Name: zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 배우세요 제브라피시 배아의 고처리량 화학 스크리닝을 위한 자동 이미징 및 분석 시스템을 개발하는 방법을. BCI 분자를 사용한 FGF 신호전달 정량화 기법을 익혀보세요.

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이 작품은 Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) 포그트하고, NHLBI / NIH (1R01HL088016) Tsang로하는 NICHD / NIH (1R01HD053287)에 의해 재정 지원을합니다.

1) zebrafish matings 및 BCI 처리를 설정합니다. <ol><li> 개별적으로 짝짓기 탱크 하나에 pt6 zebrafish 및 장소 : 이틀 전에 치료, homozygous 남성 TG를 (d2eGFP dusp6) 식별합니다. 구분 및 야생 타입 AB * 여성의 물고기를 추가하고 야간 짝짓기 새장에 둡니다. </li><li> 다음날 아침은 구분 기호를 제거하고 1 시간 뒤에 배아를 수집합니다. E3 (5 MM NaCl, 0.17 MM KCl, 0.33 MM CaCl2, 0.33 MM MgSO4), 6 시간 동안 28 ° C에서 솔루션과 부화와 100mm 요리 배아를 전송합니다. 죽은 제거하고 배아를 unfertilized, 신선한 E3 솔루션을 추가하고 밤새 품어. </li><li> 유사한 단계 (24hpf)과 균일한 GFP 발현을위한 유전자 변형 배아를 정렬하십시오. 96 - 웰 플레이트의 각 우물에 개별적으로 배열 배아. </li><li> micropipette과 초과 E3 솔루션을 제거합니다. 각 우물에 멀티 채널 pipettor와 E3 솔루션의 200μl를 추가합니다. </li><li> 로 표시된 다음과 같은 화합물을 추가합니다 : <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> B </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> C </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> D </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> E </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> F </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> G </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> H </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl BCL (0.1mM) </td><td> 2μl BCL (0.5mM) </td><td> 2μl BCL (1mM) </td><td> 2μl BCL (2mM) </td><td> 2μl BCL (2.5mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr></tbody></table> 최종 농도는 1 %의 DMSO에 5μM, 10μM, 20μM, 25μM BCI 1μM 있습니다. 알루미늄 호일의 플레이트 커버 28 6 시간 동안 품어 ° C.를 </li></ol> 96 - 웰 플레이트 및 분석 2) 자동 이미징. <ol><li> 30hpf 배아를 마취 각 잘하는 tricaine (0.61mM)의 10μl를 추가합니다. </li><li> 분자 장치 Imagexpress 울트라에 플레이트를로드합니다. </li><li> 오픈 Metaxpress 소프트웨어. 4X 객관적이고 최대 핀홀 직경과 구성을 선택, 레이저 오토포커스는 접시 바닥을 감지하도록 구성하고, Z - 비행기의 관심 영역을 감지하는 최적의 결정합니다. 