불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

가교결합을 위해, 면역침전이 뒤따른다. 80-90% 밀도의 시술 세포를 1밀리몰의 얼음 냉기로 배양합니다. PBS, 칼슘, 마그네슘 또는 DMSO의 DSP만 해당됩니다.

차량 제어. DSP는 투과성 및 환원성 가교제(homo bifunctional membrane)로, 가교가 없고 서로 12옹스트롬 이내를 의미합니다. 그 후, cross-linking cell이 용해되고 면역 침전이 표준 대조군을 사용하여 수행됩니다.

그런 다음 단백질 복합체는 SDS 페이지를 감소시키고 제제의 절단된 DSP를 감소시켜 면역 블롯으로 개별 단백질을 식별할 수 있도록 함으로써 분해됩니다. 안녕하세요, 저는 에모리 대학교 세포생물학과 빅터 폰드 박사 연구실의 스테파니 익입니다. 그리고 저는 역시 퐁드 연구소의 펄 라이더입니다.

오늘은 제어된 가교를 사용한 후 면역 자기 친화성 크로마토그래피를 사용하여 마이단백질 복합체를 분리하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 일시적인 불안정한 단백질 상호 작용을 연구합니다. 시작하겠습니다.

세포 유형과 특정 실험 조건을 나타내기 위해 세포판의 바닥에 라벨을 붙이는 것으로 시작합니다. 여기서 양수 기호는 처리된 DSP에 음의 DMSO 전용 차량 제어가 포함됨을 나타냅니다. 세포 파종 플레이트를 준비하기 위해 플레이트에 매체를 추가합니다.

HEK 세포는 표준 튜브 반응당 500마이크로그램의 단백질을 분리할 수 있도록 1-5회 희석으로 파종됩니다. 단일 튜브는 질량 분석 분석의 면역 블롯에 의해 관심 단백질의 추정 결합 파트너를 식별하기에 충분할 수 있습니다. 표준 반응 횟수를 최소 10회 늘립니다.

또한 가교 실험에 사용되는 대부분의 용액의 줄기를 준비합니다. 여기에는 0.1 밀리몰의 염화칼슘이 보충된 PBS와 PBS 칼슘 마그네슘이라고 하는 1밀리몰의 염화마그네슘이 포함됩니다. 칼슘 이온과 마그네슘 이온의 첨가는 세포가 배양 플레이트에 접착되는 데 중요합니다.

실험이 진행되는 동안 용액을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 다른 주식으로는 펠릿이 용해될 때까지 20분마다 소용돌이치는 가교제 담금질 용액 50 X 완전 프로테아제 억제제 칵테일이 있습니다. 20%Tritan X 100은 섭씨 4도에서 보관되며 1개월 이내에 사용해야 하며 10배 및 1배 완충액 용액

함께 제공되는 서면 프로토콜에 자세히 설명된 대로 모든 솔루션을 준비하고 저장합니다. 마지막으로, 하나의 X 버퍼로 구성된 용해 버퍼를 준비합니다. 플러스 0.5%TRITTON X 100 및 면역 자기 침전 버퍼 또는 하나의 X 버퍼로 구성된 IP 버퍼.

플러스 0.1%TRITTON X 101에서 도금 후 2일 후, 세포는 80-90%co 유창성으로 가교에 최적입니다. 높은 co-fluency 조건에서는 세포가 서로 겹쳐지는 경향이 있어 모든 세포에 대한 세포 투과성 교차결합제의 접근성이 감소합니다. 가교 준비가 될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 다시 놓습니다.

세포에 적용하기 직전에 DSP Crosslinker 용액을 준비합니다. DSP는 소수성이 높기 때문에 PBS 칼슘 마그네슘 완충액으로 희석되기 전에 DMSO에 100밀리몰 농도로 용해됩니다. PBS 칼슘 마그네슘 완충액으로의 DSP 희석을 더욱 향상시키려면 따뜻하고 적절한 부피로 10마이크로리터의 DSP 및 DMSO 원액을 첨가합니다.

