Name: 라이브의 자기 공명 분광학 Drosophila melanogaster 매직 앵글 스피닝를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-15T16:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 학습하세요 생체 Drosophila melanogaster의 분자 특성화를 위한 고해상도 마법각 회전 양성자 자기공명분광법(HRMAS 1H-MRS)을 사용하는 방법을. 이 비침습 기술은 대사 과정 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 로렌스 G. Rahme에 건강 (NIH) 부여 AI063433의 국립 연구소, 로날드 G. 톰프킨스 (A. 아리아 Tzika의 원장 건강의 국립 연구소 연구소 (NIH) 센터 그랜트 (P50GM021700)에 의해 부분적으로 지원되었다 A. 아리아 Tzika 어린이 연구 부여 (# 8893)에 대한 NMR 코어) 및 슈라 이너 병원. 우리는 Dionyssios Mintzopoulos 박사 감사 이 프로토콜 및 Ovidiu C. Andronesi 박사를 개발의 초기 단계에서 도움을 TOBSY 펄스 시퀀스를 지원.

1 부 : HRMAS 측정 준비 Drosophila <ol><li> 표준 flylab 절차 1을 사용, 새로 3 일간 파리 eclosing 신선한 플라이 음식을 포함하는 튜브를 비행을 전송 수집합니다. 파리 방금 전에 실험 5~8일 이전 될 수 있도록 오일에 대한 수집 파리 알을 품다. 단 하나의 성별은 (보통 남성) 실험에 사용됩니다. </li><li> 건강을 사용, 손상 야생 유형은 예를 들어 충격이나 유전자 파리 1 개조 치료와 비교 날아. </li><li> 이전 실험 비행 식품 24 시간 조각 (~ 0.2ml)을 포함 2ml 튜브에 하나의 파리를 놓습니다. 이러한 튜브는 불꽃 - 온수 인슐린 바늘을 사용하여 만든 튜브 컵에 구멍을 부담. </li><li> 고정밀 밸런스를 사용하여 비행 삽입 전후 바로 튜브를 저울질하고 후자에서 첫 번째 가치를 빼서 각 비행기의 무게를 정의합니다. 한 남자 비행은 일반적으로 0.7-1 MG 무게. </li></ol> 2 부 : HRMAS의 로터 준비. <ol><li> 플라이 내부를 마취하는 분도 위해 얼음에 하나의 튜브를 놓으십시오. </li><li> 얼음에 위치 알루미늄 호일의 레이어에 파리를 틀어서 플라이 부상을 피하면서 전체 비행 삽입을 보장하기 위해 부드러운 브러시를 사용하여 NMR의 회전자의 삽입의 semispherical 빈 공간으로 부드럽게 날아 밀어. </li><li> 회전자의 회전자 삽입하고 아래 (figure1 참조) 사이의 파리를 찾습니다 지르코늄 산화물 (ZrO 2) 로터 튜브 (4mm 직경 50 μl)에 삽입 놓습니다. </li><li> 나사와 삽입을 닫고 비행 및 TSP 표준 용액 (TSP 사이의 접촉을 방지하기 위해 parafilm (figure1 참조)로 커버 : δ trimethylsilyl - 프로피 - 2 ,2,3,3 - D4 산, MW = 172, = 0.00 PPM, 진정제를 맞았을 물에 - D 2 O, 공명 화학 변화와 부량 모두에 대해 참고로 그 함수)에서 50 MM. </li><li> 회전자 삽입 위에 TSP 표준 용액의 8 μl를 추가합니다. (그림 1 참조). </li><li> 안전하고 (그림 1 참조) 최고의 모자와 로터에 설정된 전체를 조입니다. </li></ol> 파트 3 : HRMAS 데이터 수집 <ol><li> HRMAS 프로브에 날개를 소개하고 마법의 각도 54.7 ° (그림 1 참조)에서 위치를. </li><li> MAS의 공압 장치와 함께 BTO - 2000 단위로 4 ° C에서 온도를 설정합니다. 파리는 마취를 유지하는 분광계 4 ° C의 동안에 보관됩니다. </li><li> 2 kHz에서 매스에서 HRMAS 1 H MRS 회전 속도를 설정합니다. </li><li> MAS 속도 ​​컨트롤러 (회전 주파수)에 의해 2.0 ± 0.001 kHz에서에서 MAS 회전 주파수를 안정화. </li><li> 자석 준비 : 조정 및 최적의 성능과 심 스펙트럼의 최적의 품질에 대한 자석 코일을 일치합니다. </li><li> 에 T 2 필터로 작동 [N - 인수 - - (τ τ - 180 °) 90 °], 카 - 퍼셀 - Meiboom - 길 (CPMG) 스핀 에코 펄스 시퀀스 2, 동기 로터를 사용하여 1 차원 1 H 스펙트럼을 취득 모든 샘플 한 차원 데이터를 획득하기 위해 스펙트럼 확대 1 H NMR 단일 플라이 스펙트럼을 제거합니다. MAS 회전 주파수 (2 kHz에서)에 간 펄스 지연 (τ = 500μs) 동기화. 32,768 (32K) 데이터 지점과 256에 과도의 개수를 설정합니다. 수집 시간 9 분. </li><li> 단열 펄스 3 TOBSY 순서를 사용하는 모든 샘플에서 2 차원 (2D) 1 H - 1 H NMR HRMAS 단일 플라이 스펙트럼을 습득. 