Name: 이미징 불일치 복구 및 DNA의 손상 세포 응답 바실러스 subtilis /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-08T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 배우세요 Bacillus subtilis에서 GFP 융합 단백질을 이용한 DNA 복구 복합체 실시간 이미징 방법입니다. 이 프로토콜은 세포 손상 반응 및 게놈 안정성 연구에 활용됩니다.

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저자 DRS 감사하고 싶습니다. 처음 형광 현미경으로 마이크로 훈련을위한 Philina S. 리 앨런 D. 그로스맨. 저자는 또한 DRS 감사합니다. 도움말 및 팁 이미징 용 멜라니 Berkmen와 하지메 고바야시. 이 작품은 문학, 과학 예술 대학에서와 미시간 대학에서 분자 세포 및 발달 생물학의학과에서 자금 업을 시작하여 지원했다.

현미경에 대한 세포의 성장 문화 1. 하루나 이틀 전에 영상에, B. 준비 subtilis는 시각화하려는 translational 융합 단백질을 포함하는 변형. 단계 1A와 1B의 평가판 반올림 성장 상태가 변형 최고의 영상을 제공하는 결정하기 위해 필요합니다. 대부분의 경우, 세포는 지수 성장 단계에서 몇 군데해야합니다. <ol class="ualpha"><li> 일부 B. 들어 subtilis의 변종 (때문에 그 내생 로커스에 관심과 GFP의 유전자 사이의 translational 융합의 통합이 저조한 성장 특히, 종자)를, 이전 이미지로 이틀 동안 초기 성장은 높은 품질의 이미지가 필요합니다. 첫 날, 승리 B. subtilis는 선택적 항생제 (S)와 LB 한천에 몇 군데로 부담하고 30 ° C.에 밤새 품어 두 번째 날, 하나의 식민지와 0.85 %의 식염수 100 μl를 예방하고 30 하룻밤 배양하여 다음 각 희석 100 μL를 도금 LB 한천 플레이트 세 10 배 시리얼 dilutions (선택적 항생제), ° C. 수행 셋째 날, 세포의 빛을 합류 성장과 희석 접시를 선택합니다. 접시에 라이트 합류 성장 가능성 (4 단계 참조) 우수한 이미징 결과를 얻을 수있는 건강, 기하 급수적으로 증가 스타터 inoculum로 성장 매체를 제공합니다. 이 단계는 얼룩 FM4 - 64과 함께 최고 품질의 막 영상에 특히 유용합니다. </li><li> 기타 B. subtilis의 변종은 단순히 살균 막대 사전 이미징에 하루 하나의 식민지에 대한 선택적 LB 한천 배지에 적용하고 30 ° C.에서 밤새 품어 수 있습니다 그 다음날,이 접시에 전지 (4 단계 참조) 이미징을위한 inoculum로 사용하기에 충분합니다. 참고 : B. 위해 subtilis은 액체 매체 야간 문화로 인해 지연 위상 성장 1 장기간의 원인이됩니다 포자 형성 및 쿼럼 응답의 조합에 해당되지 않습니다. </li></ol> 2. 영상, 125 ML 살균 Erlenmeyer 플라스크에 S7 50 1-3 매체의 장소 10 ML의 아침. 3. inoculum를 얻는 최대 단일 콜로니 또는 가벼운 합류 세포와 LB 한천 플레이트에서 S7 50 중간 2 ML에 세포를 Resuspend. 4. 0.1 ~ 0.08 600 NM에서 측정 초기 광학 밀도 (OD 600)와 문화를위한 10 ML S7 50 매체를 포함하는 Erlenmeyer 플라스크 충분한 S7 50 중간 세포 inoculum을 추가합니다. 이 단계에서 적어도 10 배 공기 매체 비율을 가지고하는 것이 중요합니다. 따라서, 우리는 125 ML Erlenmeyer 플라스크에 주사 매체의​​ 10-12.5 ML을 사용합니다. 5. 문화 OD 600에게 ~ 0.5-0.8에 도달할 ° C까지 30 각 문화를 성장. 떨고 물 욕조는 150-200에서 분당 회전과 선호하고 있습니다. DNA 손상이나 불일치 유도 요원과 도전 문화는 초기 기하 급수적인 성장 단계에서해야 OD 600 세포 (표 1 참조) 치료를 위해 필요한 성장의 추가 기간 OD 600 목표에 도달할 것으로 예 예를 들어, 2 aminopurine 한 치료 시간 때문에 2 aminopurine 대우 문화, OD 600 ~ 0.3-0.4에서 해당 OD 600에서 치료 / 성장 결과의 한 시간 정도 ~ 0.5-0.8 같은되어야 필요 의하여 세포 이미징을위한 준비가되어 있습니다. 