Name: 고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 배우세요 Gene Pulser MXcell 시스템을 사용하여 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 전기천공 조건을 최적화하는 방법을. 유세포 분석기와 형광 현미경으로 형질도입 효율을 평가하여 신뢰할 수 있는 유전자 발현 연구 프로토콜을 확립합니다.

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1) 셀 준비 <ol><li> 자기편 세포를 사용하는 경우, 그것은 trypsinize과 electroporation하기 전에 세포를 수집하는 것이 필요합니다. </li><li> 세 가지 통로 번호를 나타내는 네 개의 마우스 배아 fibroblast (MEF) 문화 간의 transfection을 비교하려면 각각의 플라스크에서 다음을 수행합니다. </li><li> 세포 배양 매체를 대기음. </li><li> 세포를 씻어 PBS를 추가합니다. </li><li> PBS를 제거, 세포를 커버하는 충분한 트립신을 추가하고, 트립신은 세포를 분리 수 있도록 몇 분 기다리십시오. </li><li> , 세포의 상태를 확인하기 위해 현미경으로 flasks을 확인 세포를 분리 플라스크 갈기하고 있는지 세포가 모두 떨어뜨려하기 위해 다시 플라스크를 확인합니다. </li><li> 추가 시간과 반복 필요한 경우 기다립니다. </li><li> 모든 세포가 분리되면 트립신를 무력화하기 위해 혈청이 포함된 미디어를 추가할 수 있습니다. </li><li> 원심 분리기 튜브에 세포를 전송하고, 원심 분리에 의해 펠릿 세포 (RCF = 300 XG). </li><li> PBS의 유명한 볼륨에 뜨는 및 resuspend 세포를 제거합니다. </li><li> 세포를 세어보세요. </li><li> 세포 현탁액의 해당 볼륨이 실험을 위해 세포 (당신은 1 X 10 6 세포 / ML의 밀도에 잘 당 세포 150 μL가 필요합니다)의 필요한 숫자를 제공하는 새로운 튜브로 전송합니다. </li><li> 원심 분리기 세포. </li><li> 1 X 10 6 세포 / ML의 세포 밀도를 달성하기 위해 진 Pulser의 electroporation 버퍼의 해당 볼륨에 뜨는 및 resuspend 세포를 제거합니다. </li><li> 세포 현탁액의 플라스미드 당 ML 20 μg을 추가하고 부드럽게 섞는다. </li></ol> 2) Electroporation 선박 설정 및 electroporation 플레이트 설치 및 electroporation <ol><li> 진 Pulser MXcell의 electroporation 시스템의 전원 모듈에 플러그 플레이트 챔버. </li><li> 피펫 150 μL 세포 혼합물 또는 96 - 웰 electroporation 판의 우물에 버퍼. </li><li> 플레이트 챔버 및 펄스의 접시를 넣어. </li><li> 챔버에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 각 우물에 위아래로 pipetting으로 잘 내용물을 섞는다. </li><li> 각 우물에서 12 잘 접시에 미리 예열 버퍼 세포를 전송합니다. </li><li> 세포를 배포하고 배양기에 넣어 접시 누릅니다. </li><li> 세포는 24 시간 동안 회복하자. </li></ol> 쿠베트 설정 및 electroporation <ol start="9"><li> ShockPod의 유전자 Pulser MXcell의 electroporation 시스템 및 플러그 ™ 쿠베트 챔버의 전원 모듈에서 플레이트 챔버를 뽑습니다. </li><li> 0.4 cm 갑 electroporation의 쿠베트에 세포 현탁액의 피펫 600 μL. </li><li> ShockPod 챔버에 쿠베트를 넣고 전기 펄스를 제공합니다. </li><li> 챔버에서 쿠베트를 제거합니다. </li><li> 쿠베트에 아래 pipetting하여 쿠베트 내용을 섞는다. </li><li> 각 우물에서 12 잘 접시에 미리 예열 버퍼 세포를 전송합니다. </li><li> 세포를 배포하고 배양기에 넣어 접시 누릅니다. </li><li> 세포가 24 시간 동안 회복하자. </li></ol> 3) 대표 결과 세포를 transfecting하고 복구할 수있게되면, 유동세포계측법를 사용하여 양적 epifluorescent 현미경을 사용하여, 질적으로 transfection 효율을 분석합니다. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 성공적으로 electroporated되었습니다 지금은 GFP 유전자를 표현 아르 그림 1. 세포는 epifluorescent 현미경 아래에 나타납니다. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 위상 대조에서 세포를보기는 transfected와 untransfected 모두 세포의 시각화 수 있습니다. 이들은 200V의 낮은 전압 electroporation 펄스에 노출되었던 세포 수 있습니다. 세포 인해 높은 세포 밀도에 크게 합류하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. epifluorescence 아래보기의 동일한 필드는 세포가 GFP 마커를 표현 아르의 숫자를 보여주지만, 이들은 이전의 이미지에서 보이는 세포의 단지 작은 비율입니다. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 250V에서 위상 대조에 따라 본 사는 세포의 총 개수가 약간 줄어 듭니다. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> epifluorescence에서 하나는 GFP 표현 세포의 수가 증가했다는 그림 5.보실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 가장 높은 전압에서이 375V를 적용, 눈에 보이는 적은 라이브 세포가 없습니다. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig7.jpg" alt="그림 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7. 그러나 남아있는 세포의 큰 비율 GFP를 표현하고 있습니다. 최적의 어떤 조건 것은 실험 설계에 따라 달라집니다. 어떤 실험에서 transfected 세포의 가장 큰 숫자는 다른 실험에서 가장 높은 비율 transfection이 최선이 될, 최적의 수 있습니다. 우리는 각각의 조건에 따라 긍정적인 GFP 방법과 비율이 세포 나이마다 다릅니다 세포의 비율에 관심이 있습니다. 유동세포계측법는 다른 electroporation 조건의 각에서 transfection 결과에 대한 정량적 정보를 제공할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig8.jpg" alt="그림 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 8"> 그림 8. 여기 12 electroporation 조건의 각 이하 5 세포가 게재되는 통로에 긍정적인 GFP 아르 세포의 비율입니다. 최대 transfection 비율이 가장 강한 정사각형 웨이브 펄스에서 높은 전압 지수 붕괴 펄스, 상태 6, 70 % 이하 약 80 %입니다 상태 12, 테스트. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig9.jpg" alt="그림 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 9"> 그림 9. 세포 전에 electroporation 9 회 합격으로 transfection 비율의 전반적인 패턴이 거의 동일하지만, transfection 비율에서 아주 약간의 감소와 함께. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig10.jpg" alt="그림 10" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 10"> 그림 10. 여기에 표시가 통로 젊은 세포에 비해 transfection 비율에 표시된 감소를 보여 13 세포에 GFP 세포의 비율입니다. 가장 높은 transfection 비율은 최대한 빨리 격리 후 건강한 세포를 사용하는의 중요성을 보여주는 젊은 세포로 달성했던 약 절반되었습니다. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> 진 Pulser MXcell를 사용하여 transfecting MEF 세포에 사용 Electroporation 조건 </td></tr><tr><td> 조건 (1-6) 지수 붕괴 펄스, 350 UF, 1000ohm 모든 </td><td> 전압 (V) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 200 </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 250 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 300 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 326 </td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td> 350 </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 376 </td><td></td></tr><tr><td> 조건 (7-12) 스퀘어 웨이브 펄스, 2,000 UF, 1000 옴, 1 펄스 모든 </td><td> 전압 (V) </td><td> 펄스 기간 (MS) </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 200 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 250 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 300 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 200 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 250 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 300 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table>