525분의 488 NM (GFP)의 여기 / 발광 파장의 형상을 습득. 노 비닝과 2000x2000 픽셀 (4 X 4mm)의 단일 사이트로 영역을 스캔 설정합니다. 레이저 전원을 구성하고 포화하지 긍정적인 컨트롤 이미지 같은 것을 밝은 지역을 습득합니다. 몇 가지 긍정적이고 부정적인 제어 우물에 적절한 이미지 수집을 확인합니다. </li><li> 판 검사를 시작합니다. 악기는 자동으로 모든 우물 및 아카이브들을 SQL 서버 데이터베이스에서에서 이미지를 획득합니다. </li><li> Cellenger 응용 프로그램 모듈과 분자 장치 Imagexpress 울트라 플랫폼에 의해 생성된 이미지 포맷 및 파일 구조를 인식 가져오기 필터를 사용하여 Definiens 개발자에 이미지를 업로드합니다. </li><li> 사용자 정의 설계 인식 네트워크 기술 알고리즘 (또한 ruleset 칭했다)과 프로세스 이미지. 우리가 정의가 최근에 출판된 ruleset 2를 기반으로 개발된 알고리즘은, 자동으로 배아, 난황, 그리고 머리를 식별하고, GFP - 표현 헤드 구조의 밝기와 영역을 계량하기 위해 설계되었습니다. 더 배아가 감지되지되는거나 머리가 unambiguously (예를 들어, 초점 이미지의 높은 화합물 독성 또는 밖으로)를 할당할 수 없습니다 어디 웰스는 분석에서 제외됩니다. 몇 가지 부정적인 통제 이미지 (차량 취급)와 긍정적인 이미지 제어 (BCI이 대접) 머리와 노른자가 올바르게 모두에서 확인할 수 있습니다 그러한 사용하여 알고리즘을 구성합니다. 밝은 머리 구조의 검색이 시각적 관찰과 일치하는 때까지 의미 노른자 강도의 배수으로 "머리 구조"검출 임계값을 설정합니다. 수출에 매개 변수를 정의합니다. 이 예제에서, 가장 유익한 매개 변수 이하 "전체 헤드 구조의 밝기"(그림 1) 칭했다 머리 이내 GFP 양성 지역의 전체 통합 밝기되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 그래프는 유전자 변형 배아에서 GFP 표현에 BCI의 복용량에 의존 효과를 depicitng. </li><li> 통합 작업 스케줄러를 사용하여 모든 플레이트 이미지 알고리즘을 실행합니다. Definiens 소프트웨어는 여러 개의 이미지를 동시에 분석함으로써 여러 프로세서 ( "엔진")에서 분산 컴퓨팅을 사용합니다. 알고리즘 적용 분석 처리 이미지의 사본과 함께 데이터베이스에 저장되는 이미지 분석,의 결과에 따라 수치 조치를 계산합니다. </li></ol> 대표 결과 : 모든 이미지는 분석 후 데이터 Cellenger 이내 시각하거나 추가 분석 및 그래픽 표현에 대한 타사 소프트웨어 (엑셀, GraphPad 프리즘)에 수출하고 있습니다. 그림 2 보여줍 대우 자동차에서 스캔 이미지를 보관하고 적용과 CNT 분석없이 잘 BCI - 대우. 그림 1 문서 TG에서 GFP 리포터 유전자 발현 (dusp6 : d2EGFP)에 BCI의 복용량에 의존 효과 pt6 배아. 반 최대한 응답 (EC50)을 이끌어내는 데 필요한 농도는 약 12​​ μm의되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 유전자 변형 zebrafish의 배아의 자동 이미지 캡처 및 분석. 30hpf에서 pt6 배아 (A) DMSO 차량은 TG를 (d2eGFP dusp6) 치료. (B) 20μM BCI 쇼 취급 트렌스 제닉 배아는 GFP 발현 증가. 배아의 (C) 이미지에서 (A) 머리에 GFP 발현을 찾을 수 ruleset Definiens를 실행한 후. 오렌지 명소 소프트웨어가 GFP 강도를 측정 어디 상징. (D) 배아의 이미지에서 (B) 머리에 GFP 발현을 찾을 수 ruleset Definiens를 실행한 후. 오렌지 명소 소프트웨어가 GFP 강도를 측정 어디 상징. ruleset은 치료 배아에서 GFP의 표현의 확장 영역을 찾을 수 있다고합니다.

