Name: 불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-09T17:05:05.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 배우세요 생체내 단백질 상호작용을 DSP 교차결합과 면역침전을 통해 안정화하고 분리하는 방법을. 이 기술은 일시적 단백질 복합체 연구에 필수적인 도구입니다.

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1. Crosslinking 준비 <ol><li> 당신은 표준 튜브 반응 당 단백질 500 μg의 고립을 허용 접시에 세포의 충분한 번호가 필요합니다. 하나의 튜브가 immunoblot으로 관심의 단백질 putative interactors의 식별하기에 충분한 수 있습니다. 이 경우 비드 바운드 자료는 SDS - PAGE 샘플 버퍼 (immunoprecipitation)로 eluted 수 있습니다. 질량 분광법의 분석을 위해, 표준 반응의 숫자는 적어도 10 배 증가되어야하며 단백질 단지는 (면역 친 화성 크로마 토그래피) 사용 항체에 의해 인식 펩타이드 항원과 함께 밖으로 경쟁에 의해 eluted해야합니다. 이 전략은 면역 글로불린 무료 단백질 단지의 격리를 허용합니다. </li><li> crosslinking에 대한 최적의 세포 밀도가 75 % confluency 90% 사이입니다. 높은 confluency 조건에서, 세포는 모든 세포에 세포 투과 crosslinker에 접근을 감소하는, 서로에 대한 더미하는 경향이있다. </li><li> 세포 종류와 실험 조건은 셀 플레이트의 하단에 표시해야합니다. 우리는 일상적으로 혼자 자동차와 컨트롤을 포함합니다. </li><li> 이전 crosslinking에 DSP 솔루션을 제외한 모든 솔루션을 준비합니다. <ol><li> CaCl 2 0.1 MM 및 CaCl 2 실험을 시작하기 전에 1 ㎜ (PBS / CA / MG)과 인산염 버퍼 호수 버퍼의 재고를 준비합니다. 칼슘 및 마그네슘 이온의 또한이 실험의 과정 동안 문화 판에 세포 접착을 위해 중요합니다. 4 스토어 ° C. </li><li> 50X 완료 테아제 억제제 칵테일 - 1mL 밀리 Q의 물속에 녹아있는 한 타블렛. -20 ° C.에 저장 </li><li> 20% 트리톤 X - 100은 10g 트리톤 Triton X -100 밖으로 체중 50 ML 밀리 Q 워터의 전체 볼륨에 희석. 4 록 ° C 4 박 및 저장 ° C까지 사용. 이상 1 개월 보관하지 마십시오. 아래에 설명된 용해 및 IP 버퍼를 준비하는이 20 % 주식 dilutions을 사용합니다. </li><li> 산도 7.4에 50X DSP 칭 솔루션 1M 트리스. 상온에서 보관하십시오. </li><li> 10X 버퍼에게 솔루션을 준비합니다. 10X 버퍼 : <ul><li> 50 ML 1 M HEPES </li><li> 150 ML 5 M NaCl </li><li> 10 ML 0.5 M EGTA </li><li> 250 μL 2 M MgCl 2 </li><li> 7.4으로 산도를 조정 </li><li> 500 ML에 마지막으로 볼륨을 가지고 </li></ul> 10X 버퍼 솔루션은 필요에 따라 1X 버퍼로 희석합니다. 1X 버퍼는 또한 lysate와 단백질 자석 - 강수량 버퍼에 사용됩니다. 1X 버퍼 <ul><li> 10 MM Hepes </li><li> 150 MM NaCl </li><li> 1 ㎜ EGTA </li><li> 0.1 MM MgCl 2 </li><li> 산도 7.4 </li></ul></li><li> 용해 버퍼 1X 버퍼 + 0.5 % 트리톤 X - 100. </li><li> 단백질 마그네틱 강수량의 버퍼 (IP 버퍼) 1X 버퍼 + 0.1 % 트리톤 X - 100. </li></ol></li></ol> 2. Crosslinking 솔루션 준비 <ol><li> 즉시 세포에 적용하기 전에 DSP 솔루션을 준비합니다. DSP는 매우 소수성이며 PBS / CA / MG 버퍼로 diluting 전에 DMSO에 용해한다. DMSO 1 ML에 DSP의 40 밀리그램을 디졸브. 