. 그것은 씻어 단계 동안 oocysts를 pelleting에 문제를 일으킬 수 있으므로 oocyst 계면를 수집하는 동안 aspirated CsCl 용액의 양을 최소화하기 위해보십시오.</li&gt;<li&gt; ddH의 30-40 ML과 oocysts 와시<sub&gt; 2</sub&gt; O. 브레이크없이 10 분 상온에서 2,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. oocyst 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는를 주의깊게 대기음. 세척 2 개의 번 반복합니다.</li&gt;<li&gt; 최종 세척 끝에 신중하게 뜨는을 대기음 사용까지 4 10 ML 2 % 황산과 저장소에있는 펠렛 ° C를 resuspend. Oocysts 이제 더 이상 조작을위한 준비가되어 있습니다. Oocyst 순도는 샘플의 배설물 파편의 부재에 의해 미세하게 확인하실 수 있습니다.</li&gt;</ol

<ol><li>Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+viable+Toxoplasma+gondii+in+beef%2C+chicken%2C+and+pork+from+retail+meat+stores+in+the+United+States%3A+risk+assessment+to+consumers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of viable Toxoplasma gondii in beef, chicken, and pork from retail meat stores in the United States: risk assessment to consumers.</a> J. Parasitol. 91, 1082-1093 (2005).</li>
<li>Tenter, A. M., Heckeroth, A. R., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+from+animals+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: from animals to humans.</a> Int. J. Parasitol. 30, 1217-1258 (2000).</li>
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</ol>

고도 정화 구하기 toxoplasma gondii</em불연속 세슘 클로라이드 그라디언트로> oocysts

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii은 일반적으로 인간을 감염 의무 세포 protozoan의 병원균이다. 그것은 음식과 물을 통한 질병 발생의 원인과 관련된 잘 apicomplexan 특징이다. 최종 호스트 성적 복제가 높은 전염성과 환경 강한 oocyst 개발에 결과가 발생 고양이 수종입니다. 감염은 토양이나 물에서 오염된 육류 또는 oocysts에서 조직 cysts의 섭취를 통해 발생합니다. 감염은 건강한 개인에서 일반적으로 asymptomatic이지만, 개인 immunocompromised되는 경우 toxoplasmic 뇌염과 죽음을 일으키는 활성화할 수있는 평생 잠재 감염을 초래합니다. 고기 T.으로 오염 gondii의 cysts은 유럽과 미국에서 감염의 주요 원천이되어 있지만, 동물의 관리 및 축산 관행 최근 변경 및 개선 식품 취급 및 처리 절차는 크게 T.의 유행을 감소 고기 1, 2 gondii의 cysts. 그럼에도 불구하고, 인간의 seroprevalence은 오염된 토양이나 oocyst 물에서 해당 노출을 제안하면 가능성이 상대적으로 높은 남아있다. 실제로, toxoplasmosis의 waterborne 발생은 세계적으로 환경 oocyst 양식 중요한 건강 위험 3-5 포즈로 이론 노출을 지원하는보고되었습니다. T.의 유행을 이해에 대한 최신 정보, 연구에 물 및 환경 gondii의 oocysts는 환경 5, 6에서 oocysts를 검색하는 도구의 부족으로 인해 제한됩니다. 이것은 주로 높은 연구 목적으로 감염된 고양이 T gondii의 oocysts 투석을 다수의를위한 효율적인 정화 프로토콜의 부족이다. 이 연구는 쉽게 T.을 정화 수정 CsCl 방법의 개발을 설명합니다 분자 생물 학적 및 조직 문화를 조작 7 적합 감염된 고양이의 배설물에서 gondii의 oocysts.

