Name: 안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 27 s
Description: 학습하세요 Hi-C 방법을 통해 게놈 전체 크로마틴 상호작용을 식별하고 염색체 영역 및 크로마틴 구조를 분석하는 기법을 배우세요. 이 프로토콜은 인간 게놈 아키텍처 연구에 필수적입니다.

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AP 에이든, XR 바오, M. 브레너, D. Galas, W. 고스퍼, A. Jaffer, A. 멜린 니 코브 감독, A. Miele, G. Giannoukos, C. Nusbaum, AJM Walhout, 우리는 토론과 코드 A. Kosmrlj 감사 , L. 우드, 그리고 K. Zeldovich 토론, 시각화에 도움과 L. 개프니 및 B. 웡. 패니와 존 허츠 재단 대학원 교제, 국방 과학 대학원 친목, NSF 대학원 친교, 국립 우주 바이오 메디컬 연구소, 그리고 노을 부여하여 지원. 국가 인간 게놈 연구소 (NHGRI) (EL)에서 T32 HG002295; i2b2 (생물 및 예의상 통합을위한 정보학), 브리검 여성 병원의 (LAM)에서 바이오 메디컬 컴퓨팅에 대한 NIH 지원 센터, 부여도 없습니다. NHGRI에서 HG003143하고 켁 재단 뛰어난 젊은 학자 수상 (JD). 원료 및 매핑 하이 - C 시퀀스 데이터는 GEO 데이터베이스 (에 입금되지 않은 <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/">www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</a> 가입도). GSE18199. 추가 시각화는에서 구할 수 있습니다 <a href="http://hic.umassmed.edu">http://hic.umassmed.edu</a> .

<ol><li>Lieberman-Aiden, E., Van Berkum, N. L., Williams, L., Imakaev, M., Ragoczy, T., Telling, A., Amit, I., Lajoie, B. R., Sabo, P. J., Dorschner, M. O., Sandstrom, R., Bernstein, B., Bender, M. A., Groudine, M., Gnirke, A., Stamatoyannopoulos, J., Mirny, L. A., Lander, E. S., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Kosak, S. T., Groudine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+follows+function%3A+the+genomic+organization+of+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Dev%22%5BJournal%5D)">Form follows function: the genomic organization of cellular differentiation.</a> Genes and Dev. 18, 1371-1384 (2004).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+sequence%3A+cellular+organization+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (2007).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Regulation+in+the+Third+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene Regulation in the Third Dimension.</a> Science. 319, 1793-1794 (2008).</li>
<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories%2C+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nat Rev Genet. 2, 292-301 (2001).</li>
<li>Sexton, T., Schober, H., Fraser, P., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+through+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+and+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene regulation through nuclear organization.</a> Nat Struct and Mol Biol. 14, 1049-1055 (2007).</li>
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<li>Zhao, Z., Tavoosidana, G., Sjölinder, M., Göndör, A., Mariano, P., Wang, S., Kanduri, C., Lezcano, M., Sandhu, K. S., Singh, U., Pant, V., Tiwari, V., Kurukuti, S., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+chromosome+conformation+capture+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nat Genet. 38, 1341-1347 (2006).</li>
<li>Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nat Genet. 38, 1348-1354 (2006).</li>
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<li>Miele, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Cis-+and+Trans+Chromatin+Interaction+Networks+Using+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping Cis- and Trans Chromatin Interaction Networks Using Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Methods Mol Biol. 464, 105-121 (2009).</li>
<li>Maccallum, I., Przybylski, D., Gnerre, S., Burton, J., Shlyakhter, I., Gnirke, A., Malek, J., McKernan, K., Ranade, S., Shea, T. P., Williams, L., Young, S., Nusbaum, C., Jaffe, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALLPATHS+2%3A+small+genomes+assembled+accurately+and+with+high+continuity+from+short+paired+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+%22%5BJournal%5D)">ALLPATHS 2: small genomes assembled accurately and with high continuity from short paired reads.</a> Genome Biol . 10, R103-R103 (2009).</li>
</ol>

히 - C 방식에 잠정 특허 (제 1백분의 61, 151)가 검토됩니다.