이것은 DSP (DSP의 분자량은 404.42 g / 몰입니다)의 100 MM 솔루션을합니다. </li><li> PBS로 DSP / DMSO의 희석을 용이하게하기 위해서 ° C에서 37로 PBS / CA / MG의 적절한 볼륨을 따뜻하게. 여러 플레이트 크기에 필요한 볼륨 : 물론 당 6 - 음 판 2 ML 판 당 10cm 플레이트 10 ML 판 당 15cm 플레이트 20 ML </li><li> 따뜻한 PBS / CA / MG의 모든 1 ML위한 DSP / DMSO 재고 솔루션의 10μL를 추가합니다. 모든 DSP가 해산 때까지 반복 혼합과 드롭하여 DSP / DMSO 재고 솔루션 드롭을 추가합니다. PBS / CA / MG의 모든 1 ML에 추가 10 μL DMSO의 제어 솔루션을 확인하십시오. </li><li> 10 분 이상 더 이상 얼음 물을 욕조에있는 모든 PBS / CA / MG 솔루션을 놓으십시오. </li></ol> 3. Crosslinking에 대한 셀 준비 <ol><li> crosslinking 또는 차량 제어 보육에 대한 모든 번호판을 맞게 얼음 물 목욕을 준비합니다. </li><li> 37 ° C 배양기에서 접시를 타고 얼음 물을 욕조에 바로 놓으십시오. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS / CA / MG와 세포 두 번 씻으십시오. 당신은 (섹션 2.2 참조) crosslinker 배양에 사용되는 같은 볼륨을 사용합니다. </li><li> 두번째 세척을 제거하고 차량 제어 또는 DSP의 crosslinking 버퍼 솔루션 중 하나를 추가합니다. </li><li> 두 시간 동안 얼음에 품어. 당신은 접시 모든 세포 솔루션이 적용되는 것을 보장하기 위해 대략 매 20 분 확인하시기 바랍니다. 당신은 DSP의 작은 금액이 솔루션의 밖으로 침전물이 나타날 수 있습니다. 이것은 정상입니다. </li></ol> 4. DSP 반응의 불활 성화 <ol><li> PBS / CA / MG (PBS / CA / MG의 모든 1 ML 1 M 트리스 산도 7.4의 20 μL) 20 MM 트리스 산도 7.4의 1X DSP 담금질 솔루션을 준비합니다. </li><li> 차량 제어 및 crosslinking 솔루션을 제거합니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 불활 성화 솔루션을 추가하고 15 분 동안 얼음에 품어. </li></ol> 5. 세포 용해 <ol><li> DSP 담금질 보육 동안 0.5 % 트리톤 버퍼에 X - 100과 함께 완전한 테아제 억제제 칵테일의 세포 용해 버퍼를 준비합니다. 모든 1 ML의 용해 버퍼에 대한 완벽한 20 μL 50X 재고 솔루션을 추가합니다. </li><li> 십오분 DSP 담금질 보육 다음, PBS / CA / MG와 세포 두 번 씻는다. </li><li> 30 분 용해 버퍼 + 4 셀 및 바위 완료 ° C를 추가합니다. 일부는 여러 플레이트 크기에 대한 용해 버퍼의 볼륨을 제안 : <ul><li> 물론 당 6 - 잘 플레이트 0.5 ML </li><li> 판 당 10cm 플레이트 1 ML </li><li> 판 당 15cm 플레이트 1 ML </li></ul></li><li> 용해 후, 접시에서 세포를 수집하는 세포 스크레이퍼를 사용합니다. 단백 분해 효소 활동을 최소화하기 위해 얼음에 lysates을 유지하시기 바랍니다 </li><li> 스핀 셀룰라 최고 속도 (15.000 XG)에서 벤치 탑 미니 원심 분리기 4 15 분 ° C에 대한 lysates. </li><li> 새로운 튜브에 뜨는를 피펫. 펠렛 폐기하십시오. </li><li> 단백질 수준을 분석하고 immunoprecipitation과 함께 진행합니다. </li></ol> 6. 단백질 자기 강수량 비즈 준비 참고 :이 단계는 일반적으로 직접 2 시간 crosslinking 보육을 시작 후에 시작됩니다. <ol><li> 30 Dynal immunomagnetic 구슬 μL, IP 버퍼 500 μL (1X 버퍼 + 0.1 % 트리톤 X - 100) 및 microcentrifuge 튜브를 screwtop하는 항원 특정 항체의 해당 금액을 결합합니다. 