차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

안녕하세요, 저는 마크 파커입니다. 매사추세츠주 보스턴에 있는 Massachusetts Eye and Ear Infirmary의 Eaton Peabody Laboratory에 오신 것을 환영합니다. 오늘 우리는 kti의 해양 기관의 분리 및 1차 배양에 대한 프로토콜을 제시할 것입니다.

이 프로토콜은 오디션에 필수적인 장기의 체외 분석을 가능하게 하기 때문에 우리 작업의 기본입니다. 이 접근법의 유용성을 강조하기 위해, 우리는 또한 우리 실험실에서 장기의 많은 용도 중 하나인 외인성 유전자를 배양된 외식식물로 전기천공하는 것을 시연할 것입니다. 일하러 가자.

이 절차의 개요는 다음과 같습니다: 신생아 마우스는 목을 베고 둔기 해부를 사용하여 측두골을 제거합니다. 다음으로, 달팽이관은 둔기 해부를 사용하여 측두골에서 분리됩니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 달팽이관의 뼈 미로를 열고 달팽이관의 내부 모디스에서 나선형 인대를 제거합니다.

마지막으로, 나선형 인대는 겸자를 사용하여 코드 기관에서 분리되며, 유모 세포의 반투명 장미가 kti 기관의 길이를 따라 달리는 것을 볼 수 있습니다. 나선형 인대를 제거하는 동안 파열된 RISE의 멤브레인 일부가 모듈식 측면의 길이로 흐르는 것을 볼 수 있습니다. 이 절차의 유용성의 예로, 장기 코드 외식은 24시간 동안 배양된 다음 외인성 형광 리포터 유전자로 전기천공됩니다.

이 절차의 초기 단계에는 배양 플레이트의 준비가 포함됩니다. 70% 에탄올에 보관된 멸균된 유리 커버 슬립을 사전 멸균된 4륜 세포 배양 접시의 두 웰에 넣습니다. 4개의 웰 중 2개만 사용하면 배양물이 인큐베이터 토트에서 나오는 시간을 제한할 수 있습니다.

커버는 일대일 폴리 l, 오르니틴, 라미닌으로 구성된 용액으로 미끄러집니다. 20%의 소 태아 혈청을 보충하고 전달을 용이하게 하기 위해 배양 접시를 더 큰 10cm 접시에 넣은 다음 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 마지막으로, 섭씨 150도의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 도구를 가열하여 소독합니다.

박리를 시작하기 20분 전에 UV 광선을 켜서 양극류 박리 후드를 소독합니다. 해부 후드 내부의 작업 공간을 모든 표면에 70% 에탄올을 분사하여 살균합니다. 목이 잘린 새끼 쥐의 머리를 70% 에탄올이 함유된 페트리 접시에 넣고 메스 칼날을 사용하여 표피를 제거합니다.

메스 칼날을 사용하여 시상 봉합선을 따라 두개골을 연 다음 뇌를 이등분합니다. 추가 해부를 위해 코들 전뇌를 유지하십시오. 둔기 해부를 사용하여 전뇌, 소뇌 및 뇌간을 제거합니다.

두개골의 아래쪽 측면에 있는 초금속 모양의 측두골의 위치에 주목하십시오. TAL 뼈를 멸균 행크스 볼 소금 용액이 들어 있는 3mm 접시에 옮깁니다. 나머지 해부는 해부 현미경으로 실시한다.

측두골에서 주변 조직을 모두 제거합니다. 소라 모양의 달팽이관을 찾아 집게를 사용하여 전정계에서 제거합니다. 이 발달 단계에서 뼈 미로는 완전히 석회화되지 않고 쉽게 해부됩니다.

달팽이관의 뼈 미로를 기저 끝에서 시작하여 정점으로 조심스럽게 분리하여 제거합니다. 겸자를 사용하여 모디스에서 나선형 인대와 부착된 감각 상피를 집게를 사용하여 베이스의 고리 부분에 고정하고 풀어 조심스럽게 제거합니다. 당신이 분명히 움직이면서 바닥에서 시작하여 숫자 55 미세한 집게를 사용하여 감각 상피에서 나선형 인대를 제거합니다.

우리의 실험 중 일부에서는 감각 상피에서 나선형 변연계를 제거하는 것이 바람직합니다. 이 micro ol isolate 절차에서, cordi의 기관은 두 개의 1/2cc 인슐린 주사기를 겸자로 사용하여 나선형 변연계에서 분리됩니다. 먼저, 인슐린 주사기를 사용하여 장기 코드의 갈고리 부위를 제거합니다.