우리는 편견, 게놈 - 광범위한 방식으로 염색질 상호 작용을 매핑하여 게놈의 3 차원 구조를 공부하는 방법을 제시. 분리 이전의 작품에서이 기술을 설정 뭐가 가장 중요한 실험 단계 - 무딘 엔드 내고 전에 가교 조각의 끝을 제한에 biotinylated 세포핵의 결합입니다. 이 단계를 수행하면 성공적으로 깊은 모든 결합의 분기점의 시퀀싱 수 있으며 하이 - C에게 그 범위와 능력을 제공합니다. 읽은의 개수는 궁극적으로 상호 작용지도의 해상도를 결정합니다. 여기에서 인간 게놈에 대한 1 MB 상호 작용지도는 ~ 30000000 alignable 읽기를 사용하여 제공됩니다. N의 요소에 의해 &#39;모든 목적을&#39;해상도를 향상시키기 위해, 읽기의 숫자는 N 2의 요인에 의해 증가한다. 히 - C 기술은 쉽게 이러한 하이브리드 라이브러리 생성 후에 캡처 (게놈의 특정 부분을 대상으로)와 결합 후 염색질의 immunoprecipitation (특정 단백질과 연관된 영역의 염색질 환경을 검토) 같은 다른 기술과 결합 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>단백질 분해효소 억제제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340-5ml</td><td>단계 1.2</td></tr><tr><td>biotin-14-dCTP</td><td>Invitrogen</td><td>19518-018</td><td>단계 1.6</td></tr><tr><td>Klenow</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td>단계 1.6 및 2.2</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Invitrogen</td><td>15224</td><td>단계 1.9</td></tr><tr><td>T4 DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td>단계 1.17 및 2.2</td></tr><tr><td>10x ligation buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td>단계 2.2 및 3.4</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td>단계 2.2</td></tr><tr><td>Klenow (exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td>단계 2.3</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavin C1 Beads</td><td>Invitrogen</td><td>650.01</td><td>단계 3.2</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase HC</td><td>Enzymatics</td><td>L603-HC-L</td><td>단계 3.5</td></tr><tr><td>Phusion HF mastermix</td><td>New England Biolabs</td><td>F531</td><td>단계 3.8</td></tr><tr><td>Ampure beads</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A2915</td><td>단계 3.9</td></tr></tbody></table>

안녕하세요 - c : genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

염색체의 3 차원 접는는 게놈을 compartmentalizes하고 닫습니다 공간적 근접 2-6에 이러한 발기인 및 강화로 멀리 기능 요소를, 가져올 수 있습니다. 염색체 조직과 게놈 활동 사이의 관계를 파악하는 것은 전사 및 복제와 같은 게놈 프로세스를 이해하는 데 도움이됩니다. 그러나, 약간은 염색체가 접는 방법에 대해 잘 알려져 있습니다. 현미경은 loci 동시에 또는 높은 해상도에서 다수의 구별 수 없습니다. 날짜하려면, 염색체 형태 캡처 (3C) 및 그 후속 adaptations를 사용하여 염색체의 상호 작용 감지 게놈 - 광범위한 연구를 불가능 7-10 만들기, 대상 loci의 집합의 선택이 필요합니다. 우리는 하이 - C, 편견, 게놈 차원의 방식으로 원거리 상호 작용을 식별하는 능력이 3C의 확장을 개발했습니다. 안녕하세요 - C에서는 전지가 상호 작용하는 loci가 공유 결합 DNA - 단백질 상호 링크에 의해 서로 바운드되는 원인, 포름 알데히드와 함께 고정됩니다. DNA가 후 제한 효소와 조각되면 이러한 loci가 연결된 상태로 유지됩니다. 5 &#39;overhangs가 다음 날이 엔드 내고이 교차 연결된 DNA 조각 사이의 결합 이벤트를 선호 희석 조건 하에서 수행 채워 있으므로 biotinylated 잔여물이 통합됩니다. 핵 서로 가까이에서 원래되었습니다 조각 쌍에 대응하는 결합 제품의 게놈 전체의 도서관에서이 결과를. 각 내고 제품은 접합의 사이트에서 비오틴과 함께 표시됩니다. 도서관은 가지각색이고, 분기점은 streptavidin 구슬로 다운 뽑아 있습니다. 정화 분기점은 이후 상호 작용하는 조각의 카탈로그 결과, 높은 처리량 시퀀서를 사용하여 분석하실 수 있습니다. 결과 연락처 행렬의 직접적인 분석은 염색체 지역의 존재와 작은 유전자 풍부한 염색체의 특혜 협회, 게놈 조직의 여러 기능을 보여줍니다. 상관 관계 분석은 인간 게놈 두 구획으로 차별 것을 보여주는, 연락처 행렬에 적용할 수 있습니다 : 오픈 액세스 및 활성 염색질과보다 치밀한 구획을 포함하는 적은 밀도 포장 구역은 폐쇄, 액세스할 수 및 비활성 염색질 지역을 포함. 마지막으로, 이론 및 전산 시뮬레이션 derivati​​ons와 결합 연락처 모체의 앙상블 분석, megabase 규모에 하이 C가 프랙탈 소구의 형태와 일치하는 기능을 보여줍 것으로 나타났다.

