불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

가교 결합 후 면역침강을 위해, 80~90% 밀도의 세포를 1 mM의 얼음처럼 차가운 DSP(PBS, 칼슘, 마그네슘 또는 DMSO만 포함)와 함께 배양합니다.

용매 대조군. DSP는 12 Å 이내에 있는 자유 말단 및 평균 말단들을 교차 결합시키는, 호모 이관능성 막 투과성 환원 가능 교차 결합제입니다. 교차 결합 후 세포를 용해하고 표준 대조군을 사용하여 면역 침전을 수행합니다.

그 다음, 환원 SDS page를 통해 단백질 복합체를 분리하며, 이때 환원제가 DSP를 절단하여 immuno blot으로 개별 단백질을 식별할 수 있게 합니다. 안녕하세요, 저는 Emory University 세포생물학과의 Dr.Victor Fonde 연구실 소속 Stephanie Ick입니다. 그리고 저는 역시 Fonde 연구실의 Pearl Ryder입니다.

오늘은 제어된 가교 결합과 그 뒤를 잇는 면역 자기 친화성 크로마토그래피를 이용한 단백질 복합체 분리 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 일시적이고 불안정한 단백질 상호작용을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

먼저 세포 플레이트 바닥에 세포 유형과 특정 실험 조건을 표시하여 라벨링합니다. 여기서 양성 기호(+)는 DSP 처리됨을 나타내며, 음성 기호(-)는 DMSO만 처리된 용매 대조군을 포함합니다. 세포 파종을 준비하기 위해 플레이트에 배지를 추가합니다.

표준 튜브 반응당 500 µg의 단백질을 분리할 수 있도록 HEK 세포를 1:5 비율로 희석하여 분주합니다. 질량 분석 결과로부터 얻은 단백질의 추정 결합 파트너를 면역 블롯으로 확인하려면 단일 튜브만으로도 충분할 수 있습니다. 표준 반응 횟수를 최소 10배로 늘리십시오.

가교 결합 실험에 사용되는 대부분의 용액들도 미리 준비합니다. 여기에는 0.1 millimolar calcium chloride와 1 millimolar magnesium chloride가 첨가된 PBS(PBS calcium magnesium으로 명명)가 포함됩니다. 칼슘 및 마그네슘 이온의 첨가는 세포가 배양 플레이트에 부착되는 데 매우 중요합니다.

실험 과정 동안 용액을 4 °C에서 보관하십시오. 다른 스톡으로는 가교제 퀜칭 용액, 50 X 완전 단백질 분해효소 억제제 칵테일(펠렛이 녹을 때까지 20분마다 볼텍싱함), 4 °C에서 보관하고 한 달 이내에 사용해야 하는 20% Triton X 100, 그리고 10 x 및 1 x Buffer a 용액이 있습니다.

동봉된 서면 프로토콜에 상세히 설명된 대로 모든 용액을 준비하고 보관하십시오. 마지막으로, 1X buffer와 0.5% TRITTON X 100으로 구성된 용해 버퍼(lysis buffer)와 1X buffer로 구성된 면역 자성 침전 버퍼 또는 IP 버퍼를 준비하십시오.

Plating 후 2일이 지나 세포의 합류도(confluency)가 80~90%에 도달하면 가교 결합(cross-linking)에 최적의 상태가 됩니다. 합류도가 너무 높은 조건에서는 세포가 서로 겹쳐 쌓이는 경향이 있어, 모든 세포에 대한 세포 투과성 가교제의 접근성이 감소하게 됩니다. 가교 결합을 수행할 준비가 될 때까지 플레이트를 다시 인큐베이터에 보관하십시오.

DSP 가교제(Crosslinker) 용액은 세포에 처리하기 직전에 준비하십시오. DSP는 소수성이 매우 강하므로, PBS 칼슘 마그네슘 버퍼에 희석하기 전에 DMSO에 녹여 100 millimolar 농도로 조제합니다. DSP를 PBS 칼슘 마그네슘 버퍼에 더 잘 희석시키기 위해, 적절한 부피의 버퍼를 가온한 후 DSP 및 DMSO 스톡 용액 10 microliters를 첨가하십시오.

