라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

이 동영상은 혈세포를 이미지화하기 위해 초파리 배아를 장착하는 절차를 보여줍니다. 그들의 배아 대식세포. 배아는 하룻밤 동안 산란 케이지에서 사과 주스 한천 접시에 파리에 의해 낳습니다.

다음날 농업 플레이트를 제거하고 배아를 농업 플레이트에서 세포 여과기로 세척한 후 파편을 제거하기 위해 추가 세척을 합니다. 배아를 포함하는 세포 여과기는 배아를 코팅하기 위해 표백제에 담근다. 표백제를 씻어낸 후 배아는 물방울로 옮겨집니다.

그런 다음 물방울을 흡인하고 배아를 헬로 카본 오일로 덮습니다. 세포가 보이는 적절하게 병기된 배아는 두 개의 부착된 커버 슬립 사이의 멤브레인당 페트리로 옮겨지고 오일로 조심스럽게 정렬됩니다. 그런 다음 세 번째 커버 슬립을 배아 위에 놓고 손톱 광택제로 제자리에 붙입니다.

배아 내 혈구 세포의 운동성은 이제 현미경의 맨 위 커버 슬립을 통해 이미지화할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 런던 킹스 칼리지(Kings College London)의 분자 생물물리학 및 서울 임대 부서의 브라이언 스트름(Brian Strm) 연구실의 제니퍼 자에드(Jennifer Zaed)입니다. 저는 바스 대학교 생물학 및 생화학과 우드 랩의 이안 에반스입니다.

오늘 우리는 Josephs bryo를 이 유기체의 배아 대식세포인 헤모 사이트(hemo site)에 장착하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 이 절차를 사용하여 이러한 중요한 면역 세포와 이러한 과정을 수행하는 데 사용하는 세포골격 기계에 대한 발달 분산 및 바람 반응을 연구합니다. 시작하겠습니다.

UAS 제어 하에 적절한 TRO, 혈세포 특이적 gal four driver 및 유전적으로 암호화된 형광 리포터를 포함하는 OAL 라인을 확보하여 이 절차를 시작합니다. 여기서 serpent gal four는 UAS Red Stinger의 형광 적색 핵 마커의 발현을 유도하는 데 사용됩니다. 권장되는 GAL 4 드라이버 및 UAS 구성의 범위에 대한 논의는 함께 제공되는 서면 프로토콜 장소 20 암간의 초파리를 산란 케이지에

산란 케이지는 플라스틱 튜브 바닥에 장착된 55밀리리터 사과 주스 농업 플레이트로 구성되어 있으며 공기 흐름을 허용하기 위해 다른 쪽 끝을 거즈로 덮고 있습니다. 또는 간단한 플라스틱 피커를 구멍과 함께 사용할 수 있습니다. 바닥을 뚫고 파리가 적응한 후 최소 2일 동안 파리가 산란 케이지에 적응할 수 있도록 하고 새로운 예열 사과 주스 화격자로 변경하고 파리가 섭씨 25도에서 밤새 낳을 수 있도록 합니다.

보다 신중하게 단계화된 배아의 수집에 관한 정보는 함께 제공되는 서면 프로토콜을 참조하십시오. 파리가 알을 낳기에 적절한 시간 동안 부화하면 세척 병을 사용하여 약 3ml의 물을 접시에 바르십시오. 그런 다음 부드러운 끝이 있는 붓을 사용하여 사과 주스에서 배아를 제거하고, 제거된 배아는 비커 위에 세포 여과기를 들고 육안으로 쉽게 볼 수 있습니다.

사과 주스의 물을 세포 여과기에 부어 배아를 수집합니다. 그런 다음 사과 주스에 물을 더 넣으십시오. 아테. 원하는 수의 배아가 수집될 때까지 변형 과정을 반복합니다.

다음으로, 세척 병을 사용하여 약 10ml의 물을 사용하여 세포 여과기의 배아를 세척합니다. 배아를 씻은 후 세포 여과기를 사과 주스 Aerate의 뚜껑에 놓습니다. 배아를 코팅하기 위해 세포 여과기에 배아를 현탁시킬 수 있을 만큼 깔끔한 표백제를 추가합니다.

세포 여과기와 페트리 접시 뚜껑을 해부 현미경으로 옮겨 배아의 장식을 따릅니다. 명시야 조명 아래에서는 등쪽 부속물이 용해되었을 때 장식이 완료되며, 이는 2분 이내에 발생해야 합니다. 장식이 완료되면 표백제에서 배아가 들어 있는 세포 여과기를 제거하고 다시 여과기를 비커 위에 올려 놓습니다.

