고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

이 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스 배아 섬유아세포(mfs)를 포함한 일차 세포주의 형질전환을 위한 최적의 전기천공 조건을 확인하는 것입니다. 예를 들어, MF 세포와 선택한 핵산을 Gene Pulser MX Cell 시스템에 연결된 96웰 전기천공 플레이트에 로딩하여, 한 번의 실행으로 여러 전기천공 조건을 테스트할 수 있습니다. 최적화 실험을 위해 전기천공 후 세포를 배양하고 형질전환 효율을 분석합니다.

에피 형광 현미경과 유세포 분석기를 사용하여, 향후 형질 도입에 가장 효율적인 전기천공 조건을 선택할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 BioRad Laboratories 유전자 발현 부문의 선임 연구원 Adam McCoy입니다. 오늘은 일차 세포주를 형질 도입하기 위한 최적의 전기천공 조건을 쉽게 확인하는 절차를 보여드리겠습니다.

저희 실험실에서는 이러한 세포들의 유전자 발현을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 오늘은 세 가지 서로 다른 계代 수의 mes 또는 마우스 배아 섬유아세포를 사용할 것입니다. 두 가지 이유로 서로 다른 계代 수의 배양 세포를 사용하고 있습니다.

먼저, 세포 상태가 얼마나 중요한지 보여드리겠습니다. 일차 세포주(primary cell lines)의 경우, 배양 기간이 단 며칠만 더 길어져도 transfection 효율에 차이가 생길 수 있습니다. 둘째로, 세포가 오래될수록 transfection 효율은 떨어지지만, 최적의 조건을 찾아내는 과정은 동일하다는 점을 보여드리고자 합니다. 여러분의 실제 실험에서는 세포의 배양 기간이 서로 다른 경우를 다루지는 않을 것입니다.

자신의 실험 설계에 맞춰 동일한 절차를 따를 수 있습니다. 유전자 발현과 대조군 및 처리군 세포를 비교하려는 경우, 먼저 최적의 조건을 찾은 다음 확인된 조건을 사용하여 실험을 수행할 수 있습니다. 또는 최적화와 실험을 동시에 진행할 수도 있습니다.

오늘 시연할 내용과 같이, GFP 인코딩 플라스미드를 사용하여 유세포 분석으로 형질전환 효율을 확인하겠습니다. 하지만 irna를 도입하고 실시간 PCR로 유전자 발현을 확인하는 것과 같이 다른 작업을 수행하더라도 전기천공법 절차는 동일합니다. 그럼 시작하겠습니다.

본 프로토콜에서 사용되는 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)는 부착성 세포입니다. 따라서 이 세포들을 다루는 첫 번째 단계는 트립신화를 포함하는 표준 조직 배양 프로토콜을 사용하여 플라스크 바닥에서 세포를 떼어내는 것입니다. 세포가 플라스크에서 분리되면, 혈청이 포함된 배지로 트립신을 중화시키고 세포를 50 mL 원심 분리 튜브에 수집하십시오.

세포를 수집한 후 원심분리하여 펠릿(pellet) 형태로 만듭니다. 일정량의 PBS에 다시 부유시켜 세포를 세척해야 합니다. 완전히 재부유시킨 후 세포 수를 측정하며, 전기천공법(electroporation) 실험에는 mL당 1 million cells의 농도가 필요함을 유의하십시오.

세포 수를 기준으로 적절한 세포 수를 계산하여 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 세포를 펠렛화하기 위해 원심분리를 수행합니다. 그 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

세포를 electroporation 버퍼에 재부유하여 1 mL당 100만 개의 세포 농도로 맞춘 뒤, plasmid를 20 µg/mL 농도로 첨가합니다. 플레이트는 열 1~12, 행 A~H의 96개 웰로 나뉘어 있으며, 4개 웰로 구성된 각 웰 세트는 한 쌍의 전극 플레이트를 공유하므로 해당 웰 내의 세포들은 동일한 펄스를 받게 됩니다. 예를 들어, 1A, 1B, 1C, 1D 웰의 세포들은 하나의 웰 세트로 전기적으로 연결되어 있어 모두 동일한 펄스를 받게 됩니다.

프로토콜이 시작되면 다음의 네 개 웰인 2A, 2B, 2C, 2D에는 모두 두 번째 펄스가 가해집니다. 파라미터가 동일하더라도 96-웰 전기천공 플레이트는 플레이트의 상단과 하단 절반이 나뉘도록 설정되어 있습니다. 따라서 플레이트 하단의 1E, 1F, 1G, 1H 웰에는 모두 하나의 펄스가 가해졌으나, 이는 상단의 1A, 1B, 1C, 1D 웰이 받은 펄스와는 별개입니다.