따뜻한 PBS 칼슘 마그네슘 1ml당 DSP가 모두 용해될 때까지 D-S-P-D-M-S-O 스톡 용액을 한 방울씩 반복해서 섞습니다. 또한 PBS 칼슘 마그네슘 1밀리리터당 10마이크로리터의 DMSO로 구성된 차량 제어 솔루션을 준비합니다. DSP를 희석한 후 모든 PBS 칼슘 마그네슘 용액을 얼음물에 10분 이상 보관하지 마십시오.

다음으로, 실험에 사용 된 모든 플레이트를 담을 얼음물 욕조를 준비합니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 세포가 들어 있는 배양판을 꺼내 즉시 얼음물 수조에 넣습니다. 얼음처럼 차가운 PBS 칼슘 마그네슘으로 세포를 두 번 세척하고, 이전에 가교제로 배양을 위해 준비한 동일한 부피를 사용하여 6 개의 우물 플레이트를 계산하고 웰 플레이트는 웰 당 2 밀리리터를 계산하는 식입니다.

두 번째 세척 후. 완충액에 용해된 DMSO인 비히클 컨트롤 또는 DSP 가교 완충액을 세포에 첨가하고 얼음에서 2시간 동안 배양하고 약 20분마다 모든 세포가 용액으로 덮여 있는지 확인합니다. 일부 세포가 노출되면 접시를 기울이고 회전시켜 다시 고르게 덮으면 소량의 DSP가 침전되는 것은 정상입니다.

2시간의 배양이 끝나기 전에 세포와 함께 2시간 동안 배양하는 동안 줄기를 PBS 칼슘 마그네슘으로 희석하여 1개의 XDSP 담금질 용액을 준비합니다. 반응하지 않은 DSP를 비활성화하여 가교 반응을 중지하기 위해 사용할 때까지 용액을 얼음 위에 두십시오. 2시간이 지나면 셀에서 차량 제어 장치와 가교 용액을 제거하십시오.

얼음처럼 차가운 DSP 담금질 용액을 넣고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 한편, 완전한 프로테아제 억제제 칵테일 스톡을 1에서 50까지 세포 용해 완충액에 희석합니다. 15분이 지나면 PBS 칼슘 마그네슘으로 세포를 두 번 씻습니다.

그런 다음 프로테아제 억제제가 포함된 용해 완충액을 세포에 추가하고 섭씨 4도에서 30분 동안 흔들어 놓습니다. 세포 용해 30분 후 세포 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를 수집합니다. 프로테아제 활성을 최소화하기 위해 용해물을 얼음 위에 보관하십시오.

15의 최고 속도에 탁상용 소형 분리기에 있는 4 섭씨 온도에 15 분 동안 세포 lysate를 회전시키십시오, 신선한 관으로 000 Gs.Pipette 상등액을 버리고 펠릿을 버리십시오. Bradford assay를 사용하여 단백질 수준을 분석하고 면역침전을 진행합니다. 스크류 탑 마이크로 원심분리기 튜브에서 2시간 가교 반응을 시작한 직후 면역침전 준비를 시작합니다.

30마이크로리터의 항 IgG 면역 마그네틱 비드와 500마이크로리터의 IP 버퍼를 결합합니다. 관심 대상에 대한 항체를 추가합니다. 개별 항원에 대해 적절한 항체 양을 결정해야 합니다.

예비 실험에서, 비드에 대한 가능한 음성 대조군에는 IP 항체를 자기 비드에 결합하기 위한 항체 없음, 비드 및 동형대조군 항체 비드가 포함됩니다. 실온에서 2 시간 동안 엔드 오버 엔드 로커에서 배양 배양이 끝나면 튜브를 빠르게 회전시켜 마그네틱 홀더에 밀어 넣습니다. 구슬은 자석 측면에 집중됩니다.