인수 매개 변수는 다음과 같습니다 2K 데이터 포인트를 직접 치수 (11 PPM 스펙트럼 폭), 1 S 완화 지연 중에 물을 미리 채도, 증가 당 8 스캔,​​ 128 단위, 2의 총 반복 시간, 45 MS 믹싱 시간, 총 인수 29 분 시간. </li></ol> 4 부 : 데이터 처리 / 분석 <ol><li> MestReC 소프트웨어 (Mestrelab 연구 www.mestrec.com)를 사용하여 표본의 MRspectra를 분석 </li><li> 0.5 Hz의 라인 확대 apodization 기능을 사용하여 이전 푸리에 변환에 대한 모든 HRMAS 1 H의 FIDs에 적용됩니다. </li><li> δ = 0.0 PPM (외부 규격)에서 TSP와 관련하여 MR 스펙트럼을 참조. </li><li> 수동 스펙트럼 위상 및 사전 피크 면적 계산에 대한 기준의 광범위한 구성 요소를 뺄 휘태커 기준 견적 도구 (Traffic Estimator)를 적용합니다. </li><li> MestReC 소프트웨어를 사용하여 최대 영역을 예상하고있다. 존중 스케일 최고점은 각 인수 스펙트럼 (TSP 피크 높이 = 1) TSP 수 있습니다. 사이 그룹 비율로 내에서 - 그룹을 비교하는 T - 테스트 (2 꼬리, P는 &lt;0.05)를 사용합니다. </li><li> 2D TOBSY 프로세스 매개 변수는 다음과 같습니다 두 차원에 QSINE = 2 창 기능, 직접 치수 두 번째 차원, 두 번째 차원의 두 차원과 기본 수정의 위상 보정에 1K에 제로 채울 2K 점 FT. </li><li> 스파키 프로그램 (TD 고더드 및 DG 넬러, 스파키 3, USCF 사용 2D 스펙트럼 제작 <a href="http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/">http://www.cgl.ucsf.edu/을</a>홈 / 스파키 /) </li></ol> 제 5 부 : 대표 스펙트럼 라이브 Drosophila melanogaster에서 난다 절차는 라이브 Drosophila melanogaster의 파리에서 재현할 수 스펙트럼을 수집하는 것을 허용 위에서 설명한. 야생 형 (WT) 오레곤 - R 인수 그림 2, 3 쇼 대표 MR 스펙트럼 난다. 그림 2 선물 1D 1 H HRMAS CPMG 스펙트럼에게. 주요 지질 구성 요소 [C H 3 (0.89 PPM), (C H 2) N (1.33 PPM), C H 2 C - CO (1.58ppm), C H 2 C = C (2.02 PPM), C H 2 C = O (2.24 PPM), C H = C H (5.33 PPM)], 글리세롤 (1,3 - C H 4.10 PPM과 4.30 PPM, 2 - CH 2 5.24 PPM), 그리고 작은 metabolites : β - 알라닌 (β - 에이러 , 2.57 PPM), 아세테이트 (AC, 1.97 PPM), phosphocholine (PC, 3.22 PPM)와 phophoetanolamine (PE, 3.23ppm)를 감지하고 사전에보고 4, 5에 따라 배정했다. 2.02 PPM에서 신호는 모노 - 불포화 지방산 (즉 palmitoleic)의 C H2 - CH = CH 잔기의 메틸렌의 양자에 할당되었습니다. 불포화 지방산은 - CH = CH - 잔기의 양자에 의해 만들어진 5.33 PPM에서 신호를 식별했습니다. 할당할 수 없습니다거나 1D 스펙트럼을 사용하여 표시되지 않은 수 작은 metabolites은 2D 1 H - 1 H를 사용하여 감지되었습니다 TOBSY HRMAS (그림 3 참조). <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 실험은 생체내에의 준비 진정제를 맞았을 물에 14.1 T. 외부 표준 trimethylsilyl - 프로피 - 2 ,2,3,3 - D4의 산성 (TSP / D 2 O)에서 살고 Drosophila의 조사 HRMAS 1H MRS. HRMAS 프로브에있는 마법의 각도에서 로터 위치 : 광장에서. <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. Drosophila melanogaster 라이브 WT 날아의 생체내 1D HRMAS 1 H CPMG 스펙트럼에서. 지질 구성 요소 : C H 3 (0.89 PPM), (C H 2) N (1.33 PPM), C H 2 C - CO (1.58ppm), 아세테이트 (AC), C H 2 C = C (2.02 PPM), C H 2 C = O (2.24 PPM), (β - 에이러) β - 알라닌, phosphocholine (PC)와 phophoetanolamine (PE), 글리세롤 (1,3 - C H 4.10, 4.30 PPM, 2 - C H 2 5.22 PPM) , C H = C H (5.33 PPM). <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 생체내 2D 1H - 1H에 14.1 T. 중소 metabolites 및 지질 구성 요소에 살고 Drosophila melanogaster WT 날아의 TOBSY HRMAS 스펙트럼이 확인되었습니다. Metabolites : 알라닌 (에이러), (β - 에이러) β - 알라닌, 아르기닌 (ARG), 글루타민 (Gln), 글루 탐 산염 (GLU), PC의 phosphocholine (PC), phophoetanolamine (PE), 타우린 (타우), α - 포도당 (α - Glc)과 글리세롤. Lipids 구성 요소 : C H 3 (0.89 PPM), (C H 2) N (1.33 PPM), C H 2 C - CO (1.58 PPM), C H 2 C = C (2.02 PPM), C H 2 C = O (2.24 PPM), C H = C H (5.33 PPM).