저자는이 문서에서 사용되는 시약 및 장비를 생산하는 바이오 래드 연구소에 의해 고용되어

이 동영상이 문서에서는 쉽게 MEFs 또는 기타 기본 세포 라인에 대한 최적의 electroporation 조건을 식별하는 MXcell의 electroporation 시스템을 사용하는 방법을 보여줍니다. 많은 사람들이 많은 별도의 실험에 대한 필요성을 없앨 수 동시에 수행하는 실험이나 최적화 조건의 복제에 대한 96 - 웰 플레이트 형식 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안, 하나는 가능한 한 빨리 격리 후 건강한 세포를 사용하고 electroporation 버퍼에 일치 electroporation 조건을 사용하는 기억한다.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser&amp;#174; 전기천공 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2676</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser MXcell&amp;#8482; 전기천공 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser MXcell&amp;#8482; ShockPod&amp;#8482; 큐벳 챔버</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2673</td><td></td></tr><tr><td>ShockPod&amp;#8482; 큐벳 챔버가 포함된 Gene Pulser MXcell&amp;#8482; 전기천공 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2674</td><td></td></tr></tbody></table>

고효율 기본 셀을 transfect하는 진 pulser electroporation mxcell의 시스템을 사용하여

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

그것은 electroporation은 기본 세포에 플라스미드 DNA 또는 siRNA을 소개하는 가장 효과적인 방법임을 더욱 분명 해지고 있습니다. 진 Pulser MXcell의 electroporation 시스템과 진 Pulser의 electroporation 버퍼 (바이오 래드)은 특히 포유 동물 세포를 쉽게와 같은 기본 및 줄기 세포와 같은 어려운 transfect 세포로 핵산을 transfect하기 위해 개발되었습니다. 우리는 신속하게 최고의 electroporation 조건을 식별하는 간단한 실험을 수행하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 우리는 실험이 최적화가 수행 동시에 실시 할 수 있도록 electroporation 조건의 범위를 통해 몇 가지 샘플을 실행하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 우리는 또한 같은 electroporation 효율을 유지하면서 최적의 조건, 표준 electroporation의 cuvettes와 함께 사용할 수 있습니다 96 - 웰 플레이트 electroporation을 사용하여 electroporation의 cuvettes에 electroporation 플레이트의 스위치를 촉진 식별 방법을 보여줍니다. 동영상에서 우리는 electroporation 실험의 성공 또는 실패를 가져올 수있는 핵심 요소 중 일부를 설명합니다.

이 절차를 빠르게 쉽게 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs) 또는 기타 기본 세포에 가장 적합한 electroporation 조건을 식별하는 유전자 Pulser MXcell의 electroporation 시스템을 사용하는 방법을 보여줍니다. 문제 해결을위한 고려 사항도 관련 비디오 설명합니다.