샘플 준비 1. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 교양 세포의 피펫 300 μl. 2. 세포 세포막의 이미지가 원하는 경우, 1 MG / ML 재고 솔루션에서 각 샘플에 얼룩 FM4 - 64 멤브레인 (Invitrogen)를 1:1000 희석를 추가합니다. FM4 - 64의 적정가 원하는 형광 신호를 달성하기 위해 필요할 수 있습니다. 일반적인 적정 범위는 1:100, 1:1000, 그리고 1:10,000이다. 3. 아래에 설명된대로 슬라이드 1X Spizizens 매체에 1퍼센트 아가로 오스와 함께 준비하는 동안 시료가 10 분 또는 상온에서 앉아 ( "슬라이드 준비"의 1 단계 참조) 허용합니다. 4. 세포의 농도가 필요한 경우, 우리는 진공 장치와 필터 0.2 μm의를 사용하여 필터링 세포를 선호합니다. 전지는 부드럽게 PBS 다른 적절한 버퍼 또는 시각화하기 전에 매체와 필터의 표면에서 세탁하실 수 있습니다. 슬라이드 준비 1. 1X Spizizens와 1% 아가로 오스를 준비합니다. 5 0.5 g 아가로 오스와 함께 10X Spizizens 주식의 45 ML ML ddH2O하고, 녹기 전자 레인지를 추가합니다. 뜨거운 용융 아가로 오스는 피펫하기 어려운이며, 아가로 오스는 피펫 팁을 입력하지 않습니다 확정. 아가로 오스는 ° C 피펫 팁을 입력에 대한 내 응고없이 ~ 55-65의 온도로 물을 욕조에 equilibrated되어야합니다 팁. 2. 피펫 팁에 1퍼센트 녹아 아가로 오스와 Spizizens 20 μl을 그립니다. 얕은 아가로 오스 패드를 형성하기 위해 잘 각 슬라이드 (우리는 15 자 슬라이드를 사용하여 표 2 참조)에 아가로 오스 솔루션의 한 방울 (약 1-2 μL)를 피펫. 아가로 오스는 즉시 고체화됩니다. 슬라이드도 세포의 응용 프로그램에 즉시 이전에하셔야합니다. 아가로 오스 패드가 혼자 실온에서 왼쪽으로있다면, 그들은 분 이내 탈수하고 사용할 수 없게 될 수 있습니다. 아가로 오스 패드가 중심하고 각각 기입 잘하지만 coverslip을 방해하지 않도록 최소 높이를해야; 방울이 (거품처럼) 너무 높다거나 예제에서는 잘 경계 너머 펼쳐지면, 간단하게 닦은 Kimwipe로 잘 청소면을 적용 새로운 아가로 오스 패드. 3. 각각의 아가로 오스 패드의 상단에 배포 슬라이드로 전체 300 μl 샘플을 (6 단계 참조) 적용합니다. 세포의이 금액은 슬라이드의 각 우물을 커버하기에 충분해야합니다. 4. 약 10 분 (23 ° C) 실온에서 앉아 세포와 함께 로드된 슬라이드를 허용합니다. 이 단계는 아가로 오스 패드는 이미지에 대한 고정되어 준비되기에 정착하는 세포 수 있습니다. 온도 변화 4 필요한 실험을 수행할 때 전문적인 요구에이 온도 예를 들어, 변경해야 할 수 있습니다. 5. 패드 스스로를 제거하지 않고 각각의 우물에서 초과 매체를 멀리 대기음. 6. 슬라이드 영역에 걸쳐, 부드럽게 확고하게하고 균일하게 눌러하지만, 슬라이드로 coverslip을 적용합니다. 커버 슬립이 슬라이드 반대하고 커버 용지가 슬라이드 위에 제기하지되었는지 확인하십시오. 세포의 시각화 1. 여러 다른 형광 현미경은 잘 작동합니다. 그것은 100X 기름 침지 렌즈를 가지고하는 것이 중요합니다. 시몬스 랩 사용합니다 <ul><li> 1,45 NA TIRFM 100X 오일 침지 목적 렌즈가 장착된 올림푸스 BX61 현미경 </li><li> 하마 마츠 ORCAR이 CCD는 카메라를 냉각 </li><li> 루멘 200 아크 금속 (이전) 광원. </li><li> GFP (FITC), 필터 여기 460-500과 510-560의 배출 감지 </li><li> FM4 - 64 (TRITC), 필터 여기 510-560과 572-648의 배출 감지. </li><li> 이미지 SlideBook 4.2 (그림 1)를 사용하여 캡처한되었습니다 </li></ul> 2. 하얀 빛을 이용하여 초점에 세포를 가져와. 3. 각 형광단에 맞는 필터를 사용하여 이미지를 캡처합니다. 대표 결과 대표 이미지 (그림 1)과 같습니다. FM4 - 64 얼룩은 4-7 밝고 명확해야하는 동안 GFP foci는 잘 정의되어야한다. GFP 또는 막 이미지는 모든 데이터의 손실없이 제시하는 최고 품질의 이미지를 수 있도록 모든 색상과 유사 색 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : B. 