zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

이 비디오에서는 섬유아세포 성장 인자 Rasm map kinase pathway의 소분자 기반 조절을 평가하기 위해 이미지 기반 고함량 스크리닝을 수행합니다. 제브라피시 배아에서는 형질전환 수컷 및 야생형 암컷 제브라피쉬가 번식 케이지에서 짝짓기를 합니다. 수정란은 바닥에 떨어지고 수집되어 페트리 접시로 옮겨집니다. 배아는 하룻밤 동안 배양된 다음 96웰 둥근 바닥 플레이트의 개별 웰에 배치됩니다.

소분자 BCI를 추가하여 FGF 신호를 과도하게 활성화하고 플레이트를 6시간 동안 배양합니다. 각 의지의 이미지는 컨포칼 플레이트 리더로 캡처하고 특정 배아 구조에서 형광 강도를 보고하는 자체 설계 알고리즘을 사용하여 분석됩니다. 안녕하세요, 저는 피츠버그 대학교 미생물학 및 분자 유전학과의 마이클 장 박사 연구실의 히바 카도입니다.

안녕하세요, 저는 피츠버그 대학교 신약 개발 연구소(University of Pittsburgh Drug Discovery Institute)의 안드레아 스팍(Andrea Spock)입니다. 오늘 우리는 화학적 처리를 위해 얼룩말 물고기 배아를 번식, 선택 및 배열하는 절차를 보여 드리겠습니다. 96 웰 플레이트에서 우리는 유리 섬유 성장 인자 활성을 보고하고 과거 흰색을 과도하게 활성화하는 분자로 처리된 형질전환 배아를 사용할 것입니다.

당사는 High Content 스크리닝 방법론을 사용하여 형질전환 제브라 피쉬 배아에서 섬유아세포 성장 인자 활성을 자동으로 획득, 분석 및 정량화하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 절차에서는 형질전환 제브라 피쉬와 고처리량 화학 스크리닝을 활용하는 플랫폼 기술을 강조합니다. 시작하겠습니다.

치료 이틀 전에 동형접합 수컷 형질전환 제브라피시를 식별하고 개별 짝짓기 탱크에 넣습니다. 수조에 분리기를 추가한 다음 각 수조에 야생형 암컷 물고기를 추가하고 물고기를 섭씨 28도의 짝짓기 케이지에 밤새 두십시오. 다음날 아침, 분리기를 제거하십시오 1 시간 후 물고기를 새 수조로 옮기고 배아를 플라스틱 체에 붓습니다.

E 3 용액을 사용하여 배아를 100mm 접시에 옮기고 섭씨 28도에서 6-8시간 동안 배양합니다. 배양 후 실체 현미경으로 배아를 검사합니다. 실험에 적합한 배아는 가스를 투여할 예정이다.

이때 단세포 단계에 남아 있는 수정되지 않은 배아를 모두 제거합니다. 또한 불투명하거나 기형적으로 보이는 생존 불가능한 배아를 제거합니다. 그런 다음 새로운 E 3 용액을 넣고 섭씨 28도에서 밤새 배양합니다.

다음 날, 배아를 형광 실체 현미경 아래에 놓고 형질전환 배아를 유사한 단계와 균일한 상태로 분류합니다. GFP 발현 24 HPF 배아는 강렬한 GFP 발현과 GFP 양성 배쪽 망막을 가진 잘 형성된 눈을 가진 눈에 보이는 중간 뒷 뇌 경계를 보여줍니다. 이 배아는 활동적이며 플라스틱 목초지 피펫을 사용하여 코리온 안에서 움직이고 꿈틀거립니다.

24개의 HPF 배아를 한 번에 하나씩 96웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 마이크로 피펫을 사용하여 웰에서 과도한 E 3 용액을 제거합니다. 그런 다음 다중 채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 200마이크로리터의 E 3 용액을 추가합니다.

다음으로, 2마이크로리터의 DMSO를 열 1과 12의 모든 웰에 추가합니다. 그런 다음 다음과 같이 DMSO에서 제조된 2마이크로리터의 BCL, 즉 1마이크로몰을 2열과 7열에 추가합니다. 5 마이크로 몰은 3 및 8, 10 마이크로 몰은 4 및 9 20.

5열과 10열에 마이크로몰. 그리고 마지막으로 25 마이크로 몰을 6 열과 11 열로. 이제 알루미늄 호일로 플레이트를 덮고 섭씨 28도에서 6시간 동안 배양합니다.

각 웰에 10마이크로리터의 트리카를 첨가하여 30개의 HPF 배아를 마취합니다. 그런 다음 플레이트를 분자 장치 image express ultra open meta express 소프트웨어에 로드합니다. Forex 목표와 최대 핀홀 직경이 있는 구성을 선택하십시오.

레이저 자동 초점을 구성하여 플레이트 바닥을 감지하고 미리 결정된 최적의 Z 오프셋을 사용합니다. 관심 영역을 감지하려면 스캔 영역을 베닝 없이 2000 x 2000 픽셀의 단일 사이트로 설정합니다. 적절한 플레이트 유형과 525나노미터에서 488 방출 파장을 통해 여기에서 488 나노미터 아르곤 레이저를 선택하십시오.