본 실험에서는 플레이트의 절반만 사용합니다. 각 웰 세트의 처음 세 개 웰에는 서로 다른 연령의 세포가 들어 있습니다. A행의 상단 행에 있는 세포들은 5회 계대 배양되었습니다.

B행의 세포는 9회 계대 배양되었으며, C행의 세포는 13회 계대 배양되었습니다. D행에는 전기천공 전 전기천공 버퍼만 포함되어 있습니다. 설정값이 정확한지 확인하기 위해 프로토콜을 검토하는 것이 좋습니다.

본 프로토콜에서는 6회의 지수 감쇠 펄스에 이어 6회의 사각파 펄스를 전달합니다. 지수 감쇠 펄스는 200 volts에서 450 volts까지 증가하며, 모두 350 micro ferrets만을 사용합니다. 이는 사용되는 유전자 펄스 또는 전기천공 버퍼의 저항이 낮기 때문입니다.

정방형 파형 펄스는 전압과 펄스 지속 시간이 모두 다양합니다. 기기의 커패시턴스 설정은 전기천공 혼합물의 전도도와 일치시켜야 합니다. DMEM과 같이 전기천공을 위해 더 높은 저항의 버퍼를 사용하는 경우, 동일한 전압 범위를 사용할 수 있으나 지수 함수적 감쇠 펄스에 대해 950 µF와 같은 더 큰 커패시턴스를 설정해야 합니다.

사용 중인 버퍼의 최적 커패시턴스를 모르는 경우, 테스트 중인 전기천공 조건에서 커패시턴스 또한 변경해야 합니다. 다음 단계는 이번 실험에 사용되는 각 웰에 세포-플라스미드 혼합물 150 µL를 분주하는 것입니다. 사용되는 각 웰 세트의 네 번째 웰은 전기천공 버퍼로 채웁니다.

플레이트를 로딩한 후, MXL 플레이트 챔버에 넣고 덮개를 닫습니다. 그다음 pulse 버튼을 눌러 세포를 전기천공합니다. 전기천공기는 선택한 프로토콜에 지정된 조건에 따라 각 웰에 순차적으로 전기 펄스를 전달합니다.

모든 세포를 전기천공하는 데 몇 초가 소요됩니다. 펄스가 완료되면 플레이트 챔버 믹센트에서 플레이트를 꺼내십시오. 각 웰의 세포를 미리 데워둔 배지가 들어 있는 배양 접시로 옮기십시오.

이 세포들은 10% FBS가 첨가된 DMEM에서 배양됩니다. 전기천공을 거치지 않은 대조군 샘플은 남은 세포-플라스미드 혼합물에서 취하여, 전기천공된 세포에 사용한 것과 동일한 조성의 배지가 담긴 사전 가온 배양 접시에 추가합니다. 마지막으로 가볍게 흔들어 섞어줍니다.

그다음 플레이트를 가볍게 두드려 세포를 고르게 분산시킨 후, 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하여 형질전환 효율을 분석하고 실험에 가장 적합한 전기천공 조건을 확인합니다. 최적의 전기천공 조건이 결정되면, 향후 실험을 위해 두 가지 전기천공 방법 중 하나를 선택할 수 있습니다. 연구자는 96-well 플레이트에서 세포를 계속 처리하거나, 큐벳을 사용하여 샘플을 하나씩 처리할 수 있습니다.

큐벳은 한 번에 하나의 샘플만 처리할 수 있으며, 96-웰 플레이트의 한 웰에 필요한 부피보다 4배 더 많은 양이 필요하지만, 소량의 샘플만 필요한 경우에는 개별 큐벳이 더 저렴하고 사용하기 편리합니다. Gene Pulse 또는 MX cell 시스템은 플레이트와 큐벳에서 동일한 전기천공 설정을 사용할 수 있도록 설계되었습니다. 플레이트 챔버 대신 큐벳용 MXL shock pod를 사용하십시오.

기기 뒷면에서 플레이트 챔버의 연결을 해제하고 쇼크 포드를 연결하십시오. 쇼크 포드는 well set A, B, C, D 1에 대해 프로그래밍된 펄스만 전달하므로, 다른 프로그램을 선택해야 할 수도 있습니다. 이전에 저장된 프로그램을 선택하려면 홈(home) 버튼을 누르십시오.

그 다음 세 번째 옵션인 user protocols를 선택하십시오. 이미 올바른 사용자 폴더에 있다면, enter를 눌러 user protocols를 선택하고 아래로 스크롤하십시오. 올바른 프로그램을 강조 표시한 후, enter를 눌러 해당 프로그램을 선택하십시오.