대표 GFP 이미지 FM4 - 64 멤브레인 얼룩이 빨간색으로 표시되는 동안 subtilis translational 융합 단백질을. GFP 단백질은 녹색으로 표시됩니다. 흰색 스케일 바는 3 μm의을 나타냅니다 (A) MutS - GFP [관련 유전자형 : mutS - GFP (SPC), amyE : Pspac mutL (CAT)]. 600 μg / ML 2 aminopurine 1 MM의 IPTG의 존재 인치 FM4 - 64 신호가 더 명확하게 MutS - GFP foci를 표시하기 위해 표시하지 않습니다 (B) MutL - GFP [관련 유전자형 : mutL : mutL - GFP (SPC)].. 2 - aminopurine의 존재에 (C) DnaX - GFP [관련 유전자형 : dnaX : dnaX - GFP (SPC)]. (D) RecA - GFP [관련 유전자형 : recA : recA - GFP (SPC)] 20의 존재에 NG / ML mitomycin C. (E) TagC - GFP [관련 유전자형 : tagC : tagC - GFP (SPC) ] 1 μg / ML mitomycin C. 앞에서 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 트리 트먼트 / 농도 또는 양을 </td><td> 기능 </td><td> 부화의 시간 </td></tr><tr><td> Mitomycin C (MMC) [20-150 NG / ML] </td><td> DNA는 에이전트 alkylating </td><td> 일시간 </td></tr><tr><td> 2 aminopu​​rine (2 - AP) [600 μg / ML] </td><td> 불일치 유도 </td><td> 일시간 </td></tr><tr><td> Hydroxyurea (HU) </td><td> dNTPs를 depletes </td><td> 삼시간 </td></tr><tr><td> 자외선 (UV) 20 J/m2 </td><td> Thymine - thymine dimers의와 6-4 photoproducts </td><td> 20초 일반적으로, 소스에 따라 다릅니다 </td></tr><tr><td> 그라 이스 (이온화 방사선) 5-100 쥐 </td><td> 더블 스트랜드 나누기, 단일 스트랜드 휴식 및 기본 피해 사이트 </td><td> 소스에 따라 다릅니다 </td></tr></tbody></table>"DNA의&gt; 표 1. 요약 손상 및 불일치 유도 트리 트먼트 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> Multitest 슬라이드 15 - 글쎄요 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 커버 유리 </td><td> 어부 </td><td> 12-544 - B </td><td></td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> 어부 </td><td> BP160 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycin C </td><td> 시그마 </td><td> M0503 - 2MG </td><td> mutagen, 마모 장갑 </td></tr><tr><td> 2 Aminopu​​rine </td><td> 시그마 </td><td> A3509 - 250MG </td><td> 장갑 </td></tr><tr><td> Hydroxyurea </td><td> 시그마 </td><td> H8627 - 25G </td><td> 장갑 </td></tr><tr><td> FM4 - 64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> 민감한 빛 </td></tr></tbody></table> 표 2. 특정 시약 및 장비 목록 :

<ol><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).</li>
<li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li>