<ol><li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li>
<li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li>
</ol>

zebrafish 화학 화면의 처리량을 제한하는 주요 요인은 체계적으로 처리 이미징 및 분석을위한 96 - 웰 플레이트에 방법론의 부족이다. 다세포 생물의 이미지가 복잡하고, 낮은 콘트라스트, 그리고 자연의 이기종 때문에, 기존의 영상 분석 알고리즘은 유기체 내의 특정 구조를 감지하고 수치 실패합니다. 대부분의 출판 zebrafish 화학 화면 따라서 절차 전반에 걸쳐 전담 요원에 의해 개인 우물의 영상 검사를 포함하고 있습니다. 이것은 일반적으로 수치 설치 했어요의 생성 및 화면 이미지와 데이터의 보관 완전히 방지합니다. 또한, 수동 평가 즉 이미지 기반의 심사, 화면 성능의 회고 분석을 수행하기 위해 심사 캠페인 (예 : 독성 또는 발달 결함)의 주요 초점이되지 않은 phenotypic 변경 사항을 검토하고 교차하는 기능의 몇 가지 주요 장점을 제거 같은 화합물 라이브러리를 사용하여 과거 또는 미래 스크린 - 참조 검사 데이터입니다. 이 보고서에서 우리는 사용자의 개입없이 multiwell 플레이트에 zebrafish 배아의 자동 이미징 및 분석을위한 방법론을 강조. 96 잘 접시에 pt6 배아 및 Definiens &#39;인식 네트워크 기술되는 계량 GFP에게 기반으로 이미지 분석 알고리즘을 개발 : 이미지 TG (d2EGFP dusp6)에 공촛점 리더를 (분자 장치, 서니 베일, CA) 스캔 ImageXpress 울트라 레이저에서 우리는 자동 이미지 캡처 유전자 변형 배아의 머리에 표현. 방법은 등급 반응을 전달하고 작은 분자 FGF 신호의 활성의 생체내 활동에 계량. 비슷한 결과는 그것이 상용 판 독자의 다양한 2 zebrafish 배아의 자동 이미지 캡처를 구현 가능하다 문서화 epifluorescence 기반 ArrayScan II (Cellomics 주식 회사, 피츠버그 PA)로 획득했다. 자동으로 다세포 생물 이미지를 분석하는 방법론의 개발은 인간의 관찰자에 의해 시각 점수에 대한 필요성을 제거하고 미래의 스크린 회고 분석 및 비교를위한 수치 데이터 및 이미지의 생성 및 보관을 활성화.

<table><tbody><tr><td>Tricaine (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>카탈로그 번호 A-5040</td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

우리는 zebrafish의 배아에서 FGF / RAS / MAPK 경로를 조절 수있는 작은 분자를 식별하는 이미지 기반의 높은 콘텐츠 심사 (HCS) 방법론의 응용 프로그램을 보여줍니다. zebrafish 배아는 생체내 높은 컨텐츠 화학 화면에서 이상적인 시스템입니다. 1 일 이전 난자는 직경이 약 1mm이고 쉽게 96 - 웰 플레이트, 높은 처리량 검사를위한 표준 형식으로 못하였 느니라 수 있습니다. 개발의 첫날 동안 배아 따라서 embryogenesis 동안 조직 형성의 시각화를 가능하게 현재 주요 기관의 대부분 투명하고 있습니다. zebrafish 화학 화면의 완벽한 자동화는 특히 자동화된 이미지 수집 및 분석의 개발에, 그러나, 여전히 도전입니다. 우리는 이전에 FGF 활동의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 유전자 변형 기자 라인을 생성하고 화학 화면에서 유틸리티를 보여주<sup&gt; 1</sup&gt;. 높은 처리량 전체 유기체 화면에 대한 방법론을 확립하기 위해, 우리는 96 - 웰 플레이트에 24-48시간 포스트 수정 (HPF)에서 zebrafish 배아의 자동 이미징 및 분석을위한 시스템을 개발<sup&gt; 2</sup&gt;. 이 비디오에서 우리는 24hpf에서 multiwell 플레이트에 유전자 변형 배아를 arraying위한 절차를 강조 표시하고 FGF 신호를 hyperactivates 작은 분자 (BCI)의 추가<sup&gt; 3</sup&gt;. 접시는 분자 장치 ImageXpress 울트라 레이저 스캐닝 공촛점 HCS 리더에서 사전에 자동으로 이미지에 애벌레를 마취하는 tricaine의 또한 다음에 6 시간 동안 incubated 수 있습니다. 이미지는 우리가 유전자 변형 배아의 머리에 GFP의 표현을 감지하고 수치 개발한 인식 네트워크 기술 알고리즘을 사용하여 Definiens 개발자 소프트웨어에 의해 처리됩니다. 이 예제에서 우리는 치료 배아에서 GFP 리포터 유전자 표현에 대한 BCI의 복용 종속적인 효과를 측정하는 알고리즘의 능력을 강조.