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

전기천공법(electroporation)이 일차 세포(primary cells) 내로 플라스미드 DNA 또는 siRNA를 도입하는 가장 효과적인 방법이라는 점이 점점 더 분명해지고 있습니다. Gene Pulser...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스 배아 섬유아세포(mfs)를 포함한 일차 세포주의 형질전환을 위한 최적의 전기천공 조건을 확인하는 것입니다. 예를 들어, MF 세포와 선택한 핵산을 Gene Pulser MX Cell 시스템에 연결된 96웰 전기천공 플레이트에 로딩하여, 한 번의 실행으로 여러 전기천공 조건을 테스트할 수 있습니다. 최적화 실험을 위해 전기천공 후 세포를 배양하고 형질전환 효율을 분석합니다.에피 형광 현미경과 유세포 분석기를 사용하여, 향후 형질 도입에 가장 효율적인 전기천공 조건을 선택할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 BioRad Laboratories 유전자 발현 부문의 선임 연구원 Adam McCoy입니다. 오늘은 일차 세포주를 형질 도입하기 위한 최적의 전기천공 조건을 쉽게 확인하는 절차를 보여드리겠습니다.저희 실험실에서는 이러한 세포들의 유전자 발현을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 오늘은 세 가지 서로 다른 계代 수의 mes 또는 마우스 배아 섬유아세포를 사용할 것입니다. 두 가지 이유로 서로 다른 계代 수의 배양 세포를 사용하고 있습니다.먼저, 세포 상태가 얼마나 중요한지 보여드리겠습니다. 일차 세포주(primary cell lines)의 경우, 배양 기간이 단 며칠만 더 길어져도 transfection 효율에 차이가 생길 수 있습니다. 둘째로, 세포가 오래될수록 transfection 효율은 떨어지지만, 최적의 조건을 찾아내는 과정은 동일하다는 점을 보여드리고자 합니다. 여러분의 실제 실험에서는 세포의 배양 기간이 서로 다른 경우를 다루지는 않을 것입니다.자신의 실험 설계에 맞춰 동일한 절차를 따를 수 있습니다. 유전자 발현과 대조군 및 처리군 세포를 비교하려는 경우, 먼저 최적의 조건을 찾은 다음 확인된 조건을 사용하여 실험을 수행할 수 있습니다. 또는 최적화와 실험을 동시에 진행할 수도 있습니다.오늘 시연할 내용과 같이, GFP 인코딩 플라스미드를 사용하여 유세포 분석으로 형질전환 효율을 확인하겠습니다. 하지만 irna를 도입하고 실시간 PCR로 유전자 발현을 확인하는 것과 같이 다른 작업을 수행하더라도 전기천공법 절차는 동일합니다. 그럼 시작하겠습니다.본 프로토콜에서 사용되는 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)는 부착성 세포입니다. 따라서 이 세포들을 다루는 첫 번째 단계는 트립신화를 포함하는 표준 조직 배양 프로토콜을 사용하여 플라스크 바닥에서 세포를 떼어내는 것입니다. 세포가 플라스크에서 분리되면, 혈청이 포함된 배지로 트립신을 중화시키고 세포를 50 mL 원심 분리 튜브에 수집하십시오.세포를 수집한 후 원심분리하여 펠릿(pellet) 형태로 만듭니다. 일정량의 PBS에 다시 부유시켜 세포를 세척해야 합니다. 완전히 재부유시킨 후 세포 수를 측정하며, 전기천공법(electroporation) 실험에는 mL당 1 million cells의 농도가 필요함을 유의하십시오.세포 수를 기준으로 적절한 세포 수를 계산하여 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 세포를 펠렛화하기 위해 원심분리를 수행합니다. 그 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다.세포를 electroporation 버퍼에 재부유하여 1 mL당 100만 개의 세포 농도로 맞춘 뒤, plasmid를 20 µg/mL 농도로 첨가합니다. 플레이트는 열 1~12, 행 A~H의 96개 웰로 나뉘어 있으며, 4개 웰로 구성된 각 웰 세트는 한 쌍의 전극 플레이트를 공유하므로 해당 웰 내의 세포들은 동일한 펄스를 받게 됩니다. 