<li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li>
<li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li>
</ol>

시행 착오는 각 변형에 대한 최고 품질의 이미지에 대한 노출 조건을 찾을 필요, 100-2000 MS의 노출은 GFP (FITC)와 FM4 - 64에 적합한 반면 우리는 1 밀리초는 하얀 빛을 이미지에 적합한 것을 발견 (TRITC ) 이미지. 노출 시간은 사용되는 이미징 장비에 따라 달라집니다. 여러 변종이 동일한 슬라이드에있는 경우에는 패드 국경에서 세포의 패드 품질과 확산은 스트레인 차별 복잡있을 수 있기 때문에 우리는 가장 간단한 영상 15 - 잘 현미경 슬라이드 당 하나의 변형의 사용을 권장합니다. 이미지 품질을 직접 박테리아가 휴식하는 아가로 오스 패드의 품질에 따라 달라집니다. 박테리아가 나란히 위치를 최고 품질의 이미지는 아가로 오스 패드에서 캡쳐한 것입니다. monolayer 방지, 클럼프에 박테리아 세포의 원인이 패드는, 가난한 이미지를 생성합니다. 탈수 아르 패드가 제대로 휴식 세포를 허용하지 않습니다 반면 너무 두께 패드는 높은 배경 형광 신호를 생산합니다. 이 아가로 오스 패드 결함은 일반적으로 매우 좋...

특정 솔루션 조리법 1 : 10X S7 50 염 0.5 M의 맙스 100 MM의 질산 황산 50 MM 인산 칼륨 일염기의 소독 필터, 사전 스토리지 포장 S7 박 50 미디어 100x 금속 0.2 M MgCl 2 70 MM CaCl 2 5 MM MnCl 2 0.1 MM ZnCl 2 100 μg / ML 티아민 HCL 이 MM HCL 0.5 MM FeCl 3 * 최종 볼륨 DH 2 O * FeCl 3 석출을 방지하기 위해, 마지막으로 추가되어야합니다. 호일에 필터 살균 후, 랩 100x 금속 솔루션입니다. S7 50 미디어 1X S7 50 염 1X 메탈 1 % 포도당 0.1 %의 글루 탐 산염 40 μg / ML 트립토판 40 μg / ML 페닐알라닌 최종 볼륨에 소주 H 2 O 10X Spizizens (g / L) 151.4 MM의 질산 황산 (20g / L) 803.8 MM 인산 칼륨 일염기의 (140g / L) 440.9 MM 인산 칼륨 이염 (60g / L) 34.0 MM 나트륨 구연 산염 (10g / L) 16.6 MM MgSO 4 (2g / L) 최종 볼륨 DH 2 O 소독 필터

이미징 불일치 복구 및 dna의 손상 세포 응답 바실러스 subtilis</em

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

모두 prokaryotes와 eukaryotes는 생리적 변화 복잡한 설정을 통해 DNA 손상에 대응. 유전자 표현, 기존의 단백질의 재배포, 새로운 단백질 단지의 어셈블리에 변경이 DNA의 병변과 일치하지 않는 DNA 기본 쌍 다양한 자극에 의​​해 수 있습니다. 형광 현미경은 DNA의 병변과 살아있는 세포의 복잡한 subcellular 구조 내의 DNA 복제 상태를 모니터링하기 위해 이러한 행위나 기타 가능한 답변을 시각화하고 quantifying을위한 강력한 실험 도구로 사용되고 있습니다. 형광 기자 단백질과 DNA 복제 및 복구 기계의 구성 요소 사이의 Translational fusions는 단서를 결정하는 데 사용되었다는 그들의 동족의 병변을 대상 DNA 수리 단백질<em&gt; 생체내에</em&gt; 이러한 단백질이 세균의 세포 내에 구성되는 방법을 이해합니다. 또한, DNA의 손상 inducible의 발기인에 연결되어 transcriptional과 translational fusions는 인구 내에서 세포가 genotoxic 스트레스 반응을 활성화하는 공개했습니다. 이 리뷰에서는, 우리는 이미지를 DNA 수리 및 단일 박테리아 세포의 DNA 복제 단지의 어셈블리를 형광 현미경을 사용하여에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 특히,이 작품은 영상 불일치 복구 단백질, 상동 재조합, DNA 복제 및 SOS - inducible 단백질에 초점을 맞추고<em&gt; 바실러스 subtilis</em&gt;. 여기에서 설명한 절차의 모든 세균 종의 다양한 영상 단백질 단지에 대해 쉽게 의무가 있습니다.