부정적인 컨트롤에 대한 항체가없는가 아닌 특정 항체 튜브 준비합니다. 항체의 적절한 금액은 별도의 실험을하는 동안 각각의 항원에 따라 결정되어야합니다. 모든 IP 튜브 라벨. </li><li> IP 튜브가 두 시간 동안 실온에서 엔드 오버 엔드 로커에서 부화 수 있습니다. 또는, crosslinking하기 전에 4 명이 하루 밤새 항체로 IP 튜브를 품어. </li><li> 부화 후, 튜브의 하단에있는 비즈를 수집하는 빠른 10초 미니 원심 분리 해. </li><li> 멀리 튜브의 바닥에서 자기 구슬을 끌 수있는 자석 홀더로 튜브 슬라이드. 안전하게 비켜 비즈와 함께, 당신은 지금 쉽게 어떤 언바운드 항체를 멀리 세척하실 수 있습니다. </li><li> 이러한 겔 로딩 팁 또는 부화 버퍼 및 언바운드 항체를 제거하는 p200 팁 등 작은 구멍 흡인기 팁을 사용합니다. 부화 볼륨이 제거되자 마자 IP 버퍼 1 ML에 추가합니다. </li><li> 부드럽게 다시 중단 비즈, 튜브를 캡 및 엔드 오버 엔드 회전 5 분 실온에서 모든 IP 튜브를 품어. </li><li> 한번 더 IP 버퍼의 새로운 밀리리터로 5 분 세척 단계를 (6.6 단계를 통해 6.3) 반복합니다. </li><li> 가교 lysate의 비즈에 추가 준비가 될 때까지 IP 튜브는 지난 씻어 보육에 남아있을 수 있습니다. </li></ol> 7. 단백질 자성 비즈와 가교 Lysate를 품어 <ol><li> 마지막 세척 회전 단백질 자석 구슬 후, 아래로 10 초 동안 미니 원심 분리기 인치 그런 다음 자석 홀더에 튜브를 살짝로 진행합니다. </li><li> 다시, 작은 구멍 열망 팁을 사용하면, 튜브에서 부화 볼륨을 제거합니다. 즉시 단백질 자석 구슬이 들어있는 튜브에 가교 세포 lysate (1 μg / ML에서 lysate를 가정) 500 μL를 추가합니다. 당신은 부정적인 제어로 펩타이드 경쟁을 사용한다면, 펩타이드의 적절한 금액은이 시점에서 포함되어야합니다. 이전 실험은 적절한 펩타이드의 경쟁 조건을 결정하기 위해 수행되어야합니다. 또는, 당신은 부정적인 제어로 lysate 무료 단백질 자석 구슬을 할 수 있습니다. 이 경우에는 즉시 단백질 자석 구슬에 + 완료 Lysate 버퍼 (1X 버퍼 + 0.5 % 트리톤 X - 100) 500 μL를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 구슬을 resuspend. Resuspended 구슬은 2 시간 엔드 오버 엔드 회전에서 4 명이에 incubated해야합니다. </li></ol> 8. 비즈에서 언바운드 Lysate 와시 <ol><li> 일단 lysate는 미니 원심 분리기의 빨​​리 10초 스핀은 충분한 부화 시간을 가지고 있습니다. 그런 다음 튜브는 자석 홀더에 끼웁니다. 자석 홀더는 실험의 나머지 얼음 욕조에 보관해야합니다. </li><li> 작은 구멍 흡인기 팁을 사용하여 모든 언바운드 lysate를 제거합니다. 모든 언바운드 lysate를 제거 직후 것은 IP 버퍼 1 ML를 추가합니다. </li><li> 튜브 뚜껑 부드럽게 구슬을 resuspend. </li><li> 일단 구슬이 비드 pelleting 단계 (8.1)을 반복 resuspended 있습니다. </li><li> 다시 부화 볼륨의 모든을 대기음 즉시 IP 버퍼 1 ML을 추가한 다음 튜브를 마개. </li><li> 부드럽게 IP 버퍼에있는 구슬을 resuspend. 엔드 오버 엔드 락을 함께 4 명이시 5 분 resuspended 구슬을 품어. </li><li> 비드 세척 단계를 (8.6 통해 8.4) 4 번 이상 반복합니다. </li></ol> 9. 샘플 변성과 비즈의 수집 <ol><li> 로 단백질 자석 강수량 튜브의 모든 바뀌어진 후, 다시 침전 비즈 (8.1)와 슬라이드 튜브자석 홀더. </li><li> 단백질 자석 구슬에 바인딩 단백질이 조건을 denaturing에서 제거됩니다. 