따뜻한 PBS calcium magnesium 1 mL당 D-S-P-D-M-S-O 스톡 용액을 한 방울씩 첨가하며, 모든 DSP가 용해될 때까지 반복적으로 혼합합니다. 또한, PBS calcium magnesium 1 mL당 DMSO 10 µL가 포함된 vehicle 대조군 용액을 준비합니다. DSP를 희석한 후, 모든 PBS calcium magnesium 용액은 얼음물 배스에 10분 이내로 보관하십시오.

다음으로, 실험에 사용되는 모든 플레이트를 담을 수 있는 얼음물 배스(ice water bath)를 준비합니다. 37 °C 인큐베이터에서 세포가 포함된 배양 플레이트를 꺼내 즉시 얼음물 배스에 넣습니다. 가교제(crosslinker)와 함께 배양할 때 준비했던 것과 동일한 부피의 얼음처럼 차가운 PBS calcium magnesium를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 6-웰 플레이트의 경우 웰당 2 mL로 계산하여 수행합니다.

두 번째 세척 후, 버퍼에 용해된 DMSO인 용매 대조군 또는 DSP 가교 버퍼 용액을 세포에 첨가하고 얼음 위에서 2시간 동안 배양하며, 약 20분마다 모든 세포가 용액으로 덮여 있는지 확인합니다. 일부 세포가 노출된 경우, 디쉬를 기울이고 회전시켜 다시 고르게 덮어줍니다. 소량의 DSP가 침전되는 것은 정상적인 현상입니다.

세포와 함께 2시간 동안 배양하는 동안, 2시간의 배양 시간이 끝나기 전에 stalk을 PBS calcium magnesium으로 희석하여 1X DSP 퀀칭 용액을 준비합니다. 반응하지 않은 DSP를 불활성화하여 가교 결합 반응을 중단시키기 위해, 사용 전까지 해당 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 2시간이 지나면, 세포에서 vehicle 대조군 용액과 가교 결합 용액을 제거합니다.

얼음처럼 차가운 DSP 퀀칭 용액을 첨가하고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 그동안 complete protease inhibitor cocktail 스톡을 세포 용해 버퍼에 1:50 비율로 희석합니다. 15분이 지나면, PBS calcium magnesium으로 세포를 2회 세척합니다.

그 다음 프로테아제 억제제가 포함된 용해 완충액을 세포에 첨가하고 4°C에서 30분 동안 흔들어 섞어줍니다. 30분간 세포 용해를 진행한 후, 세포 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를 수집합니다. 프로테아제 활성을 최소화하기 위해 용해물을 반드시 얼음 위에 보관하십시오.

벤치톱 미니 원심분리기를 사용하여 4°C에서 15,000 Gs의 최대 속도로 세포 용해물을 15분 동안 원심분리합니다. 상층액을 새 튜브에 옮기고 펠릿은 폐기합니다. Bradford assay를 사용하여 단백질 농도를 분석한 후 면역침전법을 진행합니다. 스크류 캡 마이크로 원심분리 튜브에서 2시간 동안의 가교 반응을 시작한 직후, 즉시 면역침전 준비를 시작하십시오.

30 µL의 anti IgG 면역 자성 비드와 500 µL의 IP 버퍼를 혼합합니다. 관심 대상에 대한 항체를 첨가합니다. 항체의 적정량은 각 개별 항원에 따라 결정해야 합니다.

예비 실험에서 비드의 가능한 음성 대조군으로는 항체 미첨가군, 비드 단독군, 그리고 IP 항체를 자성 비드에 결합시키기 위한 이소타입 대조 항체 비드군이 포함됩니다. 상온에서 엔드-오버-엔드 로커(end-over-end rocker)를 이용해 2시간 동안 배양하십시오. 배양이 끝나면 튜브를 짧게 원심분리한 후 자성 홀더에 넣으십시오. 비드가 자석 측면에 응집될 것입니다.

결합되지 않은 항체가 포함된 용액을 제거하고, 비드가 마르는 것을 방지하기 위해 즉시 세척합니다. 두 번의 세척 후, 해당 튜브에 1 µg/mL 농도의 DSP 음성 또는 DSP 양성 세포 용해물 500 µL를 첨가합니다. 이 단계에서 예비 실험을 통해 결정된 농도의 면역원성 펩타이드를 용해물-비드 혼합물에 첨가하여 펩타이드 경쟁 음성 대조군을 준비할 수 있습니다.