자세한 프로토콜은 이미징을 위해 DNA 수리 단지의 실시간 형성을 설명<em&gt; 바실러스 subtilis</em&gt; 세포.

이미징 불일치 복구 및 DNA의 손상 세포 응답 바실러스 subtilis</em

원핵생물과 진핵생물 모두 복잡한 생리적 변화를 통해 DNA 손상에 반응합니다. 유전자 발현의 변화, 재배치...

미스매치 복구 단백질의 번역 융합체를 보유한 Baus TLU 균주입니다. GFP와 융합된 단백질을 선택 배지에 스트리킹합니다. 스트리킹된 세포를 액체 배양을 위한 신선한 접종원으로 사용합니다.OD 600이 0.3에서 0.4가 될 때까지 세포를 배양한 후, 원하는 경우 미스매치 유도 처리를 수행하며, OD 600이 0.5에서 0.8에 도달할 때까지 세포를 추가로 배양한 뒤 세포를 수거합니다. 필요한 경우 막 염색 시약인 FM 4 64를 첨가하고, 준비된 agar pad가 있는 슬라이드에 세포를 도포한 후 흡입법으로 과잉 배지를 제거하여 세포가 가라앉도록 둡니다.커버 슬립을 덮고 현미경으로 세포를 관찰합니다. 안녕하세요, 저는 미시간 대학교 앤아버 캠퍼스 분자, 세포 및 발생 생물학과 Lyle Simmons 교수님 연구실의 Andrew Kow 박사입니다. 오늘은 bacillus solus에서 DNA 미스매치 복구 단백질뿐만 아니라 다른 복구 및 리보솜 단백질의 번역 융합물을 시각화하는 데 사용되는 절차를 보여드리겠습니다.본 절차를 통해 Bacillus subtilis 생세포 내에서 DNA 미스매치 복구 단백질과 리보솜 단백질 사이의 상호작용을 연구합니다. 그럼 시작하겠습니다. 본 절차를 시작하려면, 시각화하고자 하는 번역 융합 단백질을 포함하는 B subtilis 균주를 일부 균주에 대해 준비하십시오.이미징 하루 전에 시작하는 것으로 충분합니다. 여기에는 GFP와 표적 유전자 사이의 번역 융합(translational fusion)이 MU LGFP와 같이 유전자의 내인성 유전자좌(endogenous locus)에 삽입되었을 때 잘 성장하는 균주들이 포함됩니다. 이미징 하루 전에 시작할 때는 멸균 상태에서 멸균 스틱을 사용하여 선택성 LB agro 배지가 도말된 플레이트에 박테리아를 도포하십시오.단일 콜로니를 배양하기 위해 30 °C에서 하룻밤 동안 배양하며, 다음 날 이 콜로니들을 초기 접종액으로 사용합니다. 일부 B sublist 균주들은 고품질의 이미지를 얻기 위해 현미경 관찰 전 이틀간의 배양이 필요합니다. 두 일간의 배양이 필요한 특정 균주는 rec A GFP와 같이 번역 융합(translational fusion)으로 인해 성장이 느린 균주들입니다. 첫째 날에 박테리아를 선택적 LB AED 배지에 스트리킹하고 하룻밤 동안 배양합니다.둘째 날에 연속 희석을 수행합니다. 먼저 단일 콜로니를 선택하여 0.85% saline 100 µL에 접종한 다음, 10배 연속 희석을 4회 수행합니다. 각 단계의 saline 희석액뿐만 아니라 시작 콜로니와 saline을 선택성 항생제가 포함된 LB agar 플레이트에 100 µL씩 도말합니다. 플레이트를 보통 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 두 번째 하룻밤 배양이 끝난 후, 세포가 가볍게 융합 성장한 희석 플레이트를 선택합니다.이는 건강하게 지수 성장하는 스타터 접종균을 제공하며, 잠재적으로 우수한 이미징 결과를 얻을 수 있게 합니다. 이는 특히 막 염색의 최고 품질 이미징에 유용합니다. 