우리는 multiwell 플레이트에 zebrafish 배아 유전자 변형의 자동 이미징 및 분석을위한 시스템의 개발을보고합니다. 이것은 Fibroblast 성장 팩터 리포터 유전자의 표현에 작은 분자, BCI의 복용 부양 효과를 측정하고 높은 처리량 zebrafish 화학 화면 설립을위한 기술을 제공하는 능력을 보여줍니다.

우리는 FGF/RAS/MAPK 경로를 조절할 수 있는 저분자 화합물을 식별하기 위해 이미지 기반의 고함량 스크리닝(HCS) 방법론의 적용 사례를 제시합니다.

본 비디오에서는 제브라피시 배아의 섬유아세포 성장 인자 Ras-map kinase 경로의 저분자 화합물 기반 조절을 평가하기 위해 이미지 기반 고함량 스크리닝을 수행합니다. 형질전환 수컷과 야생형 암컷 제브라피시를 교배 케이지에서 교배시킵니다. 수정란이 바닥으로 떨어지면 이를 수집하여 페트리 접시로 옮깁니다. 배아를 하룻밤 동안 배양한 후, 96웰 라운드 바텀 플레이트의 개별 웰에 배치합니다.소분자 BCI를 첨가하여 FGF 신호 전달을 과활성화시킨 후, 플레이트를 6시간 동안 배양합니다. 각각의 이미지들을 공초점 플레이트 리더로 캡처하고, 특정 배아 구조의 형광 강도를 보고하는 자체 설계 알고리즘을 사용하여 분석합니다. 안녕하세요, 저는 피츠버그 대학교 미생물학 및 분자 유전학과의 Michael Chang 박사님 연구실의 Hiba Kado입니다.안녕하세요, 피츠버그 대학교 신약 개발 연구소(University of Pittsburgh Drug Discovery Institute)의 Andrea Spock입니다. 오늘은 화학적 처리를 위해 제브라피쉬 배아를 교배, 선택 및 배열하는 절차를 보여드리겠습니다. 96웰 플레이트에서 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor) 활성을 보고하는 형질전환 배아를 사용하고, 이 경로를 과활성화하는 분자로 처리하겠습니다.형질전환 제브라피쉬 배아에서 섬유아세포 성장 인자 활성을 자동으로 획득, 분석 및 정량화하기 위해 고함량 스크리닝 방법론을 사용하는 방법을 보여드리겠습니다. 본 절차에서는 형질전환 제브라피쉬와 고처리량 화학물질 스크리닝을 활용하는 플랫폼 기술을 강조할 것입니다. 그럼 시작하겠습니다.처리 2일 전, 호모자이거스 수컷 형질전환 제브라피쉬를 식별하여 개별 교배 탱크에 넣습니다. 탱크에 격리판을 추가한 다음, 각 탱크에 야생형 암컷 물고기를 넣고 28 °C에서 하룻밤 동안 교배 케이지에 둡니다. 다음 날 아침, 격리판을 제거합니다. 1시간 후, 물고기를 새 탱크로 옮기고 배아를 플라스틱 체에 붓습니다.배아를 E3 용액이 담긴 100 mm 디쉬로 옮기고 28 °C에서 6~8시간 동안 배양합니다. 배양 후, 실체 현미경으로 배아를 관찰합니다. 가스 교환(gastrulation) 단계에 진입한 배아가 실험에 적합합니다.이 단계에서 단세포 단계에 머물러 있는 수정되지 않은 배아를 모두 제거합니다. 또한, 불투명하거나 기형으로 보이는 생존 불가능한 배아도 함께 제거합니다. 그 다음, 신선한 E three 용액을 첨가하고 28 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 형광 실체 현미경 아래에 배아를 배치하여 유사한 단계와 균일한 GFP 발현을 보이는 형구 배아를 선별합니다. 