마지막 IP 버퍼 세척을 기음과 자석 홀더에서 IP 튜브를 제거합니다. </li><li> 또 튜브의 하단에있는 수영장에서 구슬을하는 비드 펠렛 위의 IP 튜브에 1X 젤 샘플 버퍼를 추가합니다. 샘플 버퍼의 양은 사용하는 젤의 잘 크기에 따라 달라집니다. 당신은 부드럽게 젤 샘플 버퍼에 resuspended 구슬을 모두 얻을 수있는 튜브의 바닥을 도청 할 수 있습니다. </li><li> 각 IP 튜브 denaturing 과정 (9.3 통해 9.2)를 반복합니다. </li><li> 젤 샘플 버퍼에 resuspended 단백질 자석 구슬은 다음 75 온수 아르 ° denaturing 프로세스를 완료하기 위해 5 분간 C. </li><li> 일단 예제가 서부 모래 바닥에 대한 SDS - PAGE 젤에서 실행할 수있는 변성되었습니다. 비운 단백질 자성 비즈는 원심 분리하여 다시 pelleted과 자석 홀더와 샘플에서 제거할 수 있습니다. </li></ol> 10. Antigenic의 펩티드와 가교 단지 (면역 친 화성 크로마 토그래피)의 용출. <ol><li> 단백질 자석 immunoprecipitation 튜브의 모든 후 자석 홀더에 다시 침전 비즈 (8.1)와 슬라이드 튜브는 씻어되었습니다. 뜨는을 기음과 버퍼 10 μl를 추가 단백질 단지의 immunoisolation에 사용되는 항체에 의해 인식 antigenic의 펩타이드와 함께 보충. 당신이 효율적인 용출에 대한 10-200 μm의까지 농도를 테스트해야합니다. </li><li> 4 2 H에 대한 구슬을 품어 ° C. </li><li> 자기 스탠드에 구슬을 넣어 조심스럽게 eluted 소재의 10 ML을 복구합니다. 이 표면에 뜨는를 저장합니다. </li><li> 신속 버퍼와 비즈를 세척하고 세척을 삭제. 구슬을 저장합니다. </li><li> 1X의 농도에 저장된 뜨는와 구슬로 젤 샘플 버퍼를 추가합니다. ° C 5 분 75 다음 튜브를 품어. </li><li> SDS - PAGE에 의해 구슬과 펩타이드 eluate를 분석합니다. eluate 모두 SDS - PAGE의 얼룩 단백질이나 immunoblots (그림 1B)에 의해 IgG 무료로해야합니다. IgG 무료이 자료는 질량 분광법에 적합합니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1855/1855fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. AP - 3 상호 작용하는 단백질 합성물과 막 단백질의 분리. HEK293 세포 (A) 또는 PC12 세포 (B) 차량 제어의 존재에 중 처리 (DMSO, 홀수 차선 그림 1A) 또는되었습니다 DSP (심지어는 골목길이 그림. 1A 또는 모든 그림의 1B에서 차선). 그림, 명확히 추출물 혼자 비즈 (그림 1A, 레인스 3-4), 트랜스페린 수용체 항체 (그림 1A, 레인스 5-6) 또는 AP - 3 δ 항체 (그림 1A, 레인스 70-10과 중 incubated되었습니다 . 1B, 골목길 10-10). 면역 단지는 SDS - PAGE 샘플 버퍼 (그림 1A)와 eluted했고 혼자 버퍼 또는 (그림의 1B, 차선 1-2), 또는 아미노산 680 710에 해당하는 δ의 antigenic의 펩타이드의 증가 농도와 보충 버퍼 (그림의 1B, 차선 3-10) :; 인간 δ - adaptin (1,923,266 GI AAD03777 NCBI)의. 이 펩티드는 δ 항체를 바인딩합니다. 펩타이드 용출 후, supernatants (S)과 구슬 (B)가 immunoblot (그림의 1B)에 의해 분석되었다. ;뿐만 아니라 clathrin 중쇄 (CHC), 공산권 - 1 subunit의 pallidin, 그리고 홉스 복잡한 subunit의 vps33b : δ, β3 및 σ3 subunits에 대한 항체로 검색된 AP - 3, 다음과 같은 수용성 요소로 coprecipitates 멤브레인는 phosphatidylinositol - 4 - 키나제 타입 II 알파 (PI4KIIα)와 아연 전송 3 (ZnT3)을 단백질. 펩타이드의 IgG 마우스 무거운 체인의 부재는 그림 뜨는을 eluted합니다. 1B.