<ol><li>Apidianakis, Y., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+host+for+studying+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).</li>
<li>Meiboom, S., Gill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+spin-echo+method+for+measuring+nuclear+relaxation+time%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time.</a> Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).</li>
<li>Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+NMR+adiabatic+TOBSY+sequences+provide+enhanced+sensitivity+for+multidimensional+high-resolution+magic-angle-spinning+1H+MR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy.</a> J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).</li>
<li>Astrakas, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+NMR+spectroscopy+shows+lipids+accumulate+in+skeletal+muscle+in+response+to+burn+trauma-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis.</a> Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).</li>
<li>Fan, T. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+profiling+by+one-+and+two+dimensional+NMR+analysis+of+complex+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Nuc+Magn+Reson+Spec%22%5BJournal%5D)">Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures.</a> Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).</li>
<li>Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution%2C+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+of+Drosophila+at+18.8+Tesla%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla.</a> PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).</li>
<li>Zektzer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+signal+to+noise+in+high-resolution+magic+angle+spinning+total+correlation+spectroscopy+studies+of+prostate+tissues+using+rotor-synchronized+adiabatic+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses.</a> Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).</li>
</ol>

동물 실험은 매사 추세츠 종합 병원 기관 동물 연구 검토위원회위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

과일의 생체내 MRI에의 가능성의 최근 보고서를 제외하고 6 파리, Drosophila의 생체내 MRS 연구 아직보고되지 않았습니다. 현재 프로토콜, 우리는 생물학적으로 중요한 분자를 검출 생체내 HRMAS 1 H - MRS 방식의 소설의 구현을 설명합니다. 제로 파리 사망률을 달성하면서 특히, 우리는 lipids, 라이브 Drosophila의 작은 metabolites 충분한 수집 시간을 허용 약 45 분에서 14.1 T에서 파리를 발견했습니다. TOBSY의 로터 - 동기 워스트 - 8 단열 펄스 (C9 1 15)의 사용은 이전과 계약에 만족스러운 SNR과 등방성 혼합 펄스 (MLEV - 16) 사용에 상대 조직 스펙트럼 좋은 해상도를 얻기 위해 우리를 허용 보고서 3, 7. Drosophila의 개선 대사 프로필을 ...

<table><tbody><tr><td>중수</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>3-(트리메틸실릴)프로피온산-2,2,3,3-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 산</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24493-21-8</td><td></td></tr><tr><td>한천, 수크로스, 효모, 옥수수 가루</td><td>먹이</td><td>Genesee Scientific</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.flystuff.com/&quot;&gt;http://www.flystuff.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Oregon RS 또는 Canton-S 초파리</td><td>성체 초파리 계통</td><td>Bloomington Stock center</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://flystocks.bio.indiana.edu/&quot;&gt;http://flystocks.bio.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>페인트 브러시</td><td>장비</td><td></td><td></td><td>(크기 0)</td></tr><tr><td>2ml 튜브</td><td>장비</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749521-1590</td><td></td></tr><tr><td>초파리 배양기</td><td>장비</td><td></td><td></td><td>높은 습도 유지 능력(60-75%), 조절 가능한 온도 및 12시간:12시간 명:암 주기.</td></tr><tr><td>Bruker Bio-Spin Avance NMR 분광기 (600.13 MHz) 4mm triple resonance (&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;H, &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C, &lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H) HRMAS 프로브 </td><td>장비</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAS 공압 장치와 결합된 BTO-2000 유닛</td><td>장비</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4mm 지르코늄 옥사이드 로터 (용량 50 ul)</td><td>장비</td><td>Bruker Corporation</td><td>B3829 (Bruker store)</td><td></td></tr><tr><td>MestReC (Mestrelab Research) </td><td>소프트웨어</td><td></td><td></td><td>1D NMR 스펙트럼 분석&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://mestrelab.com/&quot;&gt;http://mestrelab.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SPARKY 3, USCF</td><td>소프트웨어</td><td></td><td></td><td>2D NMR 스펙트럼 분석&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/&quot;&gt;http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

