Name: 유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-07T16:40:00.000+00:00
Duration: 15 min 21 s
Description: 배우세요 제브라피시 배아에서 고품질 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하는 방법을. 이 프로토콜은 유전자 발현 마이크로어레이 분석을 위한 신뢰할 수 있는 분자생물학 기술을 제공합니다.

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1 부 : TRIzol 시약을 사용하여 총 RNA의 추출 RNA와 함께 작업하는 경우가 RNAses 무료입니다 환경에서 작동하는 것은 매우 중요합니다. 이러한 RNA 절차에만 사용하기 위해 예약된 pipettes가 발생하고 절차를 시작하기 전에 decontaminant 시약 (예 : RNAse 거리)로 작업 영역을 분사와 같은 간단한주의 사항은 매우 도움이됩니다. <ol><li> 1.5 ML의 microfuge 튜브에 RNA 수영장 50 zebrafish의 배아 충분한 양의 달성하고 피펫과 함께 가능한 한 많은 물을으로 제거하려면 다음과 같이하십시오. </li><li> 바로 배아를 포함하는 microfuge 튜브에 TRIzol 시약 1 250 μl를 추가합니다. TRIzol 시약은 페놀이 포함되어 있습니다 단 퓸 후드에서 사용해야합니다. </li><li> 조직이 충분히 교란 때까지 펠렛 유봉 (약 20 치기)와 배아를 Lyse 및 균질. </li><li> 세포가 충분히 균질 경우 1 ML 총 볼륨을 동일하기 위해 750 μl TRIzol 시약을 추가합니다. </li><li> 핵 단백질의 단지의 완전한 분리를 허용하려면, 실온에서 5 분 균질 샘플을 품어. 이 단계에서는 예제 플래시 액화 질소에 냉동 및 -80 ° C에서 또는 프로토콜이 계속 수 있습니다 저장할 수 있습니다. </li><li> 클로로포름의 0.2 ML를 추가 계속 믹스 15 초 동안 튜브를 일으키고. </li><li> 4 15 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기 다음 상온에서 2 분 동안 샘플을 품어하고 ° C. </li><li> 혼합물은 낮은 붉은 페놀 - 클로로포름 위상, 계면 및 무색 위 수성 단계로 구분됩니다. 위 수성 단계는 RNA가 포함되어 있습니다. 상위 레이어는 TRIzol (약 0.6 ML)의 초기 부피의 약 60 %를 구성한다. 계면 층 중 하나를 전송하지 않도록주의하는 1 ML의 피펫을 사용하여 새 microfuge 튜브로 가기 수성 레이어를 전송합니다. </li><li> RNA는 0.5 ML 이소프로판올를 추가 촉진합니다. </li><li> 샘플 10 분 실온에서 앉아 후 4 10 분 12,000 XG에서 샘플을 원심 수 있도록 허용 ° C. RNA는 튜브의 바닥에 젤 같은 펠렛을 형성합니다. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고, 피펫으로 뜨는을 제거하고 한 ML 75 % 에탄올에 펠렛 씻으십시오. 4 5 분 7500의 XG에 부드러운 역전과 원심 분리기에 의해 샘플을 혼합 ° C. </li><li> 원심 분리 후 피펫으로 에탄올을 제거하고 10 분 동안 거꾸로 샘플 건조 수 있습니다. </li><li> RNAse없는 물 100 μl를 추가하여 펠렛을 Resuspend 55에서 샘플을 품어 ° C를 10 분. 이것은 RNA의 rehydration에 도움을 배양하는 동안 자주 와동을 손가락을 권장합니다. 선택, 당신은 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 샘​​플의 품질과 수량을 확인하거나 직접 다음 단계를 계속합니다. </li></ol> 2 부 : Qiagen RNEasy 미니 키트를 사용하여 RNA 정리 Qiagen RNEasy 미니 키트 2 다른 방법에서 분리된 RNA 샘플에서 오염 물질 및 불순물을 제거하는 데 유용합니다. 이 절차에 대한, β - 메르 캅 토 에탄올, 에탄올, 그리고 nuclease없는 물이 키트에 포함된 구성 요소에 추가로 필요합니다. 옵션 DNAse 치료는이 절차를 수행하는 동안 권장합니다. <ol><li> 키트의 처음 사용시, 버퍼 RPE는 버퍼 RPE 1 볼륨에 100 % 에탄올 4 볼륨을 추가하여 준비해야합니다. </li><li> 절차의 날, 버퍼 RLT 신선한 준비해야합니다. 필요한 것입니다 버퍼 RLT의 총 금액을 계산합니다. 350 μl의 볼륨 샘플마다 필요합니다. 버퍼 RLT를 준비하려면, 버퍼의 모든 1 ML에 대한 β - 메르 캅 토 에탄올 10 μl를 추가합니다. 