이미징 당일 아침, FM 4 64를 사용하여 125 milliliter 멸균 플라스크에 S seven 50 배지 10 milliliters를 넣습니다.따라서 공기와 배지의 비율을 최소 10배로 유지합니다. 단일 콜로니 또는 그와 유사한 밀도의 세포가 있는 lppl에서 최대 2mL의 S seven 50 배지로 세포를 재부유하여 접종균을 얻습니다. 10mL의 S seven 50 배지가 담긴 Erlenmeyer 플라스크에 S seven 50 배지 세포 접종균을 충분히 첨가하여 배양액의 초기 OD 600이 약 0.08에서 0.1이 되도록 합니다.다음으로, 이미징할 B 서브리스트 균주에 적합한 온도에서 각 배양물을 배양합니다. 분당 회전수(rpm)가 150에서 200인 진탕 항온수조를 사용하는 것이 권장됩니다. OD 600 값이 약 0.5에서 0.8에 도달할 때까지 배양을 계속합니다.DNA 손상 유도제 또는 미스매치 유도제로 처리하는 배양의 경우, DNA 변형제와 함께 배양하는 기간이 끝나는 시점이 목표 OD 600에 도달하는 시점과 일치하도록 처리 계획을 세우십시오. 예를 들어, 게놈에 삽입되었을 때 미스매치 염기를 모방하는 DNA 기반 유사체인 2-aminopurine은 1시간의 배양이 필요하며, mutL GFP와 같은 미스매치 복구 단백질의 포커스 형성을 유도합니다. 반면, RecA GFP 포커스 형성은 이중 가닥 DNA 절단을 유도하기 위해 mitomycin C 또는 기타 DNA 손상 시약과 함께 1시간 동안 배양해야 하며, 2-aminopurine과 mitomycin C가 모두 첨가됩니다.배양액의 OD 600 값이 약 0.3에서 0.4에 도달하고, 각 처리군에서 필요한 1시간의 성장 기간을 거치면, 배양액의 OD 600 값은 대개 0.5에서 0.8에 도달하여 이미징 준비가 완료됩니다. 먼저 300 µL의 배양 세포를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅합니다. 세포막 이미징을 원하는 경우, 각 샘플에 1 mg/mL FM 4 64 막 염색액을 1:1000으로 희석하여 첨가하며, 원하는 형광 신호를 얻기 위해 FM 4 64의 적정 과정이 필요할 수 있습니다.일반적인 적정 범위는 1:100에서 1:10,000까지입니다. 샘플을 최대 10분 동안 또는 슬라이드를 준비하는 동안 그대로 둡니다. 세포 농도 측정이 필요한 경우, 진공 장치가 연결된 0.2 micrometer 필터를 사용하여 세포를 여과합니다.그런 다음 세포 샘플을 배양하는 동안 적절한 완충액이나 배지를 사용하여 필터에서 세포를 조심스럽게 씻어냅니다. FM 4 64를 사용하여 처리하십시오. 10x ZEN 스톡 5mL를 증류수 45mL에 넣고 agros 0.5g을 추가한 후, 전자레인지로 가열하여 녹여 1% agros 및 1x ZEN을 준비합니다.아가로스(agarose)의 온도가 항온수조에서 약 65 °C가 될 때까지 평형을 이루게 한 후, 1% 용융 아가로스 20 µL를 피펫 팁으로 취합니다. 아가로스의 온도가 너무 높으면 피펫팅이 어렵고, 너무 낮으면 응고되어 피펫 팁으로 들어가지 않습니다.다음으로, multitest 15-웰 슬라이드를 사용하여 각 슬라이드 웰에 약 1~2 µL의 aros 용액 한 방울을 피펫팅합니다. 얇은 aros 패드를 형성하면 aros가 즉시 응고됩니다.탈수를 방지하여 슬라이드를 사용할 수 없게 되는 상황을 막기 위해, 세포를 도포하기 직전에 슬라이드를 준비합니다. aros 패드는 각 웰의 중앙에 위치하여 웰을 채워야 하지만, 커버 슬립을 방해하지 않도록 높이는 최소한으로 유지해야 합니다. 