라이브의 자기 공명 분광학 drosophila melanogaster 매직 앵글 스피닝를 사용하여

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

고해상도 매직 각도 스피닝 (HRMAS) 프로톤 자기 공명 분광 (<sup&gt; 1</sup&gt; H - MRS) 스펙트럼 라인 폭을 향상시키고 추출, 손상 세포, 세포 배양, 그리고 더 중요한 것은 그대로 조직에서 얻을 수 고해상도 스펙트럼은 metabolites와 셀룰러 프로세스 간의 관계를 조사 수있는 새로운 비파괴 기술입니다.<em&gt; 생체내에서</em&gt; HRMAS<sup&gt; 1</sup&gt; H - MRS 연구 라이브 과일 파리에보고해야 아직<em&gt; Drosophila melanogaster.</em&gt;<em&gt; Drosophila,</em&gt; 간단한 유전자 유기체로, 여러 생물 학적 기능과 다양한 evolutionarily 보존 신호 경로가 전체 유기체 수준에서 검사 수 있으며 그것은 유전자와 생리를 조사하는 유용한 모델입니다. 이를 위해, 우리는 개발 및 구현<em&gt; 생체내에</em&gt; HRMAS<sup&gt; 1</sup라이브 조사&gt; H - MRS 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 여기 14.1 T.에서 우리는 HRMAS을 설명<sup&gt; 1</sup의 분자 특성에 대한&gt; H - MRS 프로토콜<em&gt; Drosophila</em&gt; HRMAS 프로브가 장착된 기존의 MR 분광계와 함께. 이 기법은 소설이다<em&gt; 생체내에</em&gt; 비파괴<em&gt; Drosophila</em따라서 질병 생체 식별을 가능하게하고&gt; 신진 대사 측정 방법은, 소설 치료 발전에 기여 수 있습니다.

이 기술은 생활의 분자 특성에 대한 양성자 MR 분광법 (1H - MRS HRMAS)를 회전 고해상도 마법 각도의 사용을 가능하게<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; 기존의 14.1 테슬라 분광계와이 HRMAS 프로브가 장착된.

라이브의 자기 공명 분광학 Drosophila melanogaster 매직 앵글 스피닝를 사용하여

고해상도 매직 각 스피닝(High-Resolution Magic Angle Spinning, HRMAS) 양성자 자기공명분광법(1H-MRS)은 스펙트럼 분해능을 향상시키는 새로운 비파괴적 기술로...

