유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

이 절차의 전반적인 목표는 유전자 발현을 연구하기 위해 전기천공법을 사용하여 transfection이 어려운 세포에 siRNA를 도입하는 것입니다. 이는 먼저 TC 10을 사용하여 필요한 awa cell 현탁액의 양을 결정함으로써 수행됩니다. 그런 다음 자동화된 세포 계수기 irna를 세포 현탁액에 추가하고 세포를 전기적으로 생성합니다.

MXL electroporation 시스템을 사용하여 electroporation 후 24시간 동안 셀을 배양합니다. 그런 다음 IL 4를 첨가하여 실험 세포에서 유전자 전사를 유도합니다. 마지막으로 RNA를 추출하고 Real-Time PCR을 사용하여 유전자 발현 수준을 측정합니다.

궁극적으로 유전자 발현 경로에 대한 특정 siRNA의 효과를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Bio Rad Laboratories의 유전자 발현 부서의 선임 과학자인 Adam McCoy입니다. 오늘은 전기천공법(electroporation)을 통해 transfection이 어려운 세포주에 RNA를 도입하는 절차를 보여드리고, 유전자 발현에 미치는 영향을 살펴보겠습니다.

우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 단일 유전자의 유전자 발현을 분석하거나 하나의 유전자를 knockout하고 다운스트림 효과를 찾아 유전자 경로를 연구합니다. 시작하겠습니다. 세포 배양 후드 아래에서 작업하여 배양 플라스크에서 세포를 제거합니다.

이 프로토콜에 사용되는 세포는 현탁 세포입니다. 부착 세포를 사용하는 경우 제거하기 전에 눈을 트립신해야 합니다. 세포를 원심분리하여 펠릿

세포가 스핀 다운된 후 상층액을 제거하고 PBS에서 세포를 다시 현탁시킵니다. 살아 있는 세포의 수를 측정하려면 세포 현탁액의 분취액을 취하고 1:1의 비율로 트리안 블루 염색을 추가하여 죽은 세포를 염색합니다. Trian blue는 살아있는 사각 세포 평가에 필요하지만 총 세포 수에는 필요하지 않습니다.

혼합물을 일회용 계수 슬라이드의 입구에 파이프로 연결하고 TC 10 자동 셀 카운터에 삽입하십시오. TC 10은 가장 정확한 계수를 보장하기 위해 먼저 자동 초점을 맞춘 다음 세포 계수를 시작합니다. 샘플의 밀리리터당 살아있는 세포와 총 세포의 수가 표시됩니다.

보기 화면에 셀을 표시하려면 보기 이미지를 선택합니다. 그런 다음 위쪽 또는 아래쪽 화살표를 사용합니다. 필요에 따라 확대 또는 축소하여 실험에 필요한 세포 현탁액의 양을 계산하고 희석 계산기를 선택합니다.

이 실험에 대해 원하는 농도 및 최종 부피 값을 입력합니다. 각 처리에 대한 중복을 포함하여 총 16개의 샘플이 준비됩니다. 따라서 총 3.6 밀리리터의 5 곱하기 10 밀리리터 현탁액 6 개 중 하나가 필요합니다.

그런 다음 세포 계수기는 살아있는 세포 수와 입력된 목표 값을 기반으로 필요한 세포 현탁액의 부피를 보고합니다. TRIAM blue를 사용한 경우 카운터는 사용된 일대일 희석액에 맞게 자동으로 조정됩니다. 이제 후드 아래에서 계산된 세포 현탁액 부피를 새 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 세포가 회전하는 동안 세포 혼합물을 회전시켜 세포를 펠릿화합니다. 각 튜브에 SIR A를 추가하여 electroporation을 위한 마이크로 fuge 튜브를 준비합니다. 이 실험을 위해 one control irna two stat six specific siRNA와 절제되지 않은 대조군을 준비합니다.원심분리 후 PBS를 제거하고 3.6ml의 유전자 Pulser electroporation buffer에 있는 세포를 재현탁하여 800μl 분취액을 적절한 IRNA를 포함하는 튜브로 전달하고 부드럽게 혼합합니다.

이제 세포는 모든 샘플을 동시에 섭취하기 위해 전기천공법을 사용할 준비가 되었습니다. MXL electroporation 체계를 사용하여 96의 좋은 electroporation 판의 적합한 well로 각 세포 현탁액의 150 microliter를 옮깁니다. 다음으로, 플레이트를 MXL electroporation 시스템의 플레이트 챔버에 넣고 뚜껑을 닫습니다.

원한 electroporation 의정서를 선정하고 electroporation가 완료된 후에 세포를 먹기 위하여 맥박을 누르고, 계기에서 판을 제거하고 매체에 prewarm를 포함하는 새로운 조직 배양 판으로 세포를 옮기십시오. 다음으로, 각 샘플에 대해 150마이크로리터의 비정격 대조 셀을 새 접시로 옮깁니다. 그런 다음 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 하룻밤 동안 놓습니다.