히 - C 방식은 염색질 상호 작용 (1) 편견, 게놈 차원의 식별이 가능합니다. 히 - C의 커플 근접 결합 및 대규모 병렬 시퀀싱합니다. 그 결과 데이터가 여러 스케일에서 게놈 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 : 초기 결과는 같은 염색체 지역, 개방적이고 닫힌 염색질의 분리 및 megabase 규모의 염색질 구조와 같은 기능을 확인.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

염색체의 3차원 접힘은 게놈을 구획화하며, 프로모터 및 인핸서와 같이 서로 멀리 떨어진 기능적 요소들을...

Hi.C는 게놈 전반에 걸쳐 편향되지 않은 방식으로 장거리 염색질 상호작용을 식별하는 방법입니다. 먼저 포름알데히드로 세포를 고정시킨 후 세포를 용해하며, 이어서 제한 효소로 DNA를 단편화합니다. 다음으로, 5' 오버행을 둔탁하게 채우는 과정에서 비오틴화된 잔기를 통합하며, 가교된 DNA 단편들 사이의 결합이 유리하도록 희석된 조건에서 라이게이션을 수행합니다.라이브러리를 전단하고 strep havein 비드로 접합부를 침전시킵니다. 정제된 접합부는 이후 고처리량 시퀀서를 사용하여 분석할 수 있으며, 이를 통해 상호작용하는 단편들의 카탈로그를 얻게 됩니다. 이러한 결과는 염색질의 접힘에 대한 통찰을 제공하며, 염색체 영역의 존재, 개방형 및 폐쇄형 염색질로의 게놈 구획화, 그리고 Megabase 규모에서의 Fractal Glo 조직화에 대한 증거를 밝혀줍니다.안녕하세요, 저는 매사추세츠 대학교 의과대학 유전자 기능 및 발현 프로그램의 Laboratory Field Decker 소속 Nka Van Bergham입니다. 안녕하세요, 저는 하버드 및 매사추세츠 공과대학교의 Broad Institute 내 Eric Lander 연구실의 Ez Lieberman Aiden입니다. 저는 Broad Institute 분자 생물학 R&D 그룹의 Louis Williams입니다. 그리고 매사추세츠 공과대학교 Len Muni 연구실의 Maxima Mackay입니다.오늘은 High-C라고 불리는 전장 유전체 염색체 구조 확인 캡처(genome-wide chromosome confirmation capture) 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 인간 유전체의 구조를 실험적으로 탐구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 보여드릴 절차의 첫 번째 부분은 UMass Medical School에서 진행되며, 두 번째 부분은 Prude Institute에서 수행됩니다. 또한, MIT에서 High-C 실험 결과를 사용하여 유전체의 역동성을 어떻게 시뮬레이션했는지도 보여드리겠습니다.그럼 시작하겠습니다. 다시 한번 시작해 보겠습니다. Hi-C는 세포의 가교 결합(cross-linking)으로 시작하며, 이는 염색체 구조 확인 캡처(chromosome confirmation capture)에서 흔히 사용되는 방법입니다.10⁷에서 2.5 × 10⁷ 사이의 포유류 세포를 부착 또는 부유 상태로 배양하여 준비합니다. 균질기(homogenizer)를 사용하여 550 µL의 용해 완충액(lysis buffer)에서 세포를 용해하고 가교(cross-link)합니다. 크로마틴을 5,000 RPM으로 원심 분리하고, 펠렛을 500 µL의 NEB buffer 2로 두 번 세척합니다. 이를 번호가 매겨진 5개의 튜브에 분주하고, NEB buffer 2를 추가하여 최종 부피를 362 µL로 맞춥니다.1% SDS 혼합물 38 µL를 조심스럽게 첨가하고 65 °C에서 10분 동안 배양합니다. 