24 HPF 배아는 강한 GFP 발현이 나타나는 뚜렷한 중뇌-후뇌 경계와 GFP 양성인 등쪽 망막을 가진 잘 형성된 눈을 보입니다. 이러한 배아들은 활발하며, 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 난막 내에서 움직이거나 꿈틀거리는 것을 확인할 수 있습니다.24 HPF 배아를 96-웰 플레이트의 개별 웰에 하나씩 옮깁니다. 마이크로 피펫을 사용하여 웰에서 과잉의 E three 용액을 제거합니다. 그런 다음 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 200 µL의 E three 용액을 추가합니다.다음으로, 1번과 12번 열의 모든 웰에 DMSO 2 µL를 첨가하십시오. 그런 다음 DMSO로 준비된 BCL을 다음과 같이 각 웰에 2 µL씩 첨가합니다. 2번과 7번 열에는 1 µM, 3번과 8번 열에는 5 µM, 4번과 9번 열에는 10 µM, 그리고 나머지 열에는 20 µM를 첨가하십시오.5번과 10번 컬럼에는 micromolar를, 마지막으로 6번과 11번 컬럼에는 25 micromolar를 넣습니다. 이제 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 28 °C에서 6시간 동안 배양합니다.30 HPF 배아를 마취시키기 위해 각 웰에 10 µL의 trica를 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 molecular devices image express ultra open meta express 소프트웨어가 설치된 기기에 로드합니다. 4x 대물렌즈와 최대 핀홀 직경 설정의 구성을 선택하십시오.레이저 자동 초점을 설정하여 플레이트 바닥을 감지하고 미리 정의된 최적 Z 오프셋을 사용하도록 합니다. 관심 영역을 감지하려면 스캔 영역을 빈닝 없이 2000 by 2000 픽셀의 단일 사이트로 설정합니다. 적절한 플레이트 유형을 선택하고, 여기 파장 488 nm, 방출 파장 525 nm 조건에서 488 nanometer 아르곤 레이저를 선택합니다.그런 다음 vehicle 처리된 배아가 포함된 웰을 선택하고 find sample을 클릭합니다. 기기가 자동 초점 스캔을 수행하고 단일 이미지를 획득하여 이미지가 적절하게 획득되었는지 확인합니다. vehicle 처리된 웰을 무작위로 선택하여 이미지를 획득합니다.이미지의 초점이 맞고 머리 부분에서 GFP 발현이 확인되면, 가장 밝은 영역에 커서를 놓고 형광 강도가 16비트 카메라의 범위인 65,000단위 미만인지 확인하십시오.다른 용매 대조군과 몇 개의 화합물 처리 웰에 대해 이 단계들을 반복하십시오. 필요한 경우, 양성 대조군 이미지의 가장 밝은 영역이 포화되지 않도록 레이저 출력과 게인을 조정하십시오. 다음으로, 플레이트 획득 및 제어 창에서 플레이트 획득을 선택하여 플레이트 스캔을 시작하십시오.장비가 전체 마이크로플레이트의 웰당 하나의 이미지를 자동으로 획득하여 SQL 서버 데이터베이스에 저장합니다. 스캔이 완료되면, slinger 옵션을 활성화하여 developer를 실행한 후 이미지를 D definition으로 업로드하십시오.새 작업 공간을 생성합니다. 그런 다음 파일 메뉴에서 사용자 정의 가져오기를 선택합니다. 