예를 들어, 1A, 1B, 1C, 1D 웰의 세포들은 하나의 웰 세트로 전기적으로 연결되어 있어 모두 동일한 펄스를 받게 됩니다.프로토콜이 시작되면 다음의 네 개 웰인 2A, 2B, 2C, 2D에는 모두 두 번째 펄스가 가해집니다. 파라미터가 동일하더라도 96-웰 전기천공 플레이트는 플레이트의 상단과 하단 절반이 나뉘도록 설정되어 있습니다. 따라서 플레이트 하단의 1E, 1F, 1G, 1H 웰에는 모두 하나의 펄스가 가해졌으나, 이는 상단의 1A, 1B, 1C, 1D 웰이 받은 펄스와는 별개입니다.본 실험에서는 플레이트의 절반만 사용합니다. 각 웰 세트의 처음 세 개 웰에는 서로 다른 연령의 세포가 들어 있습니다. A행의 상단 행에 있는 세포들은 5회 계대 배양되었습니다.B행의 세포는 9회 계대 배양되었으며, C행의 세포는 13회 계대 배양되었습니다. D행에는 전기천공 전 전기천공 버퍼만 포함되어 있습니다. 설정값이 정확한지 확인하기 위해 프로토콜을 검토하는 것이 좋습니다.본 프로토콜에서는 6회의 지수 감쇠 펄스에 이어 6회의 사각파 펄스를 전달합니다. 지수 감쇠 펄스는 200 volts에서 450 volts까지 증가하며, 모두 350 micro ferrets만을 사용합니다. 이는 사용되는 유전자 펄스 또는 전기천공 버퍼의 저항이 낮기 때문입니다.정방형 파형 펄스는 전압과 펄스 지속 시간이 모두 다양합니다. 기기의 커패시턴스 설정은 전기천공 혼합물의 전도도와 일치시켜야 합니다. DMEM과 같이 전기천공을 위해 더 높은 저항의 버퍼를 사용하는 경우, 동일한 전압 범위를 사용할 수 있으나 지수 함수적 감쇠 펄스에 대해 950 µF와 같은 더 큰 커패시턴스를 설정해야 합니다.사용 중인 버퍼의 최적 커패시턴스를 모르는 경우, 테스트 중인 전기천공 조건에서 커패시턴스 또한 변경해야 합니다. 다음 단계는 이번 실험에 사용되는 각 웰에 세포-플라스미드 혼합물 150 µL를 분주하는 것입니다. 사용되는 각 웰 세트의 네 번째 웰은 전기천공 버퍼로 채웁니다.플레이트를 로딩한 후, MXL 플레이트 챔버에 넣고 덮개를 닫습니다. 그다음 pulse 버튼을 눌러 세포를 전기천공합니다. 전기천공기는 선택한 프로토콜에 지정된 조건에 따라 각 웰에 순차적으로 전기 펄스를 전달합니다.모든 세포를 전기천공하는 데 몇 초가 소요됩니다. 펄스가 완료되면 플레이트 챔버 믹센트에서 플레이트를 꺼내십시오. 각 웰의 세포를 미리 데워둔 배지가 들어 있는 배양 접시로 옮기십시오.이 세포들은 10% FBS가 첨가된 DMEM에서 배양됩니다. 전기천공을 거치지 않은 대조군 샘플은 남은 세포-플라스미드 혼합물에서 취하여, 전기천공된 세포에 사용한 것과 동일한 조성의 배지가 담긴 사전 가온 배양 접시에 추가합니다. 마지막으로 가볍게 흔들어 섞어줍니다.그다음 플레이트를 가볍게 두드려 세포를 고르게 분산시킨 후, 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하여 형질전환 효율을 분석하고 실험에 가장 적합한 전기천공 조건을 확인합니다. 최적의 전기천공 조건이 결정되면, 향후 실험을 위해 두 가지 전기천공 방법 중 하나를 선택할 수 있습니다. 연구자는 96-well 플레이트에서 세포를 계속 처리하거나, 큐벳을 사용하여 샘플을 하나씩 처리할 수 있습니다.큐벳은 한 번에 하나의 샘플만 처리할 수 있으며, 96-웰 플레이트의 한 웰에 필요한 부피보다 4배 더 많은 양이 필요하지만, 소량의 샘플만 필요한 경우에는 개별 큐벳이 더 저렴하고 사용하기 편리합니다. Gene Pulse 또는 MX cell 시스템은 플레이트와 큐벳에서 동일한 전기천공 설정을 사용할 수 있도록 설계되었습니다. 플레이트 챔버 대신 큐벳용 MXL shock pod를 사용하십시오.기기 뒷면에서 플레이트 챔버의 연결을 해제하고 쇼크 포드를 연결하십시오. 쇼크 포드는 well set A, B, C, D 1에 대해 프로그래밍된 펄스만 전달하므로, 다른 프로그램을 선택해야 할 수도 있습니다. 이전에 저장된 프로그램을 선택하려면 홈(home) 버튼을 누르십시오.그 다음 세 번째 옵션인 user protocols를 선택하십시오. 이미 올바른 사용자 폴더에 있다면, enter를 눌러 user protocols를 선택하고 아래로 스크롤하십시오. 올바른 프로그램을 강조 표시한 후, enter를 눌러 해당 프로그램을 선택하십시오.이제 기기 준비가 완료되었습니다. 