세척 병을 사용하여 잔여 표백제를 부드럽지만 철저히 씻어냅니다. 세포 여과기 아래쪽에 파란색 실험실 조직을 바르고 남은 수분을 닦아냅니다. 파란색이 흰색 또는 분홍색으로 변하는 잔류 표백제가 있는 경우 다음 단계를 진행하기 전에 표백제의 모든 흔적이 제거되었는지 확인하여 계속 세탁하십시오.

세포 여과기에서 과도한 수분을 제거하면 다음 단계에서 페인트 브러시로 배아를 더 쉽게 집어낼 수 있습니다. 배아에서 표백제를 모두 제거했으면 고운 붓으로 페트리 접시 뚜껑에 물방울을 떨어뜨립니다. 여과기에서 코팅된 모든 배아를 수집하고 액적에 다시 현탁시킵니다.

다음으로, 세포 여과기 외부에 화학 물티슈를 바르고 배아를 건조시킵니다. 배아가 건조되면 모든 배아를 덮을 수 있도록 헤일로 카본 오일 한 방울, 700을 추가합니다. 그런 다음 배아가 들어 있는 물방울 옆에 두 번째 작은 기름 한 방울을 놓습니다.

형광 해부 현미경으로 배아를 검사합니다. 세포의 측면 이동을 이미지화하기 위해 원하는 유전자형의 적절하게 단계화된 배아를 식별합니다. 복부 정중선에.

13-14 단계를 선택하십시오. 이 예에서 그는 형광 핵에 의해 식별되며 머리와 복부 신경삭 및 발달 중인 등쪽 혈관을 따라 볼 수 있으며 배아를 통해 분산된 후 혈관의 운동성을 이미지화하려면 15단계 배아를 선택합니다. 이 단계에서 혈모는 전체 배아로 분산됩니다.

그러나 3개의 평행한 혈구는 정중선에서 측면 이동을 따라 배아의 복부 쪽에서 볼 수 있어야 합니다. 배아가 선택되면 구부러진 5번 워치메이커 집게를 사용하여 선택한 배아를 퍼냅니다. 바이알 멤브레인에 구멍이 나지 않도록 주의합니다.

그런 다음 50mm 페트리 펌 루맥스 접시 밑면에 있는 두 번째 기름 한 방울에 배아를 놓습니다. 헤일로 카론 오일 700 두 방울을 약 1cm 간격으로 떨어뜨립니다. 해부 현미경의 명시야 조명 아래 각 방울에 커버 슬립을 적용합니다.

구부러진 집게를 사용하여 최대 15개의 배아를 조심스럽게 이식합니다. 배아를 배쪽 쪽이 위로 향하게 하고 덮개 가장자리와 평행하게 정렬합니다. 배아가 작은 기름 한 방울에 정렬되면 미끄러지고 두 덮개 사이에 균질한 층을 형성하기 위해 퍼질 수 있습니다.

오일이 바른 후 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 배아가 여전히 배쪽에 있는지 확인하십시오. 배아가 약간 굴러간 경우 사이드를 위로 합니다.

집게로 다시 위치를 변경하십시오. 마지막으로 세 번째 핀셋을 사용합니다. 배아 위에 세 번째 커버 슬립을 놓습니다.

이전에 부착된 두 개의 커버 슬립을 연결합니다. 이 커버 슬립을 커버에 붙입니다. 슬립은 매니큐어 사용을 지원합니다.

이제 배아를 이미징할 준비가 되었습니다. 이 SRP gal four UAS Red Stinger 배아는 복부 쪽이 위로 향하게 장착되었으며 Leica M 2 0 5 형광 해부 현미경에서 타임랩스 이미지를 획득했습니다. He cyte는 빨간색으로 표시된 핵으로 시각화됩니다.

영화는 발달 단계 12-13에서 he cytes가 머리를 떠나 복부 정중선을 따라 이동하는 것으로 시작됩니다. 약 1시간 후, 그는 cytes가 정중선에서 벗어나 복부 표면을 따라 측면 위치로 분산되기 시작합니다. 나머지 개발 기간 동안.

헤모 세포는 매우 활동적이며 배아 전체로 이동합니다. 우리는 움직임을 따르기 위해 조셉 배아를 모니터링하는 방법 또는 혈액 쪽이 생체 내에서 살아가는 방법을 보여줘야 합니다. 이 절차를 수행할 때 배아가 기름에 들어가면 배아가 손상되지 않도록 특히 페트로 펌 접시에서 배아를 조심스럽게 다루는 것이 중요하지만 배아가 기름에 들어가면 상대적으로 탈수에 강하지만 코리온을 제거할 때 배아를 너무 오래 표백하지 않도록 주의해야 합니다.

마지막으로, 여러 개의 배아를 장착하면 라이브 이미징을 위한 완벽한 방향의 배아를 얻을 수 있는 최상의 기회를 얻을 수 있습니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.