유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리

RNA 분리를 시작하고 충분한 수율을 얻기 위해, 제브라피시 배아 50개를 마이크로 퓨즈 튜브 모르타르로 옮깁니다. 충분히 균질화한 후, 우선 triol 시약과 클로로포름을 사용하여 RNA를 추출합니다. 그 다음, Qiagen RNEZ minikit를 사용하여 RNA를 세척 및 정제함으로써 향후 응용 및 장기 보관을 위한 고품질의 비분해 총 RNA를 얻습니다.

RNA는 더 안정적인 cDNA 생성물로 합성됩니다. cDNA는 원래의 RNA 템플릿 가닥을 제거하기 위해 정제됩니다. 안녕하세요, 저는 퍼듀 대학교 보건과학과 Jennifer Freeman 박사님 연구실의 Sam Peterson입니다.

오늘은 제브라피쉬 배아 전체에서 고순도의 RNA를 추출하여 cDNA 산물로 전환하는 방법을 보여드리겠습니다. 일반적으로 이 절차는 유전자 발현 프로파일을 연구하는 데 사용됩니다. 그럼 시작하겠습니다.

RNA를 다룰 때는 RNA가 없는 환경에서 작업하는 것이 매우 중요합니다. RNA 실험 전용 피펫을 별도로 지정해 사용하고, 총 RNA 추출을 시작하기 전 작업 영역에 RNase 제거제를 분사하는 등의 간단한 예방 조치를 취하십시오. 추출 작업을 시작하려면 흄 후드 내에서 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 제브라피쉬 배아 50개를 넣습니다. 물을 최대한 제거한 후, 페놀이 포함된 Trizol 시약 250 µL를 즉시 첨가합니다.

펠렛 페스틀(pellet pestle)을 사용하여 조직이 충분히 분쇄될 때까지 배아를 약 20회 정도 갈아서 균질화합니다. 그런 다음 triazole 시약 750 µL를 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양하여 핵 단백질 복합체가 완전히 해리되도록 합니다. 5분이 지나면 chloroform 0.2 mL를 첨가하고 튜브를 15초 동안 흔들어 섞은 후, 시료를 실온에서 2분 동안 배양하고 4 °C에서 12,000 G로 15분 동안 원심분리합니다.

혼합물은 하단의 붉은색 페놀 클로로포름 층, 중간층, 그리고 무색의 상단 수용액 층으로 분리됩니다. 상단 층의 두께는 약 0.6 millimeters이며 RNA를 포함하고 있습니다. 약 0.6 millimeters의 상단 수용액 층 전체를 새로운 마이크로 FUZE 튜브로 옮기십시오. 중간층이 섞여 들어가지 않도록 주의하며, RNA를 침전시키기 위해 0.5 milliliters의 isopropanol을 첨가하십시오.

상온에서 10분 동안 방치한 후, 샘플을 4°C에서 12,000 G로 10분 동안 원심분리합니다. RNA는 겔 형태의 펠릿을 형성해야 합니다. 펠릿이 섞이지 않도록 상층액을 제거하고, 1 mL의 75% ethanol을 첨가한 후 부드럽게 전도 혼합하여 세척하고, 4°C에서 7,500 G로 5분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후, 에탄올을 제거하고 튜브를 뒤집어 10분 동안 건조합니다. RNase-free water 100 µL를 첨가하고 55 °C에서 10분 동안 배양하여 펠렛을 재현탁합니다. RNA의 재수화를 돕기 위해 손가락으로 자주 볼텍싱합니다.

배아에서 RNA를 추출하였으므로, RNA 정제 및 DNA 처리 단계를 진행하십시오. RNA를 정제하려면 Rogen RN easy mini kit를 사용하십시오. 처음 사용할 때는 흄 후드 내에서 버퍼 RPE 1부피당 100% ethanol 4부피를 추가하십시오.