실험 24시간 전에 수컷 초파리를 2 mL 튜브에 넣습니다. 얼음냉각 마취를 짧게 실시한 후, 초파리를 NMR 로터 인서트로 밀어 넣고 이를 다시 로터 튜브에 넣습니다. 로터 인서트 위에 TSP 표준 용액을 첨가한 다음, 상단 캡으로 로터를 닫습니다.로터를 H-R-M-A-S 프로브에 삽입하고 매직 각도인 54.7 degrees에 위치시킵니다. 분광계를 설정하여 1차원 및 2차원 실험 데이터를 수집합니다. 마지막으로, 시료의 Mr.Spectra를 분석합니다.안녕하세요, 저는 매사추세츠 종합병원 및 하버드 의과대학 외과부 NMR 수술 실험실의 Valeria Rigi입니다. 안녕하세요, 저는 매사추세츠 종합병원 및 하버드 의과대학 외과부 분자 수술 실험실의 Y AB입니다. 안녕하세요, 저는 매사추세츠 종합병원 및 하버드 의과대학 외과부 및 분자 수술 실험실의 소장인 Lawrence Achman입니다.저는 Massachusetts Journal Hospital의 NMR 외과 실험실 소장이자 Harvard Medical School의 Aula Martin Center 소속인 Mario Zika입니다. 오늘은 고해상도 스핀 자기 공명 분광법(high-resolution spinning magnetic resonance spectroscopy)을 이용한 대형 Melanogaster의 분자 특성 분석 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 새로운 치료제 개발에 기여하는 질병 바이오마커를 식별하기 위해 이 절차를 사용하여 생체 내 Sila 대사물을 연구하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.3일 동안 갓 우화한 초파리를 수집하여 신선한 초파리 배지가 들어 있는 바이알로 옮겨 준비를 시작합니다. 수집한 초파리를 5일 동안 배양하여 실험 직전에 5~8일령이 되도록 합니다. 본 실험에서는 수컷 초파리만을 사용합니다.화염으로 가열한 인슐린 바늘을 사용하여 튜브 캡에 구멍을 내어 초파리용 2 mL 실험 튜브를 준비합니다. 실험 24시간 전에 초파리 먹이가 들어 있는 튜브에 초파리를 한 마리씩 넣습니다. 고정밀 저울을 사용하여 초파리를 넣기 직전과 직후의 튜브 무게를 측정하고, 두 값의 차이를 계산하여 각 초파리의 무게를 정의합니다.준비된 수컷 초파리 한 마리의 무게는 보통 0.7에서 1mg 정도입니다. 고해상도 매직 각도 회전(high resolution magic angle spinning, H-R-M-A-S) 로터 준비 과정을 살펴보겠습니다. 우선,튜브 하나를 얼음 위에 1분 미만으로 둡니다. 튜브 안의 초파리를 마취시키려면, 얼음 위에 놓인 알루미늄 호일 층 위에 초파리를 올리고 부드러운 붓을 사용하여 NMR 인서트의 반구형 오목한 공간으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 초파리에 부상이 발생하지 않도록 주의하면서 완전히 삽입되었는지 확인합니다.인서트를 지르코늄 산화물 로터 튜브에 넣어 초파리가 로터 인서트와 로터 바닥 사이에 위치하도록 합니다. 이제 나사로 인서트를 닫고 파라필름으로 덮어, 공명 화학적 이동 및 정량 분석의 기준점으로 작용하는 TSP 표준 용액 내의 초파리와의 접촉을 방지합니다. 로터 인서트 상단에 TSB 표준 용액 8 µL를 추가하고, 상단 캡을 사용하여 전체 로터 설정을 고정하고 조입니다. 이제 HR-MAS 데이터를 획득하는 방법을 살펴보겠습니다.