다음으로 이미지가 포함된 폴더로 이동하여 샘플 파일을 엽니다.Molecular Devices Image Express Ultra 플랫폼에서 생성된 이미지 형식과 파일 구조를 인식하는 임포트 필터를 선택하십시오. 이제 이미지를 처리하기 위해 컨트롤 이미지를 열고 원하는 인지 네트워크 기술(cognition network technology) 또는 CNT 알고리즘 또는 규칙 세트를 로드하십시오. 여기서 사용된 사용자 정의 알고리즘은 배아, 난황 및 머리를 자동으로 식별하고 GFP를 발현하는 머리 구조의 밝기와 면적을 정량화하도록 설계되었습니다. 규칙 세트를 실행하여 머리 및 난황 검출 단계까지 진행하십시오.난황낭과 머리를 정확하게 지정하려면, 난황의 크기가 너무 크거나 작은 경우 난황 검출 임계값을 조정하도록 규칙 세트를 수정하십시오. 다음으로, 밝은 머리 구조 검출 단계까지 규칙 세트를 실행하십시오. 머리 내 GFP 발현 영역을 정확하게 지정하려면, 밝은 머리 구조의 검출 결과가 시각적 관찰 결과와 일치할 때까지 머리 구조 검출 임계값을 평균 강도의 배수로 조정하여 규칙 세트를 수정하십시오.다음으로, vehicle 처리된 배아에서 생성된 무작위로 선택된 여러 이미지와 PCI 처리된 배아의 양성 대조군 이미지에 대해 전체 규칙 세트를 수동으로 실행하십시오. 모든 플레이트 이미지에 알고리즘을 실행하려면, 분석할 플레이트를 선택하고 Analyze를 클릭하십시오. 그다음 최적화된 규칙 세트로 이동하여 모든 웰을 분석하십시오.통합 작업 스케줄러를 사용하면 스캔 중에 빈 웰이나 모호한 이미지가 분석에서 자동으로 제외됩니다. 지속적으로 업데이트되는 유지 맵(keep map)이 표시됩니다. 실행 중에 시각적 검사를 위해 데이터와 이미지 모두에 액세스할 수 있습니다.수치 데이터와 처리된 이미지는 자동으로 저장됩니다. 모든 이미지의 분석이 완료되면, 데이터를 Excel, GraphPad 또는 prism과 같은 외부 소프트웨어로 내보낼 수 있습니다. 이 그림은 CNT 분석을 수행한 경우와 수행하지 않은 경우의 vehicle 처리군 및 BCI 처리군에서 보관된 스캔 이미지를 보여줍니다.형질전환 배아의 눈, 중뇌-후뇌 경계 및 삼차신경절에서 도입된 녹색 형광 단백질(GFP)이 검출됩니다. GFP의 강도와 발현 영역이 모두 확장되었음에 유의하십시오. 여기의 BCI 처리 배아에서는 형질전환 배아의 GFP 리포터 유전자 발현에 대해 BCI의 농도 의존적 효과가 관찰됩니다.반최대 반응을 유도하는 데 필요한 농도인 EC 50은 약 12 micromolar였습니다. 지금까지 형질전환 제브라피쉬 배아를 교배하고 수집하여 96 웰 플레이트에 배열하는 방법을 보여드렸습니다. 우리는 신호 전달 경로의 자체 활성제인 PCI의 농도를 점차 높여 첨가하였습니다.우리는 또한 형질전환 배아의 이미징을 자동화하는 방법을 제시하였으며, 인지 네트워크 기술을 기반으로 맞춤 설계된 알고리즘을 사용하여 이미지를 분석했습니다. 이러한 접근 방식을 통해, 섬유아세포 성장 인자 신호 전달의 소분자 활성제가 미치는 영향을 단계적으로 정량 측정할 수 있었습니다. 이 절차를 수행할 때는 표본 간의 변동성을 최소화하기 위해 배아를 신중하게 선택하는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