Buffer RLT 1 mL당 10 µL의 beta me capto ethanol을 첨가합니다. 그 다음, 샘플에 Buffer RLT 350 µL와 100% ethanol 250 µL를 넣고 피펫팅을 여러 번 반복하여 혼합한 후, 샘플 전체를 2 mL 컬렉션 튜브에 장착된 R and easy column으로 옮깁니다. 상온에서 8,000 ×g로 1분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 통과액(flow through)을 버리고 스핀 컬럼에 Buffer RW1 700 µL를 첨가합니다.

8,000 G에서 1분 동안 다시 원심분리하고, 상층액을 제거하여 샘플에서 DA를 제거합니다. 이어서 RNA-free DNA 키트를 사용하여 DNA를 처리합니다. 키트를 수령한 후, DNA에 550 µL의 nuclease free water를 첨가하고 부드럽게 뒤집어 섞어준 뒤, 스톡 용액을 10 µL씩 분주하여 -20 °C에서 냉동 보관합니다.

부드럽게 반전 혼합한 10 µL의 DNA stock solution에 70 µL의 buffer RDD를 첨가하고, 짧게 원심분리한 후 R and easy spin column A에 직접 첨가합니다. DNA 처리물을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음, spin column에 350 µL의 buffer RW one을 첨가하고 실온에서 8,000 G로 1분간 원심분리한 뒤, 통과액(flow through)을 버리고 spin column에 500 µL의 buffer RPE를 첨가합니다. 샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다.

상온에서 8,000 G로 1분간 다시 원심분리하고, 통과액을 버린 후 스핀 컬럼에 75% ethanol 500 µL를 첨가합니다. 8,000 G로 원심분리를 반복하되 상온에서 2분간 수행하며, 원심분리 후 통과액을 버리고 즉시 컬럼을 5분 동안 건조시킵니다. 남아있는 ethanol 흔적을 제거하기 위해 상온에서 8,000 G로 5분간 원심분리합니다.

이제 스핀 컬럼을 새로운 1.5 milliliter 수집 튜브로 옮기고 nuclease free water 10 microliters를 추가합니다. RNA를 용출시키기 위해 1분 동안 배양한 후 10,000 G에서 1분 동안 원심분리합니다. 실온에서 RNA는 통과액(flow through)에 포함됩니다. 10 microliters의 물을 더 사용하여 용출 과정을 반복합니다.

제조사의 지침에 따라 NanoDrop ND 1000 분광광도계를 사용하여 RNA의 양과 질을 확인합니다. 또한, 변성 젤 전기영동을 수행하거나 Agilent 2100 bioanalyzer를 사용하여 RNA의 무결성을 확인합니다. RNA의 질과 양이 만족스러운 경우, cDNA 합성을 진행합니다.

마지막으로, cDNA 합성을 수행할 때까지 RNA를 -80 °C에서 보관하십시오. RNA 프라이머의 각 성분을 혼합하고 짧게 원심 분리하여 cDNA 합성을 시작합니다. RNA, dNTPs 및 oligo dT를 혼합하십시오.

각 성분을 멸균된 0.5 mL 마이크로 튜브에 총 부피가 10 µL가 되도록 추가합니다. 구체적인 부피는 동봉된 서면 프로토콜을 참조하십시오. 그런 다음 시료를 65 °C에서 5분 동안 배양합니다.

샘플이 냉각되는 동안, 동반된 서면 프로토콜에 설명된 대로 총 9 µL의 버퍼 마스터 믹스를 준비하며, 샘플을 즉시 얼음 슬러리에 10분 동안 옮깁니다. 냉각 후, 버퍼 마스터 믹스와 RNA 프라이머 혼합물을 결합하여 부드럽게 섞고, 짧은 원심분리로 수집합니다. 다음으로, 결합된 샘플을 써모사이클러에 넣고 42 °C에서 2분 동안 배양합니다.

역전사를 시작하려면, 튜브에 superscript two RT 1 µL를 첨가하고 혼합합니다. 42 °C에서 1시간 동안 계속 배양합니다. 70 °C에서 15분간 처리하여 반응을 종료합니다.