<ol><li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hermansky-Pudlak+syndrome+protein+complexes+associate+with+phosphatidylinositol+4-kinase+type+II+alpha+in+neuronal+and+non-neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells.</a> J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).</li>
<li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+of+extended+biological+structures%3A+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+%5B35S%5Ddithiobis%28succinimidyl+propionate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate.</a> J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).</li>
<li>Xiang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+DSP%2C+a+reversible+cross-linker%2C+to+fix+tissue+sections+for+immunostaining%2C+microdissection+and+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling.</a> Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).</li>
<li>Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-4-Kinase+Type+II+Alpha+Contains+an+AP-3+Sorting+Motif+and+a+Kinase+Domain+that+are+both+Required+for+Endosome+Traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic.</a> Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).</li>
<li>Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+non-neuronal+functions+of+the+AP-3+sorting+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery.</a> J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).</li>
<li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zinc+Transporter+ZnT3+interacts+with+AP-3+and+it+is+Targeted+to+a+Distinct+Synaptic+Vesicle+Subpopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation.</a> Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li>
</ol>

DSP, 멤브레인 - 침투성, 12의 스페이서 암과 화학적 줄이할 수있는 crosslinker는 과도 단백질 상호 작용 1,2,3,4를 안정화하는 데 사용됩니다. 여기서 우리는 어댑터 복잡한 AP - 3 5 endosomes에서 vesicles에 막 단백질을 인식하고 각종 가용성 단백질 복합이 전략을 exemplified. AP - 3 선택 아연 수송 ZnT3 및 지질 키나제 phosphatidylinositol - 4 - 키나제 타입 II 알파지만 트랜스페린 수용체 1,4,6에 바인딩합니다. 우리는 대량 분석법 1 막 단백질과 cytosolic 요인 AP - 3 단백질 상호 작용 네트워크의 식별 이러한 관찰을 확대. 낮은 배경 단백질 마그네틱 강수량은 상호 작용하는 단백질을 확인하기 위해 crosslinking을 따릅니다. 또한 비 선택적으로 자석 구슬에 바인딩 단백질의 출판 카탈로그 질량 분석계 7 비 특정 단백질 분리 및 식...

<table><tbody><tr><td>인산염 완충 식염수(Phosphate Buffered Saline)</td><td>Invitrogen</td><td>P4417</td><td>1정의 정제를 200 mL의 물에 녹인 후, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;를 최종 농도 1 mM이 되도록 추가하고, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;를 최종 농도 0.1 mM이 되도록 추가함</td></tr><tr><td>Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22585</td><td>습기에 민감하므로 밀폐 용기에 담아 4&amp;#x00B0;C에서 보관</td></tr><tr><td>Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, SigmaUltra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>110.31</td><td>비드는 sheep anti-rabbit 제품으로도 구매 가능함</td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 자석</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr></tbody></table>

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

세포 기계의 동적 특성은 자주 일시적 및 / 또는 약한 단백질 연결에 내장되어 있습니다. 이러한 낮은 친화도 상호 작용 관심의 단백질 주변의 분리 및 단백질 네트워크의 식별에 대한 엄격한 방법을 배제. 화학 crosslinkers의 사용은 따라서 정화에 대한 생화 학적 한계를 거치지 않고 불안 정한 상호 작용의 선택 안정화 수 있습니다. 여기에 우리가의 스페이서 팔로 homobifunctional crosslinker를 사용하는 문화의 세포에 대한 의무 프로토콜을 현재 12, dithiobis - (succinimidyl proprionate) (DSP). DSP는 분자에 존재 disulphide 결합의 감소에 의해 죽습니다. 자석 구슬과 관심의 단백질의 면역 크로마 토그래피와 결합 가교 달리 정화 견딜 않을 단백질 단지의 절연을 수 있습니다. 이 프로토콜은 일반적인 서양 얼룩 기술과 호환되며 그것은 대량 분석법 1 단백질 식별을 위해 확장할 수 있습니다. 스테파니 A. Zlatic와 진주 V. 라이더이 작품에 동일하게 기여.