튜브를 즉시 얼음에 다시 놓은 다음, Triton X 100 44 µL와 400 units의 HindIII를 조심스럽게 혼합하여 첨가함으로써 SDS를 퀜칭(quench)하고, 회전시키며 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 단계들은 Hi-C 특이적 과정으로, biotin으로 DNA 말단을 표지하고 가교된 단편들의 평활 말단 결합(blunt end ligation)을 수행하는 과정을 포함합니다.이 단계는 나중에 튜브에서 라이게이션 접합부(ligation junctions)를 정제할 수 있게 합니다. 하나의 튜브는 비오틴 용출 단계를 거치지 않아야 하며, 대신 나머지 4개 튜브에서 제한 효소 절편 오버행(restriction fragment overhangs)을 채우고 DNA 말단에 비오틴을 표지하기 위한 소화 및 라이게이션 조건이 최적이었는지 확인하는 대조군으로 사용해야 합니다. 튜브 2번부터 5번까지 dATP, dGTP 및 dTTP를 첨가하십시오.또한 biotin이 결합된 DCTP와 Klino를 추가합니다. 조심스럽게 혼합한 후 37 °C에서 45분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 튜브를 얼음에 놓은 다음, 모든 튜브에 10% SDS 86 µL를 첨가하여 효소를 불활성화합니다.튜브를 65 °C에서 정확히 30분 동안 배양한 후, 즉시 얼음에 배치하십시오. 가교된 단편 간의 라이게이션 반응을 촉진하기 위해, 라이게이션은 매우 희석된 조건에서 수행됩니다. 얼음 위에서 15 mL 튜브 5개에 각각 7.61 mL의 라이게이션 믹스를 추가하십시오.그 다음, 소화된 각 크로마틴 혼합물을 해당 튜브로 옮깁니다. 일반적인 3C 결합을 수행하기 위해 튜브 1에 T4 DNA ligase 10 µL를 첨가합니다. 이어서 blunt end High-C 결합을 수행하기 위해 튜브 2에서 5까지 T4 DNA ligase 50 µL를 첨가합니다.튜브를 뒤집어 섞어준 후 16 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 배양 후, 튜브당 50 µL의 proteinase K를 첨가하고 65 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 단백질을 분해하고 CNA 가교 결합을 해제합니다. 다음 날 튜브당 50 µL의 proteinase K를 추가로 첨가하고 65 °C에서 2시간 더 배양합니다.반응 혼합물을 회수하여 50 mL 원추형 튜브 5개에 옮깁니다. 페놀 추출을 수행하여 이 튜브 내의 DNA를 정제합니다. 페놀 10 mL를 첨가하고 2분 동안 볼텍싱합니다.튜브를 3,500 RPM에서 10분 동안 원심 분리하고, 수용액층을 가능한 한 많이 새로운 50 milliliter 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. phenol chloroform을 사용하여 추출을 반복하고 ethanol을 사용하여 DNA를 침전시킵니다. ethanol로 침전된 DNA를 원심 분리한 후, 각 DNA 펠릿을 450 microliters의 1 XTE buffer에 녹여 1.7 milliliter 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 500 microliters의 phenol, chloroform으로 두 번의 phenol chloroform 추출을 수행하여 또 한 번의 정제 과정을 거칩니다. 1분 동안 vortexing하고 튜브를 14,000 RPM에서 5분 동안 원심 분리한 후, 두 번째 추출 후에 수용액층을 새 튜브로 옮깁니다.