이 연구는 쉽게 분자 생물 학적 및 조직 문화 조작에 적합 감염된 고양이의 배설물에서 T. gondii의 oocysts를 정화 수정 CsCl 방법의 개발을 설명합니다

고도 정화 구하기 Toxoplasma gondii</em불연속 세슘 클로라이드 그라디언트로> Oocysts

Toxoplasma gondii는 흔히 인간을 감염시키는 절대 세포 내 기생 원충 병원체입니다. 이는 ...와 연관된, 특성이 잘 규명된 아피콤플렉사(apicomplexan)입니다.

Toxoplasma gondii 오오시스트(oocysts)는 일반적으로 감염된 고양이의 분변에서 얻어지며, 부상법(flotation procedure)을 통해 분리되어 부분적으로 정제된 현탁액, 분자 및 조직 배양 형태로 얻어집니다. 그러나 이 기생충에 대한 실험을 수행하기 위해서는 고도로 정제된 오오시스트가 필요합니다. 오오시스트는 수크로스 부상 단계(sucrose flotation step)를 통해 추가로 정제되며, 이때 오오시스트를 재현탁하고 그 위에 수크로스를 층분리한 뒤 물을 얹어 원심분리함으로써 대부분의 분변 물질로부터 오오시스트를 분리합니다.그 후 osis 층을 cesium chloride가 깔린 새 튜브로 옮겨 원심분리합니다. 생성된 뚜렷한 OSIS 밴드를 수집하고 세척하면, 고도로 정제된 teon io assist가 필요한 실험에 사용할 준비가 완료됩니다. 안녕하세요, 저는 미국 환경보호청(EPA) 산하 국립 노출 연구소의 계약 업체인 Dynam의 직원, Sarah Staggs 박사입니다.오늘은 불연속 세슘 클로라이드 밀도 구배법을 사용하여 실험실 감염 고양이의 분변에서 Toxoplasma gondii oocysts를 정제하는 절차를 보여드리겠습니다. 이 절차는 분자 생물학 및 조직 배양 실험에 사용할 oocysts를 분리하기 위해 저희 실험실에서 일상적으로 사용됩니다. 그럼 시작하겠습니다.TG O Osis를 이용한 작업을 시작하기 전에 중요한 안전 고려 사항을 반드시 검토해야 합니다. 면역 저하 상태이거나 임신 중인 사람, 또는 임신을 계획 중인 사람은 톡소플라스마증에 감염될 위험이 있으며, 이는 질병 및 심각한 선천적 결함을 유발할 수 있으므로 해당 병원체를 다루어서는 안 됩니다. 감염 위험을 줄이기 위해 이 실험을 위한 전용 공간을 마련하고, 다른 사람이 방에 들어오기 전에 알 수 있도록 주의 표지판을 게시하십시오.T-One IO 포낭을 다룰 때는 실험복, 일회용 가운, 일회용 장갑과 적절한 보안경 또는 안면 보호구를 반드시 착용하십시오. 장갑을 자주 교체하고, 오염된 장갑으로 장비를 만지지 않도록 주의하십시오. 또한, 일회용 흡수성 라이너가 깔린 금속제 오토클레이브 멸균 트레이 위에서 작업하는 것이 중요합니다.이와 관련하여, 사용할 모든 랙, 튜브 및 기타 장비가 일회용이거나 오토클레이브 멸균이 가능한지 확인하십시오. 일회용이 아닌 품목을 사용하는 경우, 사용 후 1시간 주기 오토클레이브 멸균을 2회 실시하십시오. 또한, 진공 펌프의 오염을 방지하기 위해 모든 진공 라인을 진공 쉴드 필터에 연결하시기 바랍니다.포낭 분리가 완료되면 작업 표면에 10% hypochlorite 용액을 새로 도포하십시오. 용액이 마를 때까지 기다린 후 해당 부위를 물로 여러 번 헹굽니다. 