이것은 퓸 후드 아래에 완료해야합니다. </li><li> 각 견본 버퍼 RLT 350 μl와 100 % 에탄올 250 μl를 추가합니다. 몇 시간을 아래와 pipetting으로 잘 섞는다. </li><li> 실온에서 1 분 8,000 XG에 2 ML 수집 관과 원심 분리기에 배치됩니다 RNEasy 열에 약 700 μl되어야 샘플을 전송합니다. </li><li> centrifuging 후,을 통해 흐름을 버리고 RNEasy 스핀 열 버퍼 RW1 700 μl를 추가합니다. </li><li> 실온에서 1 분 8,000 XG에서 샘플을 원심 다음을 통해 흐름을 폐기. </li><li> Qiagen RNAse - 무료 DNAse 키트와 함께 DNAse 치료 : DNAse 치료는 선택 사항이지만 매우 최고 품질의 샘플을 권장합니다. <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> 먼저 DNAse 처리 키트를받을 때, 당신은 DNAse에 550 μl nuclease 무료 물을 추가하여 DNAse I 주식 솔루션을 준비해야합니다. 반전에 의해 부드럽게 섞어 와동하지 않습니다. 주식 솔루션 10 μl를 포함하는 단일 사용 유리병으로 나누어지는. 당신은 최대 9개월까지 -20 ° C에서 재고 솔루션을 저장할 수 있습니다. 해동 aliquots는 ° C 6주 필요한 경우 4 저장할 수 있지만, 해동 후 aliquots를 refreeze하지 않습니다. </li><li> 준비하는 DNAse I 보육 혼합 10 μl DNAse I s의 RDD 70 μl 버퍼를 추가샘플마다 째깍 솔루션입니다. 부드러운 역전과 원심 분리기 튜브의 혼합 간략 잔여 액체 형태 튜브의 측면을 수집합니다. 직접 RNEasy 스핀 컬럼 80 μl DNAse I 보육 믹스를 추가합니다. 실온에서 30 분 DNAse 치료를 품어. </li></ol></li><li> 다음 DNAse 치료는 상온에서 1 분 8,000 XG에서 스핀 컬럼 및 원심 분리기 350 μl 버퍼 RW1를 추가합니다. </li><li> 원심 분리는을 통해 흐름을 버리고 스​​핀 컬럼 500 μl 버퍼 RPE를 추가한 후. 상온에서 5 분 샘플을 품어. </li><li> 실온에서 1 분 8,000 XG에 샘플을 원심 분리기와를 통해 흐름을 폐기. </li><li> 원심 분리 후 스핀 컬럼 500 μl의 75 % 에탄올을 추가합니다. </li><li> 8,000 XG에서 원심 분리를 반복하지만, 상온에서 2 분. </li><li> 원심 분리는을 통해 흐름을 버리고 열에 5 분 동안 건조 후 수 있습니다. </li><li> 즉시 에탄올 성분 이상 남아를 제거하는 상온에서 5 분 8,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후 전송이 완료되었습니다는 새로운 1.5 ML 수집 관에 스핀 컬럼입니다 10 μl nuclease 무료 물을 추가합니다. 실온에서 1 분 10,000 XG에 원심 분리기 다음 1 분 부화합니다. RNA가 통과 흐름있을 것입니다. </li><li> 스핀 컬럼에 nuclease없는 물의 또 다른 10 μl를 추가하고 1 분 상온에서 알을 품다. 실온에서 1 분 10,000 XG에 샘플을 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후 제거하고 스핀 컬럼을 폐기. RNA는을 통해 흐름을있을 것입니다. </li><li> 제조 업체의 지침에 따라 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 RNA의 수량과 품질을 확인하십시오. </li><li> 또한, denaturing 젤을 실행하거나 RNA의 무결성을 확인하는 애질런트 2100 bioanalyzer을 사용합니다. </li><li> cDNA 합성을 수행할 수 있습니다 ° C까지 샘플은 -80에서 보관해야합니다. </li></ol> 파트 3 : Invitrogen 윗첨자 첫번째 - 스트랜드 시스템을 사용하여 cDNA 합성 RNA는 저하로 이어지는 RNAses에 의해 절단 쉽게 경향이있다. 결과적으로 많은 유전자 발현 프로토콜 직접 RNA로부터 합성되어보다 안정적인 cDNA 제품을 사용하기 위해 개발되었습니다. Invitrogen 어깨 첫번째 - 스트랜드 합성 시스템 3을 사용 처음 가닥 cDNA의 여기 상세 합성. 각 cDNA 합성 반응은 RNA의 5 μg 수용할 수 있습니다. <ol><li> 프로 시저 믹스를 시작하기 전에하고 잠시 각각의 구성 요소를 원심 분리기. </li><li> 로 표 1에 명시된 멸균 0.5 ML의 microfuge 튜브에 RNA / 프라이머 혼합물을 준비합니다. </li><li> ° C 5 분 65 샘플을 품어. </li><li> 즉시 10 분 동안 얼음 슬러리에 샘플을 전송할 수 있습니다. </li><li> 예제는 표 2에 나와있는 구성 요소 마스터 믹스를 준비 냉각되는 동안. 