세포 투과 crosslinker DSP [dithiobis - (succinimidyl 프로피 온산)] 일시적 안정화와 불안 정한 상호 작용<em&gt; 생체내에</em엄격한 단백질 복잡한 정화 기술을 사용하여 격리 수 있습니다&gt;. 여기 immunoprecipitation에 의해 단백질 단지의 절연 다음 문화의 성장 crosslinking 전지에 대한 기술을 제시한다.

세포 기제(cellular machinery)의 역동적인 특성은 흔히 일시적이고 또는 약한 단백질 결합을 기반으로 구축됩니다. 이러한 낮은 친화성 상호작용은 ...을 배제합니다.

가교 결합 후 면역침강을 위해, 80~90% 밀도의 세포를 1 mM의 얼음처럼 차가운 DSP(PBS, 칼슘, 마그네슘 또는 DMSO만 포함)와 함께 배양합니다.용매 대조군. DSP는 12 Å 이내에 있는 자유 말단 및 평균 말단들을 교차 결합시키는, 호모 이관능성 막 투과성 환원 가능 교차 결합제입니다. 교차 결합 후 세포를 용해하고 표준 대조군을 사용하여 면역 침전을 수행합니다.그 다음, 환원 SDS page를 통해 단백질 복합체를 분리하며, 이때 환원제가 DSP를 절단하여 immuno blot으로 개별 단백질을 식별할 수 있게 합니다. 안녕하세요, 저는 Emory University 세포생물학과의 Dr.Victor Fonde 연구실 소속 Stephanie Ick입니다. 그리고 저는 역시 Fonde 연구실의 Pearl Ryder입니다.오늘은 제어된 가교 결합과 그 뒤를 잇는 면역 자기 친화성 크로마토그래피를 이용한 단백질 복합체 분리 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 일시적이고 불안정한 단백질 상호작용을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.먼저 세포 플레이트 바닥에 세포 유형과 특정 실험 조건을 표시하여 라벨링합니다. 여기서 양성 기호(+)는 DSP 처리됨을 나타내며, 음성 기호(-)는 DMSO만 처리된 용매 대조군을 포함합니다. 세포 파종을 준비하기 위해 플레이트에 배지를 추가합니다.표준 튜브 반응당 500 µg의 단백질을 분리할 수 있도록 HEK 세포를 1:5 비율로 희석하여 분주합니다. 질량 분석 결과로부터 얻은 단백질의 추정 결합 파트너를 면역 블롯으로 확인하려면 단일 튜브만으로도 충분할 수 있습니다. 표준 반응 횟수를 최소 10배로 늘리십시오.가교 결합 실험에 사용되는 대부분의 용액들도 미리 준비합니다. 여기에는 0.1 millimolar calcium chloride와 1 millimolar magnesium chloride가 첨가된 PBS(PBS calcium magnesium으로 명명)가 포함됩니다. 칼슘 및 마그네슘 이온의 첨가는 세포가 배양 플레이트에 부착되는 데 매우 중요합니다.실험 과정 동안 용액을 4 °C에서 보관하십시오. 다른 스톡으로는 가교제 퀜칭 용액, 50 X 완전 단백질 분해효소 억제제 칵테일(펠렛이 녹을 때까지 20분마다 볼텍싱함), 4 °C에서 보관하고 한 달 이내에 사용해야 하는 20% Triton X 100, 그리고 10 x 및 1 x Buffer a 용액이 있습니다.동봉된 서면 프로토콜에 상세히 설명된 대로 모든 용액을 준비하고 보관하십시오. 마지막으로, 1X buffer와 0.5% TRITTON X 100으로 구성된 용해 버퍼(lysis buffer)와 1X buffer로 구성된 면역 자성 침전 버퍼 또는 IP 버퍼를 준비하십시오.Plating 후 2일이 지나 세포의 합류도(confluency)가 80~90%에 도달하면 가교 결합(cross-linking)에 최적의 상태가 됩니다. 합류도가 너무 높은 조건에서는 세포가 서로 겹쳐 쌓이는 경향이 있어, 모든 세포에 대한 세포 투과성 가교제의 접근성이 감소하게 됩니다. 