적절한 안전 예방 조치가 모두 완료되면 실험을 진행할 수 있습니다.T Guni OYS 수집에 앞서, 먼저 sucrose, float 및 cesium chloride 구배에 필요한 모든 용액을 준비해야 합니다. 원심분리 단계입니다. 필요한 용액으로는 오토클레이브에서 20분 주기 동안 멸균한 2.2 molar sucrose 용액, pH 7.2의 TE buffer 1L, 1 normal sodium hydroxide 용액, 2% sulfuric acid 용액, 그리고 비중이 1.15인 caesium chloride 스톡 용액이 있습니다.1.15 cesium chloride 스톡 용액은 cesium chloride 밀도 구배를 형성하는 데 사용될 용액 A, B, C를 만드는 데 사용됩니다. 용액 A는 30 mL의 TE와 20 mL의 1.15 cesium chloride 스톡 용액을 혼합하여 만듭니다. 용액 B는 20 mL의 TE와 30 mL의 1.15 cesium chloride 스톡 용액을 혼합한 후, 12.5 µL의 pheno red 용액을 첨가하여 만듭니다. 마지막으로, 용액 C는 10 mL의 TE와 40 mL의 1.15 cesium chloride 용액을 혼합하여 만듭니다.2% 황산에 포함된 10 mL의 T osis 분변 현탁액을 취해 50 mL 원추형 원심분리 튜브로 옮기는 것으로 수크로스 부유법 준비를 시작하겠습니다. 분변 시료는 Dr. JP Duby가 집필한 Toxoplasmosis of Animals and Humans라는 교과서에 이전에 기술된 수크로스 부유법으로 이미 처리된 감염된 고양이의 분변을 사용합니다. 이 추가 단계는 세슘 클로라이드 정제 과정에서 분변 부스러기의 양을 더욱 줄여 T goi 낭종의 최고 순도를 달성하는 데 도움이 됩니다.그 후 분변 현탁액에 1 N 수산화나트륨 용액을 현탁액 부피의 5분의 3만큼 첨가하여 황산을 중화합니다. 볼텍싱(vortexing)을 통해 현탁액을 잘 혼합합니다. 다음으로, 동일한 부피의 수크로스를 첨가하고 볼텍싱으로 현탁액을 잘 혼합합니다.10 mL 피펫을 사용하여 숙로즈 분변 현탁액 위에 2차 증류수 10 mL를 조심스럽게 층이 지도록 가합니다. 작업을 마친 후 튜브를 원심분리기에 넣고 실온에서 1200 ×g로 20분간 원심분리하며, 종료 후 감속 단계(break) 없이 정지시킵니다. 피펫 팁이 팽창하지 않도록 주의하며, 공기-수면 경계면에서부터 피펫을 천천히 내려 상층의 물과 경계면 층을 수집합니다.계면층을 수집할 때 함께 따라오는 sucrose 층의 양을 최소화하는 것이 매우 중요합니다. 이 층들을 새로운 50 milliliter 원추형 원심분리 튜브로 옮기십시오. 튜브를 vortexing하여 남은 sucrose 분변 펠릿 용액을 혼합하십시오.이전의 원심분리 단계에서 수행한 수층 덮개 과정을 한 번 더 반복합니다. 원심분리가 끝나면 상층의 수층과 계면층을 수집하여 새 튜브로 옮깁니다. 2중 증류수를 사용하여 두 개의 oocyst 계면 용액의 부피를 50 milliliters로 맞춥니다.그 다음, 튜브를 상온에서 2000 ×g로 10분 동안 원심 분리합니다. 마지막으로 각 튜브에서 상층액을 흡입하여 제거합니다. 펠렛을 5 mL의 TEA 완충액에 재현탁하고 투석을 수행합니다.이제 오시좀(osis)을 세슘 클로라이드 밀도 구배 단계로 처리할 준비가 되었습니다. 