액적의 높이가 너무 높거나 기포처럼 보일 때, 또는 샘플이 웰 경계 밖으로 퍼진 경우에는 킴와이프로 웰을 깨끗이 닦아내고 새로운 aros 패드를 도포하십시오.슬라이드 준비가 완료되면, 이전에 마이크로 원심분리 튜브에 따로 보관해 두었던 300 µL 샘플 전량을 슬라이드에 도포하여 각 aeros 패드 상단에 샘플이 고르게 분포되도록 합니다. 이 정도 양의 세포면 슬라이드의 각 웰을 충분히 덮을 수 있습니다. 세포가 도포된 슬라이드를 실온에서 약 10분 동안 그대로 둡니다.이 단계에서는 세포가 agros 패드 위에 안착하여 고정되도록 하며, 10분간의 배양 끝에 이미징이 가능한 상태가 되도록 합니다. 패드가 제거되지 않도록 주의하며 각 웰에서 과잉 배지를 흡입하여 제거하십시오. 커버슬립을 슬라이드 위에 올리고, 슬라이드 영역 전체를 단단하고 균일하게, 하지만 부드럽게 눌러줍니다. 커버슬립이 슬라이드에 완전히 밀착되었는지, 슬라이드 위로 들뜬 부분이 없는지 확인하십시오.다양한 형광 현미경을 사용하여 이미징을 진행할 수 있습니다. 100배 오일 침강 렌즈를 사용하는 것이 매우 중요합니다. Simmons 연구실에서는 전반사(TIR), 형광 현미경 또는 turf m에 적합한 1.45 개구수 100배 오일 침강 대물렌즈가 장착된 Olympus BX 61 현미경을 사용합니다.현미경에는 CCD 냉각 카메라와 LU 200 아치형 금속 광원이 함께 장착되어 있습니다. 먼저 백색광을 사용하여 세포의 초점을 맞춥니다. 각 균총에 적합한 필터를 사용하십시오.GFP 검출을 위해 4번 필터를 사용하십시오. FM 4-64 검출을 위해 들뜸 필터 460~500 및 방출 필터 510~560을 사용하십시오. 들뜸 필터 510~560 및 방출 필터 572~648을 사용하십시오.각 층에 적합한 필터를 사용하여 이미지를 캡처하십시오. slide book 4.2 소프트웨어를 사용해 네 가지 이미지를 얻습니다. 다음은 GFP와 번역 융합된 DNA 미스매치 복구 단백질 MU L을 이미징한 대표적인 결과입니다.MU LGFP의 처리되지 않은 대조군 배양물은 극소수의 초점(foci)만을 보여주며, 대부분의 세포는 세포질 수준의 mut LGFP 융합 단백질만을 포함하고 있습니다. 그러나 게놈에 삽입되었을 때 잘못 짝지어진 염기를 모방하는 2-아미노퓨린 존재 하에 배양된 대부분의 세포에서는 GFP 초점이 관찰되며, 이는 mutal GFP 단백질이 잘못 짝지어진 DNA 염기의 인식 및 복구에 관여함을 나타냅니다.DNA 손상 유도 약물인 mitomycin C 존재 하에 배양한 REC A GFP 균주에서도 유사한 결과가 얻어집니다. 여기서는 mitomycin C 처리 시 대부분의 세포가 rec A GFP 포커스를 포함하고 있으며, 이는 rec A GFP가 DNA 손상에 반응하여 복구 과정을 시작했음을 나타냅니다. mitomycin C 처리 없이는 pho IR이 관찰되지 않았습니다. 지금까지 살아있는 bacillus subtilis 세포에서 복구 단백질을 시각화하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때.충분한 시간을 갖고 세포의 초점을 정확하게 맞추는 것이 중요하며, 이를 위해서는 실제로 어느 정도의 연습이 필요할 수 있다는 점을 기억하시기 바랍니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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