침전된 DNA를 원심 분리하여 가라앉힌 후 에탄올 침전을 수행하며, 각 DNA 펠렛을 70% ethanol로 한 번 세척한 다음 25 microliters의 1X TE buffer에 다시 현탁합니다. 튜브당 1 microliter의 RNase A를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양하여 존재할 수 있는 모든 RNA를 분해합니다. 튜브 1을 3 C 대조군으로 분리해 둔 상태에서, 튜브 2에서 5의 high C 함량물을 회수합니다.이제 0.8% AASE 겔에서 분취액을 전기영동하여 라이브러리의 양과 질을 확인할 적절한 시점이며, Hi-C의 결합 효율은 PCR 소화 분석으로 평가해야 합니다. Hi-C 과정에서 수행된 평활 말단 생성 및 결합은 엔도뉴클레아제 NHE1을 위한 제한 효소 부위를 생성합니다. 3C 및 Hi-C 라이브러리에서 증폭된 단편들을 HindIII 및 NHE1으로 소화시켜 평활 말단이 얼마나 잘 생성되었는지, 그리고 결합되지 않은 단편이 얼마나 존재하는지 확인할 수 있습니다. 서면 프로토콜에 기술된 대로 T4 DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성을 이용하여 이러한 미결합 말단에서 비오틴을 제거하십시오.페놀 클로로포름 추출과 에탄올 침전법을 사용하여 DNA를 다시 정제하고, DNA 펠릿을 총 100 µL의 물에 재현탁합니다. 샘플이 품질 관리 분석을 통과하면, 바이오 샘플 다운로드 및 시퀀싱으로 프로토콜을 계속 진행합니다. 감사합니다.고처리량 시퀀싱에 적합하도록 BIOTINYLATED DNA를 준비하기 위해, CAVAS S two 장비를 사용하여 DNA를 300에서 500 base pairs 크기로 전단해야 합니다. 10 x lation buffer, DN TPS, T four DNA polymerase, T four POLYNUCLEOTIDE kinase, clear now DNA polymerase 및 물을 첨가하여 DNA를 복구합니다. 샘플을 상온에서 30분 동안 배양하십시오. 배양 후, 제조사의 권장 사항에 따라 Kaya Gym MinLu 컬럼을 사용하여 DNA를 정제합니다. DNA를 컬럼에 로딩하고 세척한 후, 50 µL의 one XTLE buffer로 DNA를 두 번 용출하십시오. 그 다음, 10 XNEB buffer, 두 DATP, 물 및 exonuclease deficient cile fragment를 첨가하여 말단이 복구된 DNA의 three promen에 DATP를 부착합니다.cile 조각을 불활성화하기 위해 반응물을 37 °C에서 30분 동안 배양하십시오. 반응물을 65 °C에서 20분 동안 배양한 후, speed vac을 사용하여 얼음 위에서 반응물을 냉각시키고, 반응 부피를 20 µL로 농축하십시오. 다음으로, 1X TAE가 포함된 1.5% 아가로스 겔에 DNA를 로딩하고 80~90V에서 3.5시간 동안 전기영동을 수행하십시오.300에서 500 base pair 사이의 DNA 단편을 절단하고, 겔의 무게에 따라 2~4개의 컬럼을 사용하여 Qiagen gel extraction kit로 정제합니다. kayak quick 컬럼에서 얻은 용출액을 합치고, 1X TE buffer를 사용하여 최종 부피를 300 µL로 맞춥니다. 마지막으로, Qubit의 QU assay를 사용하여 DNA 농도를 측정하고, 프로토콜의 이 단계에서 확보한 DNA의 총량을 계산합니다.DNA 풀에서 리게이션 접합부를 정제하여, 페어드 엔드 시퀀싱을 통해 상호작용하는 염색질 단편을 효율적으로 식별할 수 있게 합니다. 