가교 결합을 수행할 준비가 될 때까지 플레이트를 다시 인큐베이터에 보관하십시오.DSP 가교제(Crosslinker) 용액은 세포에 처리하기 직전에 준비하십시오. DSP는 소수성이 매우 강하므로, PBS 칼슘 마그네슘 버퍼에 희석하기 전에 DMSO에 녹여 100 millimolar 농도로 조제합니다. DSP를 PBS 칼슘 마그네슘 버퍼에 더 잘 희석시키기 위해, 적절한 부피의 버퍼를 가온한 후 DSP 및 DMSO 스톡 용액 10 microliters를 첨가하십시오.따뜻한 PBS calcium magnesium 1 mL당 D-S-P-D-M-S-O 스톡 용액을 한 방울씩 첨가하며, 모든 DSP가 용해될 때까지 반복적으로 혼합합니다. 또한, PBS calcium magnesium 1 mL당 DMSO 10 µL가 포함된 vehicle 대조군 용액을 준비합니다. DSP를 희석한 후, 모든 PBS calcium magnesium 용액은 얼음물 배스에 10분 이내로 보관하십시오.다음으로, 실험에 사용되는 모든 플레이트를 담을 수 있는 얼음물 배스(ice water bath)를 준비합니다. 37 °C 인큐베이터에서 세포가 포함된 배양 플레이트를 꺼내 즉시 얼음물 배스에 넣습니다. 가교제(crosslinker)와 함께 배양할 때 준비했던 것과 동일한 부피의 얼음처럼 차가운 PBS calcium magnesium를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 6-웰 플레이트의 경우 웰당 2 mL로 계산하여 수행합니다.두 번째 세척 후, 버퍼에 용해된 DMSO인 용매 대조군 또는 DSP 가교 버퍼 용액을 세포에 첨가하고 얼음 위에서 2시간 동안 배양하며, 약 20분마다 모든 세포가 용액으로 덮여 있는지 확인합니다. 일부 세포가 노출된 경우, 디쉬를 기울이고 회전시켜 다시 고르게 덮어줍니다. 소량의 DSP가 침전되는 것은 정상적인 현상입니다.세포와 함께 2시간 동안 배양하는 동안, 2시간의 배양 시간이 끝나기 전에 stalk을 PBS calcium magnesium으로 희석하여 1X DSP 퀀칭 용액을 준비합니다. 반응하지 않은 DSP를 불활성화하여 가교 결합 반응을 중단시키기 위해, 사용 전까지 해당 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 2시간이 지나면, 세포에서 vehicle 대조군 용액과 가교 결합 용액을 제거합니다.얼음처럼 차가운 DSP 퀀칭 용액을 첨가하고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 그동안 complete protease inhibitor cocktail 스톡을 세포 용해 버퍼에 1:50 비율로 희석합니다. 15분이 지나면, PBS calcium magnesium으로 세포를 2회 세척합니다.그 다음 프로테아제 억제제가 포함된 용해 완충액을 세포에 첨가하고 4°C에서 30분 동안 흔들어 섞어줍니다. 30분간 세포 용해를 진행한 후, 세포 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를 수집합니다. 프로테아제 활성을 최소화하기 위해 용해물을 반드시 얼음 위에 보관하십시오.벤치톱 미니 원심분리기를 사용하여 4°C에서 15,000 Gs의 최대 속도로 세포 용해물을 15분 동안 원심분리합니다. 상층액을 새 튜브에 옮기고 펠릿은 폐기합니다. Bradford assay를 사용하여 단백질 농도를 분석한 후 면역침전법을 진행합니다. 스크류 캡 마이크로 원심분리 튜브에서 2시간 동안의 가교 반응을 시작한 직후, 즉시 면역침전 준비를 시작하십시오.30 µL의 anti IgG 면역 자성 비드와 500 µL의 IP 버퍼를 혼합합니다. 관심 대상에 대한 항체를 첨가합니다. 항체의 적정량은 각 개별 항원에 따라 결정해야 합니다.예비 실험에서 비드의 가능한 음성 대조군으로는 항체 미첨가군, 비드 단독군, 그리고 IP 항체를 자성 비드에 결합시키기 위한 이소타입 대조 항체 비드군이 포함됩니다. 상온에서 엔드-오버-엔드 로커(end-over-end rocker)를 이용해 2시간 동안 배양하십시오. 