대규모 Zebrafish 기반 생체내에서 작은 분자 화면

여기 면역 - modulatory의 bioactives의 식별을 목표로 소설 높은 콘텐츠를 화학적으로 유도된 염증 분석을 설명합니다. 우리는 성공적으로 염증 반응뿐만 아니라 추가로 데이터 처리, 분석, 마이닝, 그리고 저장 장치의 자동 부량을 활성화하는 사용자 정의 개발 소프트웨어의 스크립트와 자동화된 현미경을 결합했습니다.

촉진 약물 디스커버리 : Zebrafish의 자동화된 하이 컨텐츠 염증 분석

이 기사에서는 제브라피시 배아가 화학적 독성 검사에 사용됩니다. 화학적 독성은 표현형 판독과 상관관계가 있습니다. 샘플 프로토콜은 화학적 독성 스크리닝을 수행하는 방법론적 접근 방식을 보여줍니다.

배아 기반 화학 독성 스크리닝: 제브라피시 배아 발달에 미치는 영향 평가

글루코 코르티코이드 응답 생체 Zebrafish의 루시 페라 제 활동 (GRIZLY) 분석 : 우리는 zebrafish의 애벌레를 사용하여 글루코 코르티코이드 스트레스 호르몬 신호에 대한 화학적 스크리닝 시스템의 절차와 데이터 분석에 대해 설명합니다. 분석은 민감하고 특히의 물질 대사가 필요하거나 내생 글루코 코르티코이드 생산에 영향을 미치는 화합물에 의한 글루코 코르티코이드 신호에 영향을 감지합니다.

Zebrafish의 유충 루시 페라 제 리포터 시스템과 글루코 코르티코이드 신호에 대한 화학적 스크리닝 절차

우리 연구실은 7 일 된 제브라 피쉬의 애벌레의 여러 가지 행동의 검출에 유용 소설 높은 처리량 자동화 이미징 시스템을 개발했다. 이 시스템은 유충이 환경 독성 물질이나 약품에 노출 된 후 행동의 미묘한 변화를 감지하는 데 사용할 수 있습니다.

Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

제브라 피쉬는 척추 동물의 발생 과정과 모델 인간의 질병을 연구 할 수있는 좋은 실험 유기체이다. 여기, 우리가 함께 제브라 피쉬 배아에서 수동 높은 처리량 화학 화면을 수행하는 방법에 대한 프로토콜 설명 판독을 현장 하이브리드 (WISH)에서 전체를 장착.

Zebrafish의 배아를 사용하여 높은 처리량 접근 수동 작은 분자 화면

여기, 우리 디자인 하 고 서식 파일, 높은 처리량 zebrafish 태아 96 잘 접시에 배열에 대 한 같은 서식 파일의 사용에 자세한 절차 뒤 개 zebrafish 태아 조작 프로토콜을 제시.

3 차원 (3D)-배열 하는 높은 처리량 Zebrafish 태아에 대 한 서식 파일을 인쇄

Zebrafish 배아는 화학 화합물의 독성을 평가하는 데 사용됩니다. 그들은 외부에서 개발하고 미묘한 자형기능 변화의 검출을 허용, 화학 물질에 민감하다. 실험은 배아를 함유하는 플레이트에 직접 첨가되는 소량의 화합물만을 필요로 하므로 테스트 시스템이 효율적이고 비용 효율적입니다.

Zebrafish 배아를 이용한 화학 화합물의 독성에 대한 신속한 평가

Zebrafish 이종이식 모델은 생체 내 미세 환경에서 인간 암 세포의 고처리량 약물 스크리닝 및 형광 이미징을 허용합니다. 당사는 자동 형광 현미경 장착 이미징 유닛을 사용하여 제브라피시의 환자 유래 백혈병 시료에 대한 대규모 자동 약물 스크리닝을 위한 워크플로우를 개발했습니다.

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

제브라피시 배아 진동 놀람 반응을 기반으로 화합물 독성을 평가하기 위한 스크리닝 시스템의 워크플로우 및 데이터 분석에 대해 설명합니다. 이 시스템은 진동 자극에 노출된 제브라피시 배아의 움직임을 기록하고 일반 독성/치사율 및 신경근 독성을 통합적으로 평가할 수 있습니다.

제브라피시 진동 놀람 반응 스크리닝 시스템을 사용한 화학물질의 독성 평가

배우세요 제브라피시 배아의 고처리량 화학 스크리닝을 위한 자동 이미징 및 분석 시스템을 개발하는 방법을. BCI 분자를 사용한 FGF 신호전달 정량화 기법을 익혀보세요.

zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

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