그런 다음 차량 처리된 배아가 들어 있는 웰을 선택하고 샘플 찾기를 클릭합니다. 기기는 자동 초점 스캔을 수행하고 단일 이미지를 획득하여 적절한 이미지 획득을 확인합니다. 잘 처리된 차량을 무작위로 선택하고 이미지를 획득합니다.

이미지에 초점이 맞춰져 있고 머리에 GFP 발현이 나타나는 경우. 커서를 가장 밝은 영역 위에 놓고 형광 강도가 16비트 카메라 범위 내에 있는지 확인합니다. 65 미만, 000 단위.

다른 차량 제어 장치와 몇 개의 복합 처리된 우물에 대해 이 단계를 반복합니다. 필요한 경우 포지티브 컨트롤 이미지에서 가장 밝은 영역이 포화되지 않도록 레이저 출력과 게인을 조정합니다. 다음으로 Plate Acquisition and Control 창에서 Acquire plate를 선택하여 플레이트 스캔을 시작합니다.

기기는 전체 마이크로플레이트에 대해 웰당 하나의 이미지를 자동으로 획득하여 SQL 서버 데이터베이스에 보관합니다. 스캔이 완료되면 이미지를 D definition에 업로드합니다. 개발자는 slinger 옵션이 활성화된 개발자를 엽니다.

새 작업 영역을 만듭니다. 그런 다음 파일 메뉴에서 사용자 지정 가져오기를 선택합니다. 그런 다음 이미지가 포함된 폴더로 이동하여 샘플 파일을 엽니다.

molecular devices image express ultra 플랫폼에서 생성된 이미지 형식 및 파일 구조를 인식하는 가져오기 필터를 선택합니다. 이제 이미지를 처리하려면 제어 이미지를 열고 원하는 인지 네트워크 기술 또는 CNT 알고리즘 또는 규칙 세트를 로드합니다. 여기에 사용된 사용자 정의 알고리즘은 배아, 난황자 및 머리를 자동으로 식별하고 머리 구조를 표현하는 GFP의 밝기와 면적을 정량화하고 머리 및 난황 감지 단계로 설정된 규칙을 실행하도록 설계되었습니다.

노른자 자루와 머리가 적절하게 할당되도록 하려면 노른자가 너무 크거나 너무 작은 경우 노른자 감지 임계값을 조정하도록 규칙 집합을 수정합니다. 다음으로, 밝은 머리 구조 감지 단계로 설정된 규칙을 실행합니다. 머리에서 GFP 발현 영역의 적절한 할당을 보장하려면 밝은 머리 구조의 감지가 시각적 관찰과 일치할 때까지 머리 구조 감지 임계값을 사소한 강도의 배수로 조정하도록 규칙 세트를 수정합니다.

다음으로, 비히클 처리된 배아에서 생성된 무작위로 선택된 여러 이미지와 PCI 처리된 배아의 양성 대조군 이미지에 대해 전체 규칙 세트를 수동으로 실행합니다. 모든 플레이트 이미지에서 알고리즘을 실행하려면 분석할 플레이트를 선택하고 선택합니다. 분석한 다음 최적화된 규칙 집합으로 이동하여 모든 웰을 분석합니다.

통합 작업 스케줄러를 사용하면 빈 웰 또는 모호한 이미지가 스캔 중에 분석에서 자동으로 제외됩니다. 지속적으로 업데이트되는 keep 맵이 표시됩니다. 데이터와 이미지 모두 육안 검사를 위해 실행하는 동안 액세스할 수 있습니다.

수치 데이터와 처리된 이미지는 자동으로 저장됩니다. 모든 이미지를 분석한 후 데이터를 Excel, GraphPad 또는 prism과 같은 타사 소프트웨어로 내보낼 수 있습니다. 이 그림은 CNT 분석을 유무에 관계없이 잘 처리된 BCI와 처리된 차량에서 보관된 스캔 이미지를 보여줍니다.

적용된 녹색 형광 단백질 또는 GFP는 형질전환 배아의 눈, 중간 뒷뇌 경계 및 삼차신경절에서 검출됩니다. GFP intensity와 expression domain이 모두 확장됩니다. 여기에서 BCI로 처리된 배아에서는 형질전환 배아에서 GFP 리포터 유전자 발현에 대한 BCI의 용량 의존적 효과가 관찰됩니다.

절반의 최대 반응 또는 EC 50을 유도하는 데 필요한 농도는 약 12마이크로몰이었습니다. 우리는 방금 형질전환 얼룩말 물고기 배아를 96개의 웰 플레이트로 번식, 수집 및 배열하는 방법을 보여드렸습니다. 우리는 신호 전달 경로의 자체 활성제에서 PCI의 농도 증가를 추가했습니다.

또한 형질전환 배아의 이미징을 자동화하는 방법을 보여주었으며 인지 네트워크 기술을 기반으로 한 맞춤형 설계 알고리즘으로 이미지를 분석했습니다. 이 접근법을 통해 섬유아세포 성장 인자 신호전달의 소분자 활성화제의 효과를 등급화된 방식으로 정량적으로 측정할 수 있었습니다. 이 절차를 수행할 때 표본 간의 변동성을 최소화하기 위해 배아를 신중하게 선택해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

그거에요. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.