프로그램을 선택했으므로, 큐벳을 준비하십시오. 플라스미드와 MEF의 혼합물은 이전에 설명한 것과 동일한 방식으로 준비합니다.각 0.4 cm 벳(vet)에 웰 세트 전체에 사용된 것과 동일한 부피를 넣으십시오. 96-웰 플레이트에서 웰 세트는 4개의 웰로 구성되며, 웰당 150 µL의 완충액 또는 세포 혼합물이 사용되었으므로, 벳당 600 µL의 플라스미드 세포 혼합물을 사용합니다.다음으로 전극(vet)을 쇼크 포드 챔버에 넣고, 펄스 버튼을 눌러 세포에 전기 충격을 가합니다. 전기천공 후에는 플레이트 방법과 동일하게 진행하여 세포를 혼합한 다음, 미리 데워진 배지가 채워진 세포 배양 플레이트에 분주합니다. 전기천공을 하지 않은 대조군 웰을 설정합니다. 플레이트를 회전시키고 가볍게 두드립니다.그 후, 세포를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 24시간 동안 회복시킨 다음, 형질전환 효율을 분석합니다. 형질전환 효율은 epi 형광 현미경을 이용해 정성적으로, 유세포 분석기를 이용해 정량적으로 분석합니다. 전기천공법이 성공적으로 이루어져 GFP 유전자를 발현하는 세포는 epi 형광 현미경 상에서 녹색으로 나타나며, 여기에 전형적인 성공 결과가 제시되어 있습니다. 위상차 현미경으로 세포를 관찰하면 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포를 모두 시각화할 수 있습니다.여기에는 200 volt의 가장 낮은 전압 전기천공 펄스에 노출된 세포들이 나타나 있습니다. 높은 세포 밀도로 인해 세포들이 대체로 confluent한 상태입니다. 동일한 시야를 epi-fluorescence로 관찰하면 다수의 세포가 GFP 마커를 발현하고 있음을 알 수 있으나, 이는 250 volt의 이전 이미지에서 보였던 세포들의 아주 적은 비율에 불과합니다.위상차 현미경으로 관찰된 총 생존 세포 수는 에피 형광 현미경 하에서 약간 감소합니다. 375V의 최대 전압을 인가했을 때 GFP 발현 세포의 수가 증가했음을 확인할 수 있습니다. 관찰되는 생존 세포 수는 더 적지만, 남아 있는 세포의 상당 부분에서 GFP가 발현되고 있습니다.어떤 조건이 최적인지는 실험 설계에 따라 다릅니다. 일부 실험에서는 형질전환된 세포 수가 최대인 것이 최적일 수 있습니다. 다른 실험에서는 형질전환 효율이 가장 높은 것이 최적일 수 있습니다.우리는 각 조건에서 GFP 양성 세포의 비율과 세포 계대 배양 횟수에 따라 이 비율이 어떻게 변하는지에 관심을 가지고 있습니다. 유세포 분석(Flow cytometry)을 통해 각각의 서로 다른 전기천공 조건하에서의 형질전환 결과에 대한 정량적 정보를 얻을 수 있습니다. 여기 제시된 것은 계대 배양 중 GFP 양성 세포의 비율입니다.5개의 세포. 12가지 전기천공 조건 각각에 대하여, 최대 형질전환 효율은 가장 높은 전압의 지수함수적 감쇠 조건에서 약 80%였습니다. 펄스 조건 6 및 70은 전기천공 전 세포를 9회 통과시킨 가장 강력한 사각파 펄스 시험 조건인 조건 12에서 나타났습니다.전반적인 형질전환 효율 패턴은 거의 동일하지만, 나타난 형질전환 백분율은 매우 약간 감소했습니다. 다음은 계대 배양 13회 세포의 GFP 세포 백분율이며, 이는 어린 세포에 비해 형질전환 백분율이 현저히 감소했음을 보여줍니다. 가장 높은 형질전환 백분율도 어린 세포에서 달성한 수치의 약 절반에 불과했으며, 이는 분리 후 가능한 한 빨리 건강한 세포를 사용하는 것이 중요함을 입증합니다.지금까지 MXL 전기천공 시스템을 사용하여 MAPs 또는 기타 일차 세포주의 최적 전기천공 조건을 확인하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 분리 후 가능한 한 빨리 건강한 세포를 사용하고 전기천공 버퍼에 맞는 전기천공 조건을 사용하는 것이 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 절차는 murine 골수에서 조혈 세포 기본 문화를 확립하고 진 Pulser MXCell의 electroporation 시스템을 사용 transfection하여 다음 방법을 설명합니다.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