먼저 50 mL 폴리카보네이트 Oak ridge 튜브에 불연속 세슘 클로라이드 구배를 준비하겠습니다. 18 gauge 뭉툭한 끝단의 오토클레이브 가능 스틸 바늘이 장착된 50 mL 주사기를 사용하여 TE와 오시좀이 포함된 현탁액 10 mL를 폴리카보네이트 튜브에 첨가합니다.2방향 스톱콕을 사용하여 다음 솔루션들을 튜브 바닥에 천천히 직접 추가합니다. 솔루션 A 8 mL, 솔루션 B 8 mL, 솔루션 C 8 mL를 순서대로 넣습니다. 이때 유속이 0.5 mL/s를 초과하지 않도록 주의하십시오. 솔루션 B에 포함된 페놀 레드(phenol red)가 구배 층을 구분하는 데 도움이 된다는 점에 유의하십시오.이제 고정각 고속 로터를 사용하여 Oak ridge 튜브를 4°C에서 break 없이 12,000 ×g로 60분 동안 원심분리할 준비가 되었습니다. 원심분리가 완료되면 솔루션 A와 B 사이에 형성된 불투명한 흰색 밴드를 수집합니다. 이 밴드에 ooc assist가 포함되어 있습니다. 10 mL 피펫을 사용하여 기울기 구배를 흐트러뜨리지 않고 ooc assist 밴드로 직접 이동하여 ooc를 수집하십시오.낭포를 수집하는 동안 흡입하는 염화세슘 용액의 양을 최소화하십시오. 과도한 염화세슘은 세척 과정 중 낭포를 펠렛(pellet)으로 만드는 것을 어렵게 할 수 있기 때문입니다. 다음 단계로, OSIS를 새로운 50 milliliter 원뿔형 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이제 O 낭포를 30 to 40 milliliters의 2중 증류수로 세척한 후, 실온에서 2000 ×g로 10분간 가속도 설정 없이 원심분리하십시오. 그 다음, O 낭포 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.세척 과정을 두 번 더 반복하십시오. 마지막 세척이 끝나면 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 펠렛을 10 milliliters의 2% sulfuric acid에 재현탁하십시오. 현미경으로 OSIS를 확인하여 샘플에서 모든 분변 잔해물이 성공적으로 제거되었는지 확인하십시오.이제 오가노이드는 추가 조작이 가능한 상태이며, 사용할 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다. 다음은 미분별 오가노이드를 400배 배율의 미분 간섭 대비 현미경으로 관찰한 모습입니다. 시야에 다량의 분변 오염물이 존재하여 오가노이드를 식별하기 매우 어렵다는 점에 유의하십시오.세슘 클로라이드 밀도 구배 정제 프로토콜을 거친 후 400x 배율에서 관찰한 OISS의 모습입니다. 분변 부유물이 없음을 확인할 수 있습니다. 지금까지 불연속 세슘 클로라이드 구배를 이용하여 실험실 감염묘의 분변에서 Toxoplasma gondii를 정제하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때 모든 안전 지침을 준수하는 것이 중요하며, 각 층을 매우 천천히 추가하여 cesium chloride 기울기를 형성할 때 기울기가 흐트러지거나 섞이지 않도록 항상 주의하십시오. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