이후의 모든 단계는 DNA 저결합 튜브에서 수행하십시오. 비오틴 결합을 위한 비드를 준비하십시오.1x tween buffer 400 µL로 재현탁된 magnetic strep A bead 150 µL를 두 번 세척하여 풀다운(pull down)합니다. 이후의 세척 과정은 버퍼를 비드에 추가하고, 혼합물을 새 튜브로 옮긴 다음, 실온에서 3분 동안 샘플을 회전시키고, 자성 입자 농축기를 사용하여 비드를 회수하는 다섯 단계로 구성됩니다.상층액을 제거합니다. 300 µL의 2x no tween 버퍼에 비즈를 현탁하고 300 µL의 high cDNA와 혼합합니다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 회전시키며 배양하여 비오틴 표지 high cDNA가 strep din 비즈에 결합하도록 합니다.자기 입자 농축기를 사용하여 비드에 결합된 DNA bound strp A를 회수하고 상층액을 제거합니다. 400 µL의 1x no tween buffer로 비드를 세척한 후, 100 µL의 1x ligation buffer로 다시 세척합니다. 비드를 50 µL의 1x ligation buffer에 재현탁하고 혼합물을 새 튜브로 옮깁니다.Illumina paired-end 시퀀싱을 위한 DNA를 준비하려면, 앞서 정량 분석(quant assay)을 통해 계산한 biotin pull down용 DNA 총 투입량을 20으로 나누어, pull down되어 라이게이션(ligation)에 사용할 수 있는 고순도 cDNA의 양을 추정하십시오. 라이게이션 가능한 고순도 cDNA 1 µg당 6 pmol의 Illumina paired-end 어댑터를 첨가하십시오. 1,200 units의 T4 DNA ligase를 사용하여 DNA에 어댑터를 라이게이션하십시오.실온에서 2시간 동안 배양합니다. cDNA가 결합된 비드를 회수하고 1x Tween buffer 400 µL로 비드를 2회 세척하여 리게이션되지 않은 paired end adapter를 제거합니다. 1x, no Tween buffer 200 µL로 비드를 세척한 후, 1X NEB buffer 200 µL와 50 µL 순으로 세척합니다.마지막 세척 후 두 번 더 반복합니다. 비즈를 50 µL의 NEB buffer 2에 다시 현탁하여 새 튜브로 옮깁니다. 시퀀싱에 충분한 PCR 산물을 생성하는 데 필요한 사이클 수를 결정합니다.6, 9, 12 또는 15 사이클로 네 가지 테스트 PCR 반응을 설정합니다. 5% 폴리아크릴아마이드 겔에서 PCR 반응물을 전기영동하고 사이버 그린(cyber green)으로 염색하여 최적의 사이클 수를 결정합니다. 이때 가성 밴드가 없어야 하며, 어댑터 결합 후 공유 산물의 길이인 400 600 base pairs 사이에서 스미어(smear)가 나타나야 함을 확인합니다. 나머지 high C 라이브러리 round stripped의 비드를 최적의 PCR 사이클 수로 대규모 PCR을 통해 증폭합니다. 각각의 웰에서 PCR 산물을 회수하고 비드를 재생합니다.대규모 PCR 생성물의 1%를 젤 전기영동용으로 따로 보관하고, 나머지 PCR 생성물은 제조사의 권장 사항에 따라 1.8배 부피의 pure beads를 사용하여 정제하십시오. 50 µL의 1X TE buffer로 DNA를 용출한 후, PU bead로 정제한 PCR 생성물의 1%와 원래 PCR 생성물의 1% 분취액을 5% polyacrylamide 젤에서 비교하십시오. PCR 프라이머 서열이 성공적으로 제거되었는지 확인한 후, Illumina paired end sequencing을 이용한 high-C 라이브러리에서 MAC을 사용하여 각 끝단을 독립적으로 정렬함으로써 상호작용하는 염색질 단편을 식별하십시오.High C 프로토콜이 기술적으로 적절하게 수행되었을 때 다음과 같은 결과가 예상되며, 이는 품질 관리 표준으로 간주될 수 있습니다. 