이 단계에서 준비할 수 있는 또 다른 음성 대조군은 비드에 용해 버퍼만 500 µL를 첨가하여 준비한 버퍼 전용 또는 용해물 제외 반응액입니다. 실험군 및 대조군 반응을 위한 비드를 부드럽게 재현탁하십시오. 비드가 파손될 수 있으므로 볼텍싱을 하지 마십시오. 4 °C에서 2시간 동안 엔드-오버-엔드(end-over-end) 회전 방식으로 배양하십시오.

2시간이 지나면 자성 홀더를 사용하여 용해물을 제거합니다. 비드를 1 mL의 IP 버퍼로 총 6회 빠르게 원심 분리하여 세척합니다. 각 세척 단계마다 4 °C에서 5분 동안 배양합니다.

결합된 복합체를 용출시키기 위해, 비드 펠릿 바로 위에 1x gel sample buffer를 IP 튜브에 추가합니다. 비드를 튜브 바닥에 모으기 위해, 모든 비드가 gel sample buffer에 재현탁되도록 튜브 바닥을 가볍게 탭합니다. 또는, 면역 친화성 분리를 위해 면역원성 펩타이드가 첨가된 버퍼 30 µL를 비드에 추가합니다.

면역원성 펩타이드의 필요 농도는 실험적으로 결정합니다. 10에서 200 µM 범위로 테스트한 후, 비드를 4°C에서 2시간 동안 배양하며 30분마다 튜브를 가볍게 두드려 줍니다. 자석 홀더를 사용하여 용출된 복합체가 포함된 30 µL를 제거해 깨끗한 튜브에 보관하고, 비드는 IP 버퍼로 세척하여 보관합니다.

두 가지 용출 방법 모두에 대해 비드에 1x 겔 샘플 버퍼를 추가합니다. 겔 샘플 버퍼에 재부유시킨 면역 자기 비드를 75 °C에서 5분 동안 가열하여 단백질을 변성시킵니다. 이 단계는 DSP 분자를 절단하여 복합체 런에서 개별 단백질을 분리할 수 있게 합니다.

웨스턴 블로팅을 위한 SDS page 겔 상의 샘플입니다. 비워진 면역 자성 비드는 원심 분리를 통해 밀어내고, 로딩 전 자성 홀더를 사용하여 샘플에서 제거할 수 있습니다. SDS page의 단백질 염색이나 면역 블롯을 통해 면역 친화성 EUA에 IgG가 없음이 확인되면, 질량 분석법에 적합한 상태가 됩니다.

다음은 가교 결합된 세포 용해물과 가교 결합되지 않은 세포 용해물을 사용하여 AP three 서브유닛에 대한 단일클론 항체로 면역 자기 침전법을 수행한 후 분석한 웨스턴 블롯의 예시입니다. Delta 가교 결합을 통해 면역 자기 분리 과정 중 가교 결합되지 않은 샘플에서는 관찰되지 않는 상호작용 단백질을 검출할 수 있습니다. 음성 대조군 결과, 가교 결합되지 않은 샘플과 가교 결합된 샘플 모두에서 항체 미사용 대조군 및 트랜스페린 수용체에 대한 IgG를 사용한 항체 이소형 일치 대조군을 통해 특정 단백질의 풀다운(pull down)이 일어나지 않음이 확인되었습니다.

본 예시에서는 IP 항체에 결합된 단백질을 회수하기 위해 친화성 펩타이드 용출법을 사용하였습니다. 펩타이드 용출 과정 동안 면역 항체는 상층액 분획에는 존재하지 않으며 비드 분획에 남아 있음에 유의하십시오. 지금까지 화학적 가교제인 DSP를 사용하여 불안정한 MultiPro 복합체를 분리한 후, 면역 자성 친화성 정제를 수행하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때는 가교 결합 중 불안정한 상호작용을 유지하고 프로테아제 활성을 최소화하기 위해 세포 용액과 용해물을 냉장 상태로 유지하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.