이 절차 또는 나선 limbus 및 나선 신경절의 뉴런없이 Corti의 murine 기관의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 electroporation에 의해 Corti explant의 기관에서 외인성 리포터 유전자의 표현 방법을 보여줍니다.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

전기장의 방향이 펄스 응용 프로그램 중에 변경되면 electroporation에 의해 유전자 transfection이 약 두 배 향상이며, 동시에 세포 생존 능력은 영향을받지 않습니다. 유전자 transfection의 증가는 세포로 DNA의 항목에 대해 관할 만들어 막 면적의 증가로 인해 발생할 수 있습니다.

전기 펄스 응용 프로그램에는 방향과 전기장의 방향을 변경하면 플라스미드 유전자 전송을 향상 체외에서</em

이 동영상은 형광 단백질 인코딩 플라스미드 DNA를 마우스의 1차 소뇌 과립 세포 전구체에 도입하는 전기천공법 기술을 보여줍니다.

전기천공법 매개 체외 유전자 전달: 배양된 세포에 형광 리포터 단백질 인코딩 플라스미드를 도입하는 전기 펄스 기술

차세대 전기천공법은 유전자 발현과 세포 거동을 변경하기 위해 인간 Th17 세포를 작은 RNA로 형질 주입하는 효율적인 방법입니다.

차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질

여기에 제시된 단세포 전기기화는 체외 해마 슬라이스 배양 연령의 범위에 걸쳐 흥분성 및 억제 뉴런 모두에서 유전자를 전달할 수 있는 프로토콜입니다. 우리의 접근은 개별 적인 세포에 있는 유전자의 정확하고 능률적인 발현을 제공합니다, 세포 자율및 세포 간 기능을 검토하기 위하여 이용될 수 있는.

마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화

우리는 잠자는 숲속의 미녀 (SB) 트랜스포존 시스템을 사용하여 색소 상피 유래 인자 (PEDF)를 코딩하는 유전자로 전기 천공함으로써 1 차 인간 색소 상피 세포를 형질 감염시키는 프로토콜을 개발했습니다. 성공적인 형질감염은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 면역블로팅 및 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 입증되었다.

잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 이용한 1차 인간 색소 상피 세포의 전기천공 기반 유전자 변형

여기서, 우리는 비용 효율적이고 효율적이며 실행 가능한 1 차성 과립 세포 전구체 (GCP)의 유전 조작을 위한 시험관 내 전기화 프로토콜을 제시합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 분자 연구를 위한 간단한 방법을 보여줍니다.

과립 세포 전구체에서 1 차적인 실륨 의존적 신호 경로를 연구하는 효율적이고 비용 효율적인 전기 포기법

이 프로토콜은 시험관내에서 조립되고 전기천공법으로 전달되는 Cas9-sgRNA 리보핵단백질 복합체를 사용하여 마우스 골수 유래 대식세포에서 게놈 편집 절차를 설명합니다.

전기천공된 Cas9-sgRNA 복합체를 사용한 일차 골수 유래 대식세포의 고효율 유전자 파괴

CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 homology-mediated end joining (HMEJ) DNA repair pathway를 통해 1차 인간 T 세포에서 큰 multicistronic 구조체의 고효율 표적 knock-in을 달성하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 cGMP 적응 프로토콜로 조작된 T 세포는 우수한 세포 증식, 세포 독성 및 사이토카인 생산을 유지합니다.

대형 DNA 주형의 상동성 매개 말단 결합을 통한 일차 인간 T 세포의 비바이러스 공학

RNA로서 게놈 편집자를 전달하는 것은 1차 포유류 세포와 세포주의 게놈을 변형하는 데 특히 강력한 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 유전체 편집기를 mRNA로 1차 포유류 세포와 세포주에 전달한 후, 표적 Illumina 시퀀싱과 분석을 통해 편집 결과를 정량화하는 것입니다.

1차 포유류 세포에서 편집자 RNA의 전기천공을 통한 유전체 편집

배우세요 Gene Pulser MXcell 시스템을 사용하여 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 전기천공 조건을 최적화하는 방법을. 유세포 분석기와 형광 현미경으로 형질도입 효율을 평가하여 신뢰할 수 있는 유전자 발현 연구 프로토콜을 확립합니다.

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

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