품질 관리 단계에서 3C 및 high C 라이브러리 모두 10 kilo bases보다 큰 상당히 조밀한 밴드로 나타나야 합니다. DNA 스미어(smear)가 관찰된다면 이는 라이게이션 효율이 낮음을 나타냅니다.일반적으로 high C 라이브러리의 결찰 효율은 three C 템플릿에 비해 약간 낮습니다. High C 마킹 및 결찰 효율은 three C PCR 산물의 제한효소 절단을 통해 추정할 수 있습니다. Three C 접합부는 Hindi III에 의해 절단되지만 NHE I에는 의해 절단되지 않습니다.High C 접합부의 경우에는 그 반대가 성립합니다. 이 PCR 소화 분석은 high C 앰플리콘의 70%가 NHE one에 의해 절단되며 HI Hindi.Three에 의해는 절단되지 않음을 보여줍니다. 라이게이션 접합부의 효율적인 마킹을 확인하기 위해, 시퀀싱 리드 분석 결과 파란색과 빨간색 선으로 표시된 염색체 내 및 염색체 간 상호작용의 리드들이 녹색으로 표시된 무작위 생성 리드들에 비해 Hindi three 제한 효소 부위에 유의미하게 더 가깝게 정렬되어야 합니다.성공적인 실험의 경우, 정렬 가능한 리드 쌍의 55%가 염색체 간 상호작용을 나타냅니다. 15%는 20 kilobases 미만 거리에 있는 단편들 사이의 염색체 내 상호작용을 나타내며, 30%는 20 kilobases 이상 거리에 있는 염색체 내 리드 쌍입니다. 이러한 분포는 고처리량 시퀀싱 전에 품질 관리의 일환으로 샘플링될 수 있습니다.보통 100개 정도의 클론을 클로닝하고 Sanger 시퀀싱을 수행하는 것으로 충분합니다. 염색질 상호작용은 X축과 Y축이 게놈 서열을 나타내고 각 픽셀이 그들 사이에서 관찰된 상호작용 횟수를 나타내는 히트맵으로 시각화할 수 있습니다. 일반적으로 선형 게놈상에서 서로 매우 가까이 위치한 DNA 단편들은 서로 빈번하게 상호작용하는 경향이 있습니다.이는 염색체 내(intra chromosome) 맵 또는 히트맵에서 뚜렷한 대각선 형태로 나타납니다. 다음 결과들은 게놈 조직의 다양한 수준을 밝히기 위해 데이터를 분석하는 여러 가지 방법을 보여줍니다. 접촉 확률을 게놈 거리(genomic distance)에 대해 도식화하면, 접촉 확률이 게놈 거리의 함수로서 감소하다가 결국 모든 거리에서 정체기(plateau)에 도달함을 알 수 있습니다.실선으로 표시된 염색체 내 상호작용은 점선으로 표시된 염색체 간 상호작용에 비해 풍부하게 나타납니다. 이는 염색체 영역의 존재를 직접적으로 시사하며, 모든 염색체 쌍 사이의 관찰된 염색체 간 접촉 수와 예상 수를 계산하면 특정 염색체 쌍 간의 우선적 결합이 드러납니다. 유전자가 풍부한 작은 염색체들은 서로 우선적으로 상호작용하며, 이는 밝은 빨간색으로 표시되어 있습니다.개별 염색체 또한 분석할 수 있습니다. 로우 히트맵(raw heat map)은 기대 히트맵(expected heat map)을 사용하여 조정함으로써 로커스 쌍 사이의 게놈 거리를 반영할 수 있으며, 그 결과 관찰값 대 기대값 히트맵(observed over expected heat map)이 생성됩니다. 이후 관찰값 대 기대값 히트맵의 행과 열을 상관 분석함으로써 상관 행렬(correlation matrix)을 도출할 수 있습니다.상관관계 분석을 통해 인간 게놈이 두 개의 컴파트먼트로 분리된다는 것이 입증되었습니다. 