로터를 H-R-M-A-S 프로브에 삽입하고 매직 각도인 54.7 degrees로 위치시킵니다. 다음으로, H-R-M-A-S-H one MRS 회전 속도를 2 kHz MAS로 설정하고 MAS 속도 제어기를 사용하여 이를 안정화합니다. BTO 2000 장치로 온도를 4 °C로 설정합니다.MAS 공압 장치와 결합하여 사용합니다. 자석을 준비하고, 최적의 성능을 위해 코일을 튜닝 및 매칭하며, 최적의 스펙트럼 품질을 위해 자석을 심(shim) 하는 동안 마취 상태를 유지하기 위해 분무형 파리를 분광계 내에서 4 °C로 유지합니다. 심 과정이 완료되면, INTERPULSE 지연 시간을 MAS 회전 주파수에 동기화하십시오.트랜지언트 수를 256으로, 데이터 포인트 수를 32,768으로 설정하십시오. 로터 동기화 카, Purcell MEO kill 또는 CPMG 스핀 에코 펄스 시퀀스를 사용하여 1차원 싱글 플라이 스펙트럼을 획득하십시오. 이 시퀀스는 스펙트럼 확장(spectral broadening)을 제거하는 T2 필터 역할을 합니다.이제 atic 펄스가 포함된 topsy 시퀀스를 사용하여 모든 시료에 대해 2차원 단일 플라이 스펙트럼을 획득하십시오. 로터를 열고 플라이를 꺼냅니다. 이제 데이터를 분석하는 방법을 살펴보겠습니다.우리는 표본의 MR 스펙트럼을 분석하기 위해 mare 소프트웨어를 사용합니다. 먼저, 0.5 hertz 선폭 확장(line broadening) 함수를 사용하여 푸리에 변환(Fourier transformation) 이전에 모든 HRM A SH one fis에 적용합니다. delta가 0.0 parts per million인 TS P를 기준으로 MR 스펙트럼의 참조를 설정합니다.스펙트럼의 위상을 수동으로 보정하고, 피크 면적을 계산하기 전 베이스라인의 광범위한 성분을 제거하기 위해 Whitaker 베이스라인 추정기를 적용합니다. mastre 소프트웨어를 사용하여 피크 면적을 추정합니다. 획득한 각 스펙트럼에 대해 TSP를 기준으로 피크 높이를 스케일링합니다.이제 몇 가지 대표적인 MRS 결과를 살펴보겠습니다. 여기에 표시된 것은 웰 타입 Oregon R 초파리에서 얻은 대표적인 1H-RMSCPMG 스펙트럼입니다. 주요 지질 성분인 glycerol과 beta alanine, acetate, phosphocholine, phosphoethanolamine과 같은 소분자 대사물이 검출되었으며, 이전 보고서들에 따라 할당되었습니다. 2.02 ppm의 신호는 단일불포화 지방산의 프로판 부분에 있는 메틸렌 양성자로 할당되었습니다. 불포화 지방산은 알킨 부분의 양성자에 의해 생성된 5.33 ppm의 신호로 확인되었습니다.1D 스펙트럼을 사용하여 할당할 수 없었거나 보이지 않았던 작은 대사물질들은 2D 1H 1top Z-H-R-M-A-S를 통해 검출되었습니다. 이로써 고해상도 매직 앵글 스피닝 자기공명 분광법(high resolution magic angle spinning magnetic resonance spectroscopy)을 이용하여 살아있는 초파리의 생화학적 프로필을 연구하는 방법을 처음으로 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 초파리에 상처를 입히지 않고 넣기 위해 부드러운 핀셋을 사용하는 것이 중요합니다.나사를 너무 세게 조여 곤충의 체벽이 손상되지 않도록 주의하십시오. 또한 초파리가 생존하지 못할 수 있으므로 1시간 이상 스펙트럼을 측정하지 마십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