배양이 끝나면 튜브를 짧게 원심분리한 후 자성 홀더에 넣으십시오. 비드가 자석 측면에 응집될 것입니다.결합되지 않은 항체가 포함된 용액을 제거하고, 비드가 마르는 것을 방지하기 위해 즉시 세척합니다. 두 번의 세척 후, 해당 튜브에 1 µg/mL 농도의 DSP 음성 또는 DSP 양성 세포 용해물 500 µL를 첨가합니다. 이 단계에서 예비 실험을 통해 결정된 농도의 면역원성 펩타이드를 용해물-비드 혼합물에 첨가하여 펩타이드 경쟁 음성 대조군을 준비할 수 있습니다.이 단계에서 준비할 수 있는 또 다른 음성 대조군은 비드에 용해 버퍼만 500 µL를 첨가하여 준비한 버퍼 전용 또는 용해물 제외 반응액입니다. 실험군 및 대조군 반응을 위한 비드를 부드럽게 재현탁하십시오. 비드가 파손될 수 있으므로 볼텍싱을 하지 마십시오. 4 °C에서 2시간 동안 엔드-오버-엔드(end-over-end) 회전 방식으로 배양하십시오.2시간이 지나면 자성 홀더를 사용하여 용해물을 제거합니다. 비드를 1 mL의 IP 버퍼로 총 6회 빠르게 원심 분리하여 세척합니다. 각 세척 단계마다 4 °C에서 5분 동안 배양합니다.결합된 복합체를 용출시키기 위해, 비드 펠릿 바로 위에 1x gel sample buffer를 IP 튜브에 추가합니다. 비드를 튜브 바닥에 모으기 위해, 모든 비드가 gel sample buffer에 재현탁되도록 튜브 바닥을 가볍게 탭합니다. 또는, 면역 친화성 분리를 위해 면역원성 펩타이드가 첨가된 버퍼 30 µL를 비드에 추가합니다.면역원성 펩타이드의 필요 농도는 실험적으로 결정합니다. 10에서 200 µM 범위로 테스트한 후, 비드를 4°C에서 2시간 동안 배양하며 30분마다 튜브를 가볍게 두드려 줍니다. 자석 홀더를 사용하여 용출된 복합체가 포함된 30 µL를 제거해 깨끗한 튜브에 보관하고, 비드는 IP 버퍼로 세척하여 보관합니다.두 가지 용출 방법 모두에 대해 비드에 1x 겔 샘플 버퍼를 추가합니다. 겔 샘플 버퍼에 재부유시킨 면역 자기 비드를 75 °C에서 5분 동안 가열하여 단백질을 변성시킵니다. 이 단계는 DSP 분자를 절단하여 복합체 런에서 개별 단백질을 분리할 수 있게 합니다.웨스턴 블로팅을 위한 SDS page 겔 상의 샘플입니다. 비워진 면역 자성 비드는 원심 분리를 통해 밀어내고, 로딩 전 자성 홀더를 사용하여 샘플에서 제거할 수 있습니다. SDS page의 단백질 염색이나 면역 블롯을 통해 면역 친화성 EUA에 IgG가 없음이 확인되면, 질량 분석법에 적합한 상태가 됩니다.다음은 가교 결합된 세포 용해물과 가교 결합되지 않은 세포 용해물을 사용하여 AP three 서브유닛에 대한 단일클론 항체로 면역 자기 침전법을 수행한 후 분석한 웨스턴 블롯의 예시입니다. Delta 가교 결합을 통해 면역 자기 분리 과정 중 가교 결합되지 않은 샘플에서는 관찰되지 않는 상호작용 단백질을 검출할 수 있습니다. 음성 대조군 결과, 가교 결합되지 않은 샘플과 가교 결합된 샘플 모두에서 항체 미사용 대조군 및 트랜스페린 수용체에 대한 IgG를 사용한 항체 이소형 일치 대조군을 통해 특정 단백질의 풀다운(pull down)이 일어나지 않음이 확인되었습니다.본 예시에서는 IP 항체에 결합된 단백질을 회수하기 위해 친화성 펩타이드 용출법을 사용하였습니다. 펩타이드 용출 과정 동안 면역 항체는 상층액 분획에는 존재하지 않으며 비드 분획에 남아 있음에 유의하십시오. 지금까지 화학적 가교제인 DSP를 사용하여 불안정한 MultiPro 복합체를 분리한 후, 면역 자성 친화성 정제를 수행하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때는 가교 결합 중 불안정한 상호작용을 유지하고 프로테아제 활성을 최소화하기 위해 세포 용액과 용해물을 냉장 상태로 유지하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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