이는 체크무늬 패턴으로 나타납니다. high C 데이터를 이용한 상관관계 히트맵을 통해 메가베이스 규모의 염색질 폴딩에 대한 새로운 통찰을 얻을 수 있었습니다.일반적인 고분자 모델에 기반한 염색질 패킹(chromatin packing)은 염색질이 평형 GLO 상태로 패킹된다고 제안할 것입니다. 접촉 확률(contact probability)이 거리의 함수임을 나타내는 GLO 플로팅(Ploting) 결과는 접촉 확률이 게놈 거리(genomic distance)에 따라 멱법칙(power law)으로 비례하며, 그 기울기가 약 -1임을 보여줍니다. 이는 평형 Glo의 거동과는 일치하지 않지만, 프랙탈 글로(fractal glo)라고 알려진 대안적 구조의 예상치와는 일치합니다. 여기 두 가지 구형 구조가 제시되어 있습니다.색상은 한쪽 끝지점으로부터의 거리에 따라 파란색에서 시안 그린, 노란색, 주황색, 그리고 빨간색 순으로 나타납니다. 그리고 평형 글로불(equilibrium globules)과 마찬가지로, 프랙탈 글로불(fractal globules)은 프랙탈 Glo 내에서 엉킴이 없습니다. 등고선을 따라 인접한 유전자좌(loci)는 3D 공간에서도 서로 인접한 경향이 있어 단색 블록이 형성됩니다.이러한 블록들은 평형 상태의 Glo에서는 발견되지 않습니다. 얽힘의 부재는 글로불을 구속하는 힘을 제거하여 글로불이 팽창하게 함으로써 입증할 수 있으며, 이때 프랙탈 글로불은 빠르게 탈응축됩니다. 반면, 평형 상태의 Glo는 너무 심하게 얽혀 있기 때문에 그렇게 되지 않습니다.지금까지 analyzer high C 라이브러리를 제작하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 효율적인 high C ligation 및 정제를 보장하기 위해 적절한 대조군 실험을 수행하는 것이 중요합니다. 최종적인 리드(read) 수는 상호작용 지도(interaction map)의 해상도를 결정하게 됩니다.우리는 약 3,000만 개의 리드(reads)를 사용하여 약 1메가베이스 해상도로 인간 게놈의 상호작용 지도를 생성했습니다. 해상도를 N배 높이려면 리드의 수를 n의 제곱배만큼 늘려야 합니다. 인간 게놈의 구조에 대해 배우는 과정이 유익하시길 바랍니다.이상입니다. 시청해주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

hi-c-a-method-to-study-the-three-dimensional-architecture-of-genomes

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

3DNA 소프트웨어 패키지, 분석 구축, 3 차원 핵산 구조를 시각화하는 기능을 갖춘 인기있는 다양한 생물 정보학 도구입니다. 이 문서에서는 각각의 구조 및 관련 구조의 앙상블에 모두 적용 3DNA에서 사용할 수있는 새로운 대중적인 기능의 하위 집합에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

3DNA과 핵산의 구조를 분석하고 구축

우리가 직접 라벨 형광 프로브를 사용하여 3D DNA 물고기에 의해 핵 구조를 분석하기위한 강력하고 다양한 프로토콜을 설명합니다.

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

이 작품 설명 프로토콜 위한 고해상도 제자리에 이 C 라이브러리에서의 세대 단단히 준비 사전 gastrulation 초파리 melanogaster 태아.

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

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