볼륨은 1 반응 당 나열되어 있습니다. 반응의 총 개수에 대한 적절하게 볼륨을 조정합니다. </li><li> 냉각 후, 각각의 RNA / 프라이머 혼합물을 5 단계에서 준비한 마스터 믹스 9 μl를 추가합니다. 부드럽게 혼합 및 간단한 원심 분리하여 수집합니다. 각 샘플의 총 부피는 19 μl해야합니다. </li><li> thermocycler 2 분 42 ° C에서 샘플을 품어. </li><li> 각 튜브에 어깨 II RT 1 μl를 (50 세대) 추가 혼합하고, 42 품어 ° thermocycler 60 분 C. </li><li> 70 반응을 종료 후 15 분 ° C 4 ° C.에 냉기 샘플 thermocycler은 단계 8과 9 프로그래밍할 수 있습니다. </li><li> 샘플 4 ° C에 도달 후 얼음 목욕에 반응을 전송합니다. </li><li> 얼음에있는 각 튜브에 RNAse H 1 μl를 추가하고 37 20 분 동안 품어 ° C. 총 볼륨 이제 21 μl입니다. 샘플에 RNAse H의 추가는 RNA 템플릿을 저하만을 단일 가닥 cDNA 제품을 떠날 것입니다. </li></ol> 4 부 : cDNA 분리 및 강수량 <ol><li> 1.5 ML 위상 잠금 겔 튜브는 cDNA 제품의 절연에 사용됩니다. 2 분 동안 12,000 XG에서 원심 분리하여 1.5 ML 위상 잠금 겔 튜브를 준비합니다. 젤은 모든 튜브의 하단에 있어야합니다. </li><li> 위상 잠금 겔 튜브로 (21 μl), (트리스 - 포화 산도 8.0 버퍼) 81.5 μl 페놀 24:1 클로로포름 isoamyl 알콜의 81.5 μl, 그리고 샘플을 추가합니다. 부드러운 역전에 의해 여러 번 섞는다. </li><li> 실온에서 5 분간 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> cDNA는 위 수성 단계에 있어야합니다. 깨끗한 1.5 ML의 microfuge 관으로 상위 단계를 전송합니다. 총 부피는 20 μl 주위해야합니다. </li><li> 3 M NaOAc, 산도 5.2의 1X 볼륨을 추가하고 부드럽게 섞는다. 상단 수성 단계의 볼륨을 20 μl와 동일 경우 예를 들어, 3 M NaOAc, 산도 5.2 2 μl를 추가해야합니다. </li><li> 5 MG / ML 글리코겐 7 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 이소프로판올의 1X 볼륨을 추가하고 부드럽게 섞는다. 일반적으로이 주위에 이소프로판올 30 μl입니다. </li><li> 샘플 룸 temperatur에서 부화 허용다음 10 분 전자하고 실온에서 20 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 작은 cDNA 펠렛은 튜브의 바닥에 서식한다. 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거합니다. </li><li> 70 % 에탄올과 역전의 믹스 500 μl를 추가합니다. </li><li> 5 분 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 원심 분리는 피펫으로 뜨는을 제거하고 70 % 에탄올 세척 및 원심 분리를 (단계 10 11) 반복 후. </li><li> 원심 분리 후 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 튜브의 측면에 남은 액체가있다면, 그것은 간단히 튜브를 회전하여 수집하실 수 있습니다. 초과 액체를 제거하고 펠릿 5 분 동안 상온에서 건조하실 수 있습니다. </li><li> 펠렛을 rehydrate하는 nuclease없는 물을 20 μl를 추가합니다. 펠렛의 rehydration 5 분 55 ° C에서 샘플을 놓으십시오. </li><li> cDNA 제품의 수량과 품질은 다음 제조 업체의 지침에 따라 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 검사합니다. cDNA는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol> 대표 결과 RNA 정리 후,​​ 고품질의 총 RNA의 약 15 μg 50 zebrafish의 배아에서 기대하실 수 있습니다. 총 RNA 품질, 분광 광도계, 젤 전기 영동 및 애질런트 2100 Bioanalyzer을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. NanoDrop ND - 1000 분광 광도계는 280 nm의 (그림 1)에서 흡광도에 비해 260 nm의 흡광도에서를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 260 / 280 비율은 오염 물질의 존재를 공개 가능한 열화의 증거를 제공할 수 있습니다. 260 / 1.9-2.0의 280 비율 허용으로 간주됩니다. 