결합되지 않은 항체가 포함된 용액을 제거하고 비드가 건조되지 않도록 즉시 세척하십시오. 두 번 세척한 후 DSP 음성 또는 DSP 양성 세포 용해물 500마이크로리터를 1밀리리터당 적절한 튜브에 추가합니다. 이 단계에서 펩타이드 경쟁 음성 대조군은 예비 실험에서 결정된 농도의 면역원성 펩타이드를 용해물 비드 혼합물에 첨가하여 준비할 수 있습니다.

이 단계에서 제조된 또 다른 가능한 음성 대조군은 비드에만 500마이크로리터의 용해 완충액을 첨가하여 제조된 완충액 단독 또는 용해물이 없는 반응입니다. 실험 및 제어 반응을 위해 비드를 부드럽게 재현탁합니다. 소용돌이치지 마십시오.이렇게 하면 비드가 4도에서 2시간 동안 회전하면서 배양됩니다.

2 시간이 지나면 마그네틱 홀더를 사용하여 용해물을 제거하십시오. 1ml의 IP 버퍼로 비드를 빠르게 돌리고 총 6회 세척합니다. 각 세척을 섭씨 4도에서 5분 동안 배양합니다.

결합된 복합체를 피하기 위해 비드 펠릿 바로 위의 IP 튜브에 1개의 x 겔 샘플 버퍼를 추가합니다. 튜브 바닥에 비드를 모으려면 튜브 바닥을 부드럽게 두드려 모든 비드가 겔 샘플 버퍼에 다시 부유하도록 합니다. 대안적으로, 30 microliter의 완충액에서 면역 친화성 분리를 위해 비드에 면역원성 펩타이드를 보충합니다.

면역원성 펩타이드의 필요한 농도는 경험적으로 결정됩니다. 10에서 200 마이크로 몰의 범위를 테스트 한 후 2 시간 동안 4도에서 구슬을 배양하고 30 분마다 튜브를 두드립니다. 마그네틱 홀더를 사용하여 용출된 복합체가 포함된 30마이크로리터를 제거하고 IP 버퍼로 깨끗한 튜브 세척에 저장하고 비드를 저장합니다.

두 용리 방법 모두에 대해 비드에 하나의 x gel sample buffer를 추가합니다. 단백질을 변성시키는 것 외에도 겔 샘플 버퍼에 현탁된 면역 자성 비드를 섭씨 75도에서 5분 동안 가열합니다. 이 단계는 또한 DSP 분자를 절단하여 복합체 실행에서 개별 단백질을 분리할 수 있도록 합니다.

웨스턴 블로팅을 위한 SDS 페이지 젤의 샘플. 비워진 면역 마그네틱 비드는 원심분리로 밀어낼 수 있으며 로딩 전에 마그네틱 홀더를 사용하여 샘플에서 제거할 수 있습니다. 면역 친화성 EUA에 SDS 페이지의 단백질 염색 또는 면역 블롯에 의해 IgG가 없는 경우 질량 분석에 적합합니다.

다음은 가교 및 비가교 세포 용해물에서 나온 물질의 서쪽 블롯과 AP 3 subunit에 대한 단클론 항체를 사용한 면역 자기 침전의 예입니다. Delta cross-linking을 사용하면 면역 자기 분리 중에 non cross-linked 샘플에서 볼 수 없는 상호 작용 단백질을 검출할 수 있습니다. 음성 대조군에서는 비가교결합 및 가교결합 시료 모두에 대해 트랜스페린 수용체에 대한 IgG를 사용한 항체 무함유 및 항체 동형일치 대조군을 사용한 특정 단백질 풀다운이 없는 것으로 나타났습니다.

이 예에서는 IP 항체에 결합된 단백질을 회수하기 위해 친화성 펩타이드 용리를 사용했습니다. 면역 항체는 supernat fraction에 없으며 펩타이드 용출 중에 beat fraction에 남아 있습니다. 화학적 교차결합제 DSP를 사용하여 불안정한 MultiPro 복합체를 분리한 후 면역 자기 친화성 정제를 수행하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때는 세포 용액과 용해물을 차갑게 유지하여 가교 중에 불안정한 상호 작용을 유지하고 단백질 분해 효소 활성을 최소화하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.