그런 다음 샘플을 4 °C로 냉각하고 얼음 수조로 옮깁니다. 샘플에 RNase H 1 µL를 첨가하고 37 °C에서 20분 동안 배양합니다. RNase H가 RNA 템플릿을 분해하여 단일 가닥 cDNA 생성물만 남게 됩니다. 이제 cDNA 합성이 완료되었으며, 추가적인 정제 및 농축 단계만 필요합니다. cDNA 생성물을 분리하기 위해, 12,000 ×g에서 2분 동안 원심분리하여 1.5 mL Phase Lock Gel 튜브를 준비합니다.

모든 겔이 튜브 바닥에 위치해야 합니다. pH 8.0으로 완충된 tris 포화 페놀 81.5 µL, 24:1 클로로포름-이소아밀 알코올 81.5 µL 및 샘플을 phase lock 겔 튜브에 넣고 부드럽게 뒤집어 여러 번 혼합합니다. 샘플을 실온에서 12,000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. cDNA는 상층의 수용액층에 위치해야 합니다.

약 20 µL인 상층액을 깨끗한 1.5 mL 마이크로 튜브로 옮깁니다. cDNA를 침전시키기 위해 pH 5.2의 3 M sodium acetate 2 µL를 첨가하고 부드럽게 섞어줍니다. 5 mg/mL glycogen 7 µL를 첨가하고 부드럽게 섞어줍니다.

그 다음 이소프로판올 30 µL를 첨가하고 부드럽게 섞은 뒤, 샘플을 상온에서 10분 동안 배양합니다. 이어서 상온에서 12,000 G로 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 튜브 바닥에 작은 cDNA 펠렛이 나타납니다.

피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 70% ethanol 500 µL를 첨가하여 펠렛을 세척하고 도립 혼합합니다. 샘플을 12,000 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 피펫으로 상층액을 제거합니다.

세척 과정을 반복하고, 에탄올을 추가하여 원심분리한 후 상층액(SUP natant)을 제거합니다. 두 번째 세척 후, 튜브를 짧게 원심분리하여 남아 있는 액체를 모읍니다. 과잉 액체를 제거하고 펠렛을 실온에서 5분 동안 건조시킵니다.

그런 다음 20 µL의 nuclease free water를 첨가하여 펠릿을 재수화합니다. 샘플을 55 °C에서 5분 동안 둡니다. 재수화된 CD NA는 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.

마지막으로, 제조사의 지침에 따라 nano drop ND 1000 분광광도계를 사용하여 cDNA 산물의 양과 질을 확인합니다. 제브라피시 배아 50개로부터 RNA를 추출 및 정제하면 일반적으로 NanoDrop ND 1000 분광광도계 측정 시 약 15 µg의 고품질 총 RNA가 얻어지며, 260/280 흡광도 비는 약 1.9에서 2.0 사이입니다. 추출된 RNA의 무결성은 변성 RNA 겔을 사용하여 평가합니다. RNA는 18S 및 28S 리보솜 RNA에 해당하는 두 개의 밝은 밴드가 포함된 스미어 형태로 나타납니다.

28 S 밴드의 강도는 18 S 밴드보다 약 2배 더 강해야 합니다. 또는, Agilent 2100 bioanalyzer를 사용하여 RNA 무결성을 평가할 수 있습니다. 이때 18 S 및 28 S 리보솜 RNA에 해당하는 두 개의 날카로운 피크가 관찰됩니다.

28 s 피크가 18 s 피크보다 더 커야 합니다. 5 µg의 총 RNA를 역전사하면 NanoDrop ND 1000으로 측정했을 때 통상적으로 1~2 µg의 cDNA가 생성됩니다. cDNA의 260 nm 대비 280 nm 흡광도 비율은 약 1.8입니다.

지금까지 제브라피시 배아 전체에서 총 RNA를 분리하고, 해당 RNA를 cDNA 생성물로 전환하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 RNase가 없는 환경을 유지하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 마치겠습니다.

시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.