또한, 그것은 매우 RNA의 변성 젤이 RNA의 무결성을 평가하기 위해 실행하는 것이 좋습니다. RNA의 가닥은 작은 가닥이 젤 아래 추가로 마이 그 레이션과 함께, 그들의 크기의 기준으로 구분됩니다. 비 저하 샘플 두 개의 강한 밴드와 얼룩으로 나타납니다. 얼룩은 서로 다른 크기의 mRNA의 가닥이 인구의 결과이며 밴드는 28S와 18S rRNA에 대응. 28S 밴드는 18S 밴드 (그림 2)에 대한 두 배나 강렬해야합니다. 또는, 총 RNA의 무결성 애질런트 2100 bioanalyzer를 사용하여 평가하실 수 있습니다. 28S와 18S rRNA를 나타내는 별개의 두 봉우리는 (그림 3) 예정입니다. 28S 피크는 봉우리 아래 면적 정상 18S 약 2시 1분, 각각보다 큰해야합니다. 별개의 두 봉우리가 저하 샘플에서 관찰되지 않습니다. 저하를 전시 RNA 샘플은 후속 실험 절차를 통해 수행해서는 안됩니다. 분광 분석은 cDNA 제품의 품질 (그림 4)을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 260 / 280 1.8 주변한다. 총 RNA의 5 μg의 입력과 cDNA 반응이 일상적으로 우리 연구실에 cDNA 제품 1-2 μg를 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. RNA 샘플의 스펙트럼 NanoDrop. RNA 정리 후, RNA의 수량 및 품질은 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 평가하실 수 있습니다. 고품질의 전체 RNA의 약 15 μg는 정기적으로 1.9-2.0 주변 260 / 280의 비율로 50 zebrafish 배아에서 굴복이다. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. RNA의 변성 젤. 총 RNA 격리의 무결성을 평가하려면, RNA의 변성 젤을 실행하실 수 있습니다. 28S 및 18S rRNA에 대응하는이 밝은 밴드와 얼룩이 예상된다. 28S 밴드는 약 두 번 18S 밴드로 강렬한으로해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 총 RNA 격리의 무결성을 평가 bioanalyzer에서.하려면 RNA 샘플의 흔적은 샘플도 애질런트 2100 bioanalyzer에 분석할 수 있습니다. 28S와 18S rRNA의에 해당하는 두 개의 날카로운 봉우리는, 표시해야합니다. 28S 피크는 봉우리 아래 면적 정상 18S 약 2시 1분, 각각보다 큰해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. cDNA 샘플의 스펙트럼 NanoDrop. NanoDrop ND - 1000과 분광 분석은 cDNA 제품의 수량과 품질을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 260 / 280 비율은 1.8 주위해야합니다. 총 RNA의 5 UG의 입력과 cDNA 반응이 일상적으로 우리 연구실에 cDNA 1-2 UG를 얻을 수 있습니다. 표 1. 구성 요소 cDNA 합성 단계 중 2 단계에서 RNA / 프라이머의 혼합물을 위해 추가할 수 있습니다. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 음량 </td></tr><tr><td> 총 RNA (최대 5 μg) </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> 10 MM dNTP 믹스 </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> Oligo (DT) 12-18 (0.5 μg / μl) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> DEPC - 처리된 물 </td><td> N의 μl </td></tr><tr><td> 총 부피 </td><td> 10 μl </td></tr></tbody></table> cDNA 합성 단계 5 표 2. 반응 혼합물. 나열된 볼륨 반응 당 수 있습니다. 반응의 총 개수에 대한 각 구성 요소의 볼륨을 높이십시오. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 음량 </td></tr><tr><td> 10X RT 버퍼 </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> 25 MM MgCl2 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> 0.1 MM DTT </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22TRIzol+Reagent+Manual%22">TRIzol Reagent Manual</a>. , (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNEasy+Mini+Handbook%22">RNEasy Mini Handbook</a>. , 4th ed, (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+First-Strand+Synthesis+System+for+RT-PCR%22">SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR</a>. , Version E. (2003).</li>
</ol>

저자들은 공개할 이해관계가 없습니다.

RNA 분자의 취약성이 프로토콜을 통해 기억되어야하는 가장 중요한 고려 사항이다. RNAse - 무료 살균 장비는 항상 연구실의 RNAse없는 영역에서 사용해야합니다. 단 RNA 절차에 사용하는 실험실의 일부를 예약하는 것이 도움이 그것입니다. 이 지역은 자주 자리 비움 같은 RNAse으로 RNAse 제거 제품과 뿌렸해야합니다. RNA 샘플은 항상 장갑을 착용 한채로 처리하고 저하를 방지하기 위해 얼음에 보관해야합니다. 이 프로토콜은 상용 시약 및 키트를 이용했다. 또한, 다양한 추가 시약 및 총 RNA의 isolations을위한 시장에서 사용 가능한 RNA 분리 키트가 없습니다. 이 프로토콜에 포함된 시약 및 키트는 잘 작동하고 정기적으로 저희 연구실에서 고품질의 RNA를 굴복했습니다. 대안으로, 이중 좌초 cDNA 합성 대신이 프로토콜에서 보여준 최초의 스트랜드 합성의 수행할 수 있습니다. 그것이 증가 안정성을 제공하는 ...

<table><tbody><tr><td>글라이코겐 (5 mg/ml)</td><td>Ambion</td><td>9510</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브용 펠릿 페스틀</td><td>VWR international</td><td>KT749520-0090</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Light, 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>2302800</td><td></td></tr><tr><td>페놀, Tris 포화</td><td>Roche Group</td><td>3117944001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>VWR international</td><td>17810-491</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-Free DNase 세트</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNEasy Mini 키트</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR용 SuperScript&amp;#174; First-Strand Synthesis 시스템</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 발현 분석을위한 배아 zebrafish 및 cdna 합성에서 rna 격리

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

대부분의 중요하고 복잡한 실험 절차는 고품질, 손상 RNA의 입력을 필요로합니다. 타락한 샘플이나 불순물의 존재는 하류 실험 응용 프로그램에서 치명적인 결과를 초래할 수 있습니다. 그것은 우수한 샘플을 보장하기 위해 다양한 안전 및 품질 관리 검사와 견고한 기술을 사용하는 가장 중요 따라서이다. 여기에, 우리는 세부 상업 RNA 분리 키트를 사용하여 DNA와 불순물의 흔적을 제거하는 상용 화학 denaturant 이후 정리를 사용하여 전체 zebrafish의 배아에서 총 RNA를 분리하는 프로토콜. RNA는 상대적으로 불안정하고 RNAses에 의해 절단 쉽게 경향이 있으므로, 대부분의 프로토콜 분석 유전자 발현 직접 RNA의 템플릿에서 합성되는 cDNA 제품을 사용하고 있습니다. 우리는 세부 절차를 상용 키트를 사용하여보다 안정적인 cDNA 제품에 RNA를 변환합니다. 이러한 절차를 통해 샘플 강등 당하거나 오염되지 않도록하기 위해 다양한 품질 관리 검사가 없습니다. 이러한 프로토콜의 최종 제품은 microarray 분석, RT - PCR 또는 장기 보관에 적합한 것을 cDNA입니다.