이제 기기 준비가 완료되었습니다. 프로그램을 선택했으므로, 큐벳을 준비하십시오. 플라스미드와 MEF의 혼합물은 이전에 설명한 것과 동일한 방식으로 준비합니다.

각 0.4 cm 벳(vet)에 웰 세트 전체에 사용된 것과 동일한 부피를 넣으십시오. 96-웰 플레이트에서 웰 세트는 4개의 웰로 구성되며, 웰당 150 µL의 완충액 또는 세포 혼합물이 사용되었으므로, 벳당 600 µL의 플라스미드 세포 혼합물을 사용합니다.

다음으로 전극(vet)을 쇼크 포드 챔버에 넣고, 펄스 버튼을 눌러 세포에 전기 충격을 가합니다. 전기천공 후에는 플레이트 방법과 동일하게 진행하여 세포를 혼합한 다음, 미리 데워진 배지가 채워진 세포 배양 플레이트에 분주합니다. 전기천공을 하지 않은 대조군 웰을 설정합니다. 플레이트를 회전시키고 가볍게 두드립니다.

그 후, 세포를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 24시간 동안 회복시킨 다음, 형질전환 효율을 분석합니다. 형질전환 효율은 epi 형광 현미경을 이용해 정성적으로, 유세포 분석기를 이용해 정량적으로 분석합니다. 전기천공법이 성공적으로 이루어져 GFP 유전자를 발현하는 세포는 epi 형광 현미경 상에서 녹색으로 나타나며, 여기에 전형적인 성공 결과가 제시되어 있습니다. 위상차 현미경으로 세포를 관찰하면 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포를 모두 시각화할 수 있습니다.

여기에는 200 volt의 가장 낮은 전압 전기천공 펄스에 노출된 세포들이 나타나 있습니다. 높은 세포 밀도로 인해 세포들이 대체로 confluent한 상태입니다. 동일한 시야를 epi-fluorescence로 관찰하면 다수의 세포가 GFP 마커를 발현하고 있음을 알 수 있으나, 이는 250 volt의 이전 이미지에서 보였던 세포들의 아주 적은 비율에 불과합니다.

위상차 현미경으로 관찰된 총 생존 세포 수는 에피 형광 현미경 하에서 약간 감소합니다. 375V의 최대 전압을 인가했을 때 GFP 발현 세포의 수가 증가했음을 확인할 수 있습니다. 관찰되는 생존 세포 수는 더 적지만, 남아 있는 세포의 상당 부분에서 GFP가 발현되고 있습니다.

어떤 조건이 최적인지는 실험 설계에 따라 다릅니다. 일부 실험에서는 형질전환된 세포 수가 최대인 것이 최적일 수 있습니다. 다른 실험에서는 형질전환 효율이 가장 높은 것이 최적일 수 있습니다.

우리는 각 조건에서 GFP 양성 세포의 비율과 세포 계대 배양 횟수에 따라 이 비율이 어떻게 변하는지에 관심을 가지고 있습니다. 유세포 분석(Flow cytometry)을 통해 각각의 서로 다른 전기천공 조건하에서의 형질전환 결과에 대한 정량적 정보를 얻을 수 있습니다. 여기 제시된 것은 계대 배양 중 GFP 양성 세포의 비율입니다.

5개의 세포. 12가지 전기천공 조건 각각에 대하여, 최대 형질전환 효율은 가장 높은 전압의 지수함수적 감쇠 조건에서 약 80%였습니다. 펄스 조건 6 및 70은 전기천공 전 세포를 9회 통과시킨 가장 강력한 사각파 펄스 시험 조건인 조건 12에서 나타났습니다.

전반적인 형질전환 효율 패턴은 거의 동일하지만, 나타난 형질전환 백분율은 매우 약간 감소했습니다. 다음은 계대 배양 13회 세포의 GFP 세포 백분율이며, 이는 어린 세포에 비해 형질전환 백분율이 현저히 감소했음을 보여줍니다. 가장 높은 형질전환 백분율도 어린 세포에서 달성한 수치의 약 절반에 불과했으며, 이는 분리 후 가능한 한 빨리 건강한 세포를 사용하는 것이 중요함을 입증합니다.

지금까지 MXL 전기천공 시스템을 사용하여 MAPs 또는 기타 일차 세포주의 최적 전기천공 조건을 확인하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 분리 후 가능한 한 빨리 건강한 세포를 사용하고 전기천공 버퍼에 맞는 전기천공 조건을 사용하는 것이 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다.

시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.