다음으로, 나선형 변연은 정점에서 시작하여 나선형 변연이 부착된 코르테의 전체 기관 중 하나를 기저부로 진행하는 내부 유모 세포 열에서 분리됩니다. 마이크로 절연 감각 상피 또는 마이크로 절연 나선형 변두리는 다음과 같이 배양 할 수 있으며, 배양 웰에서 코팅 용액을 제거하고 10 % 혈청 전달을 포함하는 130 마이크로 리터의 배양 배지로 대체하고, 해부 된 코드 기관은 배양에서 코팅 된 유리 커버 슬립으로 미끄러진다. 글쎄요, 우리는 다음과 같은 기술이 코르티 기관이 배양 배지에 떠다니지 않고 커버 슬립에 부착된 상태로 유지되도록 하는 데 도움이 된다는 것을 발견했습니다.

첫 번째 코팅, 유리 덮개가 설명된 대로 미끄러집니다. 둘째, 미디어를 제거하여 코팅된 접시에 엑스플랜을 부착합니다. 이렇게 하면 배양 접시와 X 설명 사이의 접촉이 보장됩니다.

셋째, 유모 세포의 섬모가 위를 향하도록 설명의 방향을 지정합니다. 이 오리엔테이션은 배양 접시에 대한 엑스플랜의 준수를 용이하게 할 것입니다. 마지막으로, 200 마이크로 리터 피펫을 사용하여 130 마이크로 리터의 혈청 배양 배지를 장기 표면에 조심스럽게 두 방울을 떨어 뜨린 다음 나머지 부피를 웰 측면에 천천히 추가하고 엑스플란을 조심스럽게 인큐베이터로 옮긴 다음 37 % 이산화탄소가 존재하는 곳에서 섭씨 5도를 배양합니다.

이러한 배양은 7일에서 10일 동안 유지될 수 있습니다. 일부 예로는 R-T-P-C-R 또는 NC two hybridization을 사용한 유전자 발현 분석, 나선형 신경절 세포 또는 외인성 줄기 세포를 이용한 코르티코 배양 기관 또는 유모 세포 사멸의 체외 분석 등이 있습니다. 이 절차의 유용성을 입증하기 위해 explan 배양에서 외인성 유전자를 발현하기 위해 실험실에서 일반적으로 사용되는 한 가지 기술을 보여드리겠습니다.

이 시연을 위해 고립된 코르티 기관은 DS 레드 리포터 유전자를 구성적으로 발현하는 발현 벡터를 가진 전기 퍼레이드가 될 것입니다. 전기천공법 후, 배양액은 형질주입 절차를 향상시키기 위해 24시간 동안 몇 가지 유전자 6개 형질주입 시약으로 배양됩니다. 이 시스템을 사용하면 형질주입된 세포는 24시간 이내에 세포질 적색 형광을 나타냅니다.

먼저, 3밀리리터의 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관에서 DNA를 표적화하기 위해 FU gene six transfection 시약을 3:2 비율로 준비합니다. 층류 후드에서 원예 기관에서 배양 배지를 제거합니다. 130마이크로리터의 물을 1분 동안 추가한 다음 200마이크로리터 용량의 피펫을 사용하여 제거합니다.

다음으로, 물 1ml당 2mg의 플라스미드 DNA의 원액에 저장된 DS red reporter plasmid 30μl를 추가합니다. electroporation의 경우 BioRad 유전자 Pulser Excel을 사용하여 전기 펄스를 생성합니다. 전극은 우리의 목적에 맞게 기계 공장에서 맞춤 제작되었으며, 전극은 90도 각도로 구부러지고 패들 모양으로 압착

마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 전기의 전극을 전진시켜 양극과 음극이 배양의 양쪽에 있도록 합니다. 27볼트와 30밀리초 지속시간으로 구성된 10개의 펄스 트레인을 생성하여 리포터 유전자를 장기 어코드 엑스플랜 배양으로 전기 정제합니다. 그런 다음 5분 정도 기다립니다.

다음으로, 130 마이크로 리터의 FU 유전자 6 DNA 용액을 엑스플란에 첨가 한 다음 하룻밤 동안 5 % 이산화탄소가있는 상태에서 섭씨 37도에서 배양한다. 다음날 2ml의 혈청을 배양에 추가하고 각 플레이트에 배지를 추가합니다. 엑스플랜 배양은 24시간 후 6일 이상 유지될 수 있습니다.

형질 주입된 세포는 epi 형광 현미경에서 SI 3 필터를 사용하여 볼 수 있습니다. 우리는 방금 코르테 오르간의 격리와 1차 배양에 대한 방법을 보여드렸습니다. 이 방법은 배아 16일째부터 출생 후까지의 어린 쥐에 적용되며, 이 시점에서 달팽이관은 해부를 번거롭게 만들 만큼 충분히 석회화됩니다.

또한, 우리는 외인성 유전자를 배양된 코드 기관으로 발현하는 방법을 입증했습니다. 이것은 배양 된 엑스플란에서 수행 할 수있는 한 가지 유형의 실험의 예입니다. 의심할 여지 없이 이 기술에는 다양한 용도

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.