양질의 절연이 손상 RNA는 많은 실험실 프로토콜에서 필수적인 단계입니다. 여기, 우리는 전체 zebrafish의 배아 및 유전자 표현 microarray 분석 등 다양한 실험 절차에 후속 응용 프로그램에 대한 cDNA 합성에서 RNA 추출을 보여줍니다.

유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리

수많은 중요하고 복잡한 실험 절차에는 고품질의 무결한 RNA 투입이 필요합니다. 샘플이 분해되었거나 불순물이 포함되어 있으면 ...

RNA 분리를 시작하고 충분한 수율을 얻기 위해, 제브라피쉬 배아 50개를 마이크로 퓨즈 튜브 모타(mortar)로 옮깁니다. 완전히 균질화한 후, 먼저 triol 시약과 클로로포름을 사용하여 RNA를 추출합니다. 그 다음, Qiagen RNeasy mini kit를 사용하여 RNA를 세척 및 정제함으로써, 향후 응용 및 장기 보관을 위한 고품질의 비분해 총 RNA를 얻습니다.RNA는 더 안정적인 cDNA 산물로 합성됩니다. 원래의 RNA 템플릿 가닥을 제거하기 위해 cDNA를 정제합니다. 안녕하세요, 저는 퍼듀 대학교 보건과학과의 Jennifer Freeman 박사 연구실에 소속된 Sam Peterson입니다.오늘은 제브라피쉬 배아 전체에서 고순도 RNA를 추출하여 cDNA 산물로 전환하는 방법을 보여드리겠습니다. 일반적으로 이 절차는 유전자 발현 프로파일을 연구하는 데 사용됩니다. 그럼 시작하겠습니다.RNA를 다룰 때는 RNA가 없는 환경에서 작업하는 것이 매우 중요합니다. RNA 절차 전용 파이펫을 별도로 지정하여 사용하고, 총 RNA 추출을 시작하기 전에 작업 영역에 RNase 제거제를 분무하는 것과 같은 간단한 주의 사항을 준수하십시오. 추출 작업을 시작하려면 흄 후드 내에서 1.5 mL 마이크로 퓨지 모르타르 튜브에 제브라피쉬 배아 50마리를 옮깁니다. 물을 최대한 제거한 후, 페놀이 포함된 TRIzol 시약 250 µL를 즉시 첨가합니다.펠렛 페스틀(pellet pestle)을 사용하여 배아 조직이 충분히 파쇄될 때까지 약 20회 정도 갈아 균질화합니다. 그런 다음 750 µL의 triazole 시약을 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양하여 핵 단백질 복합체가 완전히 해리되도록 합니다. 5분이 지나면 0.2 mL의 클로로포름을 첨가한 후 튜브를 15초 동안 흔들어 섞고, 시료를 실온에서 2분 동안 배양한 다음 4 °C에서 12,000 G로 15분 동안 원심분리합니다.혼합물은 하층의 붉은색 페놀 클로로포름 층, 중간층, 그리고 상층의 무색 수성 층으로 분리됩니다. 상층은 약 0.6 mm이며 RNA를 포함하고 있습니다. 상층 수성 층 전체(약 0.6 mm)를 새로운 마이크로 튜브로 옮깁니다. 중간층이 섞이지 않도록 주의하며, RNA를 침전시키기 위해 0.5 mL의 이소프로판올을 첨가하고 혼합합니다.실온에서 10분 동안 방치한 후, 샘플을 4°C에서 12,000 G로 10분 동안 원심분리합니다. RNA는 젤 형태의 펠릿을 형성해야 합니다. 펠릿이 흐트러지지 않도록 상층액을 제거하고, 1 mL의 75% ethanol을 첨가한 뒤 부드럽게 뒤집어 섞어 세척하며, 4°C에서 7,500 G로 5분 동안 원심분리합니다.원심분리 후 에탄올을 제거하고 튜브를 뒤집어 10분 동안 건조합니다. 100 µL의 RNase-free water를 첨가하고 55 °C에서 10분 동안 배양하여 펠렛을 재부유시킵니다. RNA의 재수화를 돕기 위해 수시로 핑거 볼텍싱(finger vortex)을 수행합니다.배아에서 RNA를 추출했으므로, RNA 정제 및 DNA 처리 단계를 진행합니다. RNA를 정제하려면 Rogen RN easy mini kit를 사용하십시오. 처음 사용할 때는 흄 후드 내에서 buffer RPE 1부피당 100% ethanol 4부피를 첨가하십시오.Buffer RLT 1 mL당 10 µL의 beta me capto ethanol을 첨가합니다. 