앞으로 유전학이 어떻게 분자 수준을 해명하기위한 강력한...

분리하기위한 유전자 스크린 Toxoplasma gondii 호스트 세포 재현의 돌연변이

이 프로토콜은 waterborne의 검출을위한 다른 단계로 접선 흐름 중공 섬유 ultrafiltration 샘플 농도 시스템의 사용 및 열 분해를...

Waterborne를 검색하는 접선 흐름 빈 섬유 Ultrafiltration 및 열 분해 단계를 사용 수정일 EPA 방법 1,623<em&gt; Cryptosporidium</em&gt;과<em&gt; Giardia SPP.</em

이 동영상은 곤충 세포 단백질 용해물에서 재조합 단백질을 분리하는 양이온 교환 크로마토그래피 기술을 보여줍니다.

양이온 교환 크로마토그래피: 순 표면 전하를 기준으로 곤충 세포 용해물에서 표적 재조합 단백질을 분리하는 기술

이 비디오에서는 병원성 기생충 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum)의 두꺼운 벽을 가진 난포낭에서 포자낭을 정제하는 시험관 내 방법을 보여줍니다. 분리된 포자충은 감염 연구에 사용할 수 있습니다.

Cryptosporidium parvum Oocysts로부터 체외 Sporozoite 분리

이 동영상은 인간 장 오가노이드 감염 모델을 개발하기 위한 미세 주입 기술을 보여줍니다. 기생충 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum)의 감염성 포자암(sporozoite) 단계는 오가노이드 내강(lung)에 미세주입됩니다. 오가노이드의 상피 세포에 침입하면 무성 생식과 유성 생식을 거쳐 생명 주기를 완료하고 감염을 퍼뜨립니다.

미세주입을 통해 장 오가노이드에서 기생충 감염을 일으키는 기술

항체의 기능을 측정하는 것은 변형체 falciparum의 말라리아에 대한 내성을 이해하는 열쇠입니다. 이 방법은 가능한 merozoites의 정화 및 유동 세포 계측법에 의해 옵 소닌 의존 식균 작용의 측정에 대해 설명합니다.

높은 수익률 정화<em&gt; 변형체 falciparum의</emOpsonizing 항체 분석 실험에 사용하기 위해&gt; Merozoites

혈액에서 trypanosome 분리의이 방법은 포유류 혈액 세포 보다 덜 부정 되 고 그들의 표면 충전에 따라 다릅니다. 감염 된 혈액은 놓이고 음이온 교환기 열에 치료. 이 방법, 아프리카 trypanosomiasis에 대 한 가장 피팅 진단 면역학, 생물학, 생화학, 제약 및 분자 생물학 수사에 대 한 정화 기생충을 제공합니다.

음이온 교환기 (Diethylaminoethyl-셀 루 로스 열)에 의해 혈액에서 아프리카를 포함 한 세포 외 Trypanosomes의 정화

이 논문에서는 스틸, 형광 이미지 및 고해상도 투과 전자 현미경 이미지를 사용하여 연구되는 크립토코카인 세포 및 아메바의 공동 배양을 준비하기 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 여기에 예시된 것은 정량적 데이터가 이러한 정성적 정보를 보완하는 방법입니다.

크립토코커스-아메바 상호 작용 을 연구할 때 현미경 기술과 형광 읽기의 상호 보완적 사용

우리는 Cryptosporidium parvum에 의하여 인간 장 및 기도 오르가노이드의 감염을 공부하기 위한 난모낭을 준비하고 포자조를 정화하는 프로토콜을 기술합니다. 우리는 장 내 오르가노이드 루멘으로 기생충의 미세 주입 과 오르가노이드의 면역 염색을위한 절차를 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 오르가노이드에서 생성 된 난모낭의 격리를 설명합니다.

미세 주입에 의한 3D 조직 유래 인간 오르가노이드 배양 시스템에서 크립토스포리듐 감염 연구

여기에서는 체외 배양 조건, 격리 및 Echinococcus granulosus의 세포외 소포체(EV) 생성 증가에 대해 설명합니다. 소형 EV는 동적 광 산란 및 투과 전자 현미경이 특징이었습니다. 골수 유래 수지상 세포의 흡수와 표현형 조절은 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 연구되었습니다.

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus(Echinococcus granulosus에서 작은 세포외 소포의 분리 및 수지상 세포 흡수)

학습하세요 불연속 세슘 클로라이드 그라디언트를 사용하여 Toxoplasma gondii 오오시스트를 고도 정화하는 방법을 배우세요. 이 기술은 분자생물학 및 조직 배양 실험에 필수적인 고순도 오오시스트를 얻는 데 효과적입니다.

고도 정화 구하기 Toxoplasma gondii Oocysts

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