이 프로토콜은 전자 스핀 공명 현미경 살아있는 세포의 즉각적인 환경에서 산소 농도의 미크론 스케일 입체 영상을위한 방법을 설명합니다.

전자 스핀 공명 산소 매핑에 대한 라이브 종의 마이크로 이미징

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

이 프로토콜 비용 효율적이 고 편리한 약리학 대리인, 신경 단백질의 유전자 돌연변이의 테스트를 가능 하 게 초파리 melanogaster 중앙 신경 시스템의 하강 전기 활동을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 또는 미개척된 생리 적인 통로의 역할입니다.

제 3-탈피 초파리 Melanogaster 의 중앙 신 경계 활동의 electrophysiological 녹음

여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

여기에 제시된 것은 동결된 시료를 동적 핵 편광(DNP) 매직 앵글 방적(MAS) 핵자기 공명(NMR) 프로브로 전송하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜에는 실험 전의 로터 저장 방향과 실험 전후의 생존 가능성 측정을 위한 방향이 포함됩니다.

셀룰러 생존력을 보존하는 마법의 각도 회전 핵 자기 공명 분광기에 극저온 샘플 로딩

고체, 액체, 가스 및 혼합물의 분자 구조와 역학은 다양한 과학적 분야에 매우 중요합니다. Situ MAS NMR의 고온, 고압은 엄격하게 통제된 화학 환경에서 혼합 상 시스템에서 성분의 화학 적 환경을 감지할 수 있게 합니다.

고온 및 고압 시상 매직 앵글 회전 핵 자기 공명 분광기

여기에서는 초파리 난소 틈새 시장에서 생식세포 줄기세포(GSC)의 비대칭 분열에 대한 실시간 이미징을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 분광 단백질 Par-1의 녹색 형광 단백질(GFP) 융합을 유비쿼터스하게 발현하는 형질전환 라인을 사용합니다.

여성 Drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징

자기 공명 영상 (MRI)은 유전자 조작 생쥐의 표현형을 조사를위한 점점 인기있는 도구가되고 있습니다. 이 문서는 여러 마우스 MRI를 사용하여 유전자 조작 생쥐의 높은 처리량 phenotyping을 달성하는 데 필요한 방법을 보여줍니다.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

유전자 인코딩 optogenetic 도구에서 특정 뉴런의 비 침투 조작을...

의 이스케이프 문제의 Optogenetic의 자극<em&gt; Drosophila melanogaster</em

학습하세요 생체 Drosophila melanogaster의 분자 특성화를 위한 고해상도 마법각 회전 양성자 자기공명분광법(HRMAS 1H-MRS)을 사용하는 방법을. 이 비침습 기술은 대사 과정 연구에 활용됩니다.

라이브의 자기 공명 분광학 Drosophila melanogaster 매직 앵글 스피닝를 사용하여

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