그다음 샘플에 Buffer RLT 350 µL와 100% ethanol 250 µL를 넣고 피펫팅으로 여러 번 섞은 후, 2 mL 컬렉션 튜브에 장착된 R and easy 컬럼으로 샘플 전체를 옮깁니다. 상온에서 8,000 ×g로 1분간 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 통과액(flow through)을 버리고 스핀 컬럼에 Buffer RW1 700 µL를 첨가합니다.8,000 G에서 1분 동안 다시 원심분리하고, 상층액을 제거하여 샘플에서 DA를 제거합니다. 이어서 RNA-free DNA kit를 사용하여 DNA를 처리합니다. 키트를 수령한 후, DNA에 550 µL의 nuclease-free water를 첨가하고 부드럽게 반전 혼합하여, 스톡 용액을 10 µL씩 분주하여 저장하고 -20 °C에서 냉동 보관합니다.완만한 도립 혼합으로 섞은 10 µL의 DNA stock solution에 70 µL의 buffer RDD를 추가하고, 짧게 원심분리한 후 R and easy spin column A에 직접 첨가합니다. DNA 처리물을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음 spin column에 350 µL의 buffer RW one을 추가하고 실온에서 8,000 G로 1분 동안 원심분리한 후, 통과액을 버리고 spin column에 500 µL의 buffer RPE를 추가합니다. 시료를 실온에서 5분 동안 배양합니다.실온에서 8,000 G로 1분간 다시 원심분리하고, 통과액을 버린 후 스핀 컬럼에 75% ethanol 500 µL를 첨가합니다. 8,000 G에서 원심분리를 반복하되 실온에서 2분간 수행하고, 원심분리 후 통과액을 버리고 즉시 컬럼을 5분 동안 건조시킵니다. 잔류 ethanol을 완전히 제거하기 위해 실온에서 8,000 G로 5분간 원심분리합니다.이제 스핀 컬럼을 새로운 1.5 mL 컬렉션 튜브로 옮기고 nuclease free water 10 µL를 첨가합니다. RNA를 용출시키기 위해 1분 동안 배양한 후, 10,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 상온에서 RNA는 통과액(flow through)으로 회수됩니다. 10 µL의 물을 추가하여 용출 과정을 반복합니다.제조사의 지침에 따라 NanoDrop ND 1000 분광광도계를 사용하여 RNA의 양과 질을 확인합니다. 또한, 변성 겔 전기영동을 수행하거나 Agilent 2100 bioanalyzer를 사용하여 RNA의 무결성을 확인합니다. RNA의 질과 양이 만족스러우면 CDNA 합성을 진행합니다.마지막으로, cDNA 합성을 수행할 때까지 RNA를 -80 °C에서 보관하십시오. RNA 프라이머의 각 구성 성분을 혼합하고 짧게 원심 분리하여 cDNA 합성을 시작하십시오. RNA, dNTP 및 oligo dT를 혼합하십시오.각 성분을 멸균된 0.5 mL 마이크로 튜브에 총 10 µL가 되도록 첨가합니다. 구체적인 부피는 동봉된 서면 프로토콜을 참조하십시오. 그런 다음 샘플을 65 °C에서 5분 동안 배양합니다.샘플을 즉시 얼음 슬러리에 옮겨 10분 동안 냉각시키는 동안, 동봉된 서면 프로토콜에 명시된 대로 총 9 µL의 버퍼 마스터 믹스를 준비합니다. 냉각 후, 버퍼 마스터 믹스와 RNA 프라이머 혼합물을 합쳐 부드럽게 섞은 다음, 짧게 원심분리하여 모읍니다. 다음으로, 혼합된 샘플을 써모사이클러에 넣고 42 °C에서 2분 동안 배양합니다.역전사를 시작하려면, superscript two RT 1 µL를 튜브에 넣고 혼합합니다. 42 °C에서 1시간 동안 계속 배양합니다. 70 °C에서 15분 동안 반응을 종료시킵니다.그다음 샘플을 4 °C로 냉각하고 얼음 위에 놓인 아이스 배스로 옮깁니다. 샘플에 1 µL의 RNase H를 첨가하고 37 °C에서 20분 동안 인큐베이션합니다. RNase H는 RNA 템플릿을 분해하여 단일 가닥 cDNA 생성물만 남깁니다. 