24시간 후, IL 4를 사용하여 한 세트의 세포에서 유전자 전사를 유도하고 두 번째 세트에만 배지를 추가합니다. 하나의 IL 4가 세포에 추가됩니다. 총 48시간의 성장 후 섭씨 37도에서 24시간 더 배양하고 5% 이산화탄소를 배양합니다.

실험적 치료가 세포 분열에 영향을 미치는 경우 세포 밀도에 큰 차이가 있을 수 있습니다. 따라서 TC 10 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수에 따라 세포를 다시 빠르게 계수하는 것이 좋습니다. RNA 추출 및 동결을 위해 각 웰에서 하나의 부분 표본을 마이크로 fuge 튜브로 옮깁니다.

웨스턴 블로팅(western blotting) 또는 기타 단백질 분석을 위한 두 번째 부분 표본. 오늘은 RNA 워크플로우만 표시됩니다. 세포를 펠릿화하기 위해 샘플을 원심분리하십시오.

그런 다음 각 튜브에서 SUP 나틴을 제거하고 버립니다. orum total RNA kit를 사용하여 RNA 추출을 진행합니다. RNA가 추출되면 즉시 분석을 진행하고 샘플을 얼음 위에 두십시오.

한 단계에서 RNA의 품질과 수량을 검증하려면 Experian 자동 전기영동 스테이션을 사용하여 샘플과 Experian RNA ladder를 열 변성시키고 얼음 위에 놓습니다. 준비된 젤과 얼룩 혼합물을 프라이밍에 첨가하십시오. RNA 칩에서 프라이밍 스테이션에 프라이밍 코드를 설정합니다.

자동 프라이밍 스테이션에 칩을 놓고 시작을 누릅니다. 프라이밍 스테이션에서 칩을 제거하고 칩을 로드합니다. Vortex: 칩을 로딩 버퍼와 샘플을 혼합합니다.

칩을 전기영동 스테이션에 넣고 실행을 시작합니다. Experian 소프트웨어는 전기표, RNA 농도 리보솜 비율을 표시하는 결과 표, RNA 품질 지표 번호 및 기존 RNA 겔과 유사한 가상 겔의 형태로 결과를 자동으로 표시합니다. 고품질의 총 RNA 샘플은 일반적으로 8에서 10의 RQI를 갖습니다.

RNA 품질을 검증한 후 여기에서 CD NA 반응을 준비합니다. IS 스크립트 ONEstep R-T-P-C-R 믹스는 CD NA 합성과 Real-Time PCR을 결합하는 데 사용됩니다. 하나의 반응에서, 각 프라이머 세트에 대한 RNA 주형을 제외한 모든 반응 성분을 포함하는 마스터 믹스를 만듭니다.

그런 다음 혼합물을 PCR 플레이트의 웰에 분배합니다. RNA를 균일한 농도로 희석한 후 샘플을 적절한 웰에 추가하고 세 배로 만듭니다. 플레이트를 밀봉하고 realtime PCR 기계에 넣은 다음 적절한 프로토콜을 선택하고 실행이 완료되면 실행을 시작하고 실시간 추적을 사용하여 발현 수준을 결정합니다.

이 소프트웨어는 처리 및 대조 세포에서 실험 유전자와 참조 유전자의 상대적 발현을 기반으로 데이터에서 정규화된 유전자 발현을 계산합니다. 이 그림은 IL 4의 수용체에 대한 IL 4 신호 전달 경로 결합의 개요를 보여줍니다. STAT 6의 분열 및 활성화로 이어지고, 활성화된 STAT 6은 핵으로 전위되어 표적의 전사를 활성화합니다.

CCL 17의 IL 4 유도 전사가 없는 CCL 17과 같은 유전자는 STAT 6 유전자의 irna 매개 침묵 후에도 낮은 구성 수준으로 유지됩니다. IL 4로 치료하면 CCL 17 발현이 거의 또는 전혀 증가하지 않아야 합니다. IL 4에 의한 CCL 17의 유도는 정량적 실시간에 의해 다양한 조건에서 측정되었습니다.

IL 4 없이 성장한 PCR 샘플은 낮은 구성적 발현 수준을 가졌습니다. sir에 관계없이, 녹색과 청색 대조군 샘플에서 나타난 바와 같이 전달된 A는 CCL 17의 8배에서 10배 유도와 함께 IL 4 치료에 정상적으로 반응했다. 그러나 빨간색과 분홍색으로 표시된 STAT 6을 표적으로 하는 siRNA로 transfection된 세포는 IL 4에 대한 반응으로 CCL L 17 발현이 감소하여 STAT 6이 CCL 17의 IL 4 유도 발현에 중요한 역할을 한다는 생각을 뒷받침했습니다.

지금까지 siRNA를 transfection이 어려운 현탁 세포주에 삽입하는 방법과 해당 세포에서 유전자 발현을 추적하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 모든 샘플에서 가능한 한 일관성을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.