이제 cDNA 합성이 완료되었으며, 추가적인 정제 및 농축 단계만 필요합니다. cDNA 생성물을 분리하기 위해, 12,000 ×g에서 2분 동안 원심분리하여 1.5 mL 페이즈 락 겔 튜브(phase lock gel tube)를 준비합니다.모든 젤이 튜브 바닥에 위치해야 합니다. pH 8.0으로 완충된 tris 포화 페놀 81.5 µL, 24:1 클로로포름-이소아밀 알코올 81.5 µL 및 샘플을 phase lock 젤 튜브에 넣고 부드럽게 뒤집어 여러 번 섞어줍니다. 샘플을 상온에서 12,000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. cDNA는 상층의 수성층에 위치해야 합니다.약 20 µL인 상층액을 깨끗한 1.5 mL 마이크로 튜브로 옮깁니다. cDNA를 침전시키기 위해 pH 5.2의 3 M sodium acetate 2 µL를 첨가하고 가볍게 섞습니다. 5 mg/mL glycogen 7 µL를 첨가하고 가볍게 섞습니다.그 다음 isopropanol 30 µL를 첨가하고 부드럽게 혼합한 후, 상온에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 이어서 상온에서 12,000 G로 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 튜브 바닥에 작은 cDNA 펠렛이 나타납니다.피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 70% ethanol 500 µL를 첨가하여 펠렛을 세척하고, 도립 혼합하여 섞어준 후 샘플을 12,000 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 피펫으로 상층액을 제거합니다.세척 과정을 반복하고, 에탄올을 추가하여 원심분리한 후 상층액(SUP)을 제거하십시오. 두 번째 세척 후, 튜브를 짧게 원심분리하여 남아 있는 액체를 모읍니다. 과잉 액체를 제거하고 펠렛을 실온에서 5분 동안 건조하십시오.그 다음, 펠렛을 재수화하기 위해 nuclease free water 20 µL를 추가합니다. 샘플을 55 °C에서 5분 동안 둡니다. 재수화된 CD NA는 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.마지막으로, 제조사의 지침에 따라 nano drop ND 1000 분광광도계를 사용하여 cDNA 생성물의 양과 질을 확인합니다. zebrafish 배아 50개로부터 RNA를 추출 및 정제하면 NanoDrop ND 1000 분광광도계 측정 시 통상적으로 약 15 µg의 고품질 총 RNA가 얻어지며, 260/280 흡광도 비율은 약 1.9에서 2.0 사이입니다. 추출된 RNA의 무결성은 변성 RNA 젤을 사용하여 평가합니다. RNA는 18s 및 28s 리보솜 RNA에 해당하는 두 개의 밝은 밴드가 있는 스미어(smear) 형태로 나타납니다.28 S 밴드의 강도는 18 S 밴드보다 약 2배 더 강해야 합니다. 또는 Agilent 2100 bioanalyzer를 사용하여 RNA 무결성을 평가할 수 있습니다. 이때 18 S 및 28 S 리보솜 RNA에 해당하는 두 개의 날카로운 피크가 관찰됩니다.28 s 피크가 18 s 피크보다 더 커야 합니다. 5 µg의 총 RNA를 역전사시키면 NanoDrop ND 1000으로 측정했을 때 통상적으로 1~2 µg의 cDNA가 생성됩니다. cDNA의 260 대 280 흡광도 비율은 약 1.8입니다.지금까지 제브라피쉬 배아 전체에서 총 RNA를 분리하고, 해당 RNA를 cDNA 생성물로 전환하는 방법을 살펴보았습니다. 이 실험 절차를 수행할 때는 RNase가 없는 환경을 유지하는 것이 중요하다는 점을 기억하시기 바랍니다. 이것으로 모든 과정을 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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생물학

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