유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

이 절차의 전반적인 목표는 전기천공법(electroporation)을 사용하여 형질전환이 어려운 세포에 siRNA를 도입함으로써 유전자 발현을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 TC 10 자동 세포 계수기를 사용하여 필요한 세포 현탁액의 양을 결정한 후, 세포 현탁액에 siRNA를 첨가하고 세포를 전기천공함으로써 수행됩니다.

MXL 전기천공 시스템을 사용하여 세포를 전기천공 후 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 실험군 세포의 유전자 전사를 유도하기 위해 IL-4를 첨가합니다. 마지막으로 RNA를 추출하고 실시간 PCR을 사용하여 유전자 발현 수준을 측정합니다.

최종적으로, 특정 siRNA가 유전자 발현 경로에 미치는 영향을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, Bio Rad Laboratories 유전자 발현 부문의 수석 과학자 Adam McCoy입니다. 오늘은 전기천공법을 이용하여 형질전환이 어려운 세포주에 RNA를 도입하는 절차를 보여드리고, 이후 유전자 발현에 미치는 영향을 살펴보겠습니다.

본 연구실에서는 단일 유전자의 발현을 분석하거나, 특정 유전자를 녹아웃시켜 하위 효과를 관찰함으로써 유전자 경로를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 세포 배양 후드 내에서 배양 플라스크로부터 세포를 제거하십시오.

본 프로토콜에서 사용되는 세포는 부유 세포입니다. 부착 세포를 사용하는 경우, 세포를 제거하기 전에 트립신 처리를 해야 합니다. 세포를 원심 분리하여 펠렛으로 만듭니다.

세포를 원심 분리한 후, 상층액을 제거하고 세포를 PBS에 재부유시킵니다. 살아있는 세포 수를 결정하기 위해, 세포 현탁액의 일부를 취하고 죽은 세포를 염색하기 위해 트라이판 블루(trypan blue) 염색약을 1:1 비율로 첨가합니다. 트라이판 블루는 생존 세포 평가에는 필요하지만, 총 세포 수 측정에는 필요하지 않습니다.

혼합액을 일회용 카운팅 슬라이드의 개구부에 파이펫팅한 후, 이를 TC 10 자동 세포 계수기에 삽입합니다. TC 10은 가장 정확한 계수를 보장하기 위해 먼저 자동 초점을 맞춘 후 세포 계수를 시작합니다. 샘플 내 밀리리터당 살아있는 세포 수와 총 세포 수가 표시됩니다.

뷰 이미지(view image)를 선택하여 뷰 화면에 세포를 표시합니다. 그다음 위 또는 아래 화살표를 사용합니다. 실험에 필요한 세포 현탁액의 양을 계산하기 위해 필요에 따라 확대 또는 축소한 후, 희석 계산기(dilution calculator)를 선택합니다.

본 실험에 필요한 희망 농도와 최종 부피 값을 입력하십시오. 각 처리군당 반복 실험을 포함하여 총 16개의 샘플이 준비됩니다. 따라서 5 × 10⁶ cells/mL 농도의 현탁액이 총 3.6 milliliters 필요합니다.

그러면 세포 계수기가 생존 세포 수와 입력한 목표 값을 기반으로 필요한 세포 현탁액의 부피를 알려줍니다. TRIAM blue를 사용한 경우, 계수기가 사용된 1:1 희석 비율을 자동으로 조정합니다. 이제 클린 벤치 내에서 계산된 부피의 세포 현탁액을 새 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 세포 혼합물을 원심 분리하여 세포를 펠렛화합니다. 각 튜브에 SIR A를 첨가하여 전기천공법용 마이크로 원심 분리 튜브를 준비합니다. 본 실험에서는 하나의 대조군 siRNA, 두 개의 stat six 특이적 siRNA 및 비절제 대조군을 준비합니다. 원심 분리 후, PBS를 제거하고 3.6 milliliters의 gene Pulser 전기천공 버퍼에 세포를 재부유시킵니다. 적절한 IRNA가 포함된 튜브에 800 microliter씩 분주한 후 부드럽게 혼합합니다.

이제 모든 샘플을 동시에 처리하기 위해 세포의 전기천공법 준비가 완료되었습니다. MXL 전기천공 시스템을 사용하여 각 세포 현탁액 150 µL를 96-웰 전기천공 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 다음으로, 플레이트를 MXL 전기천공 시스템의 플레이트 챔버에 넣고 덮개를 닫습니다.

원하는 전기천공 프로토콜을 선택하고 펄스 버튼을 눌러 세포를 처리합니다. 전기천공이 완료되면 장비에서 플레이트를 꺼내 예열된 배지가 담긴 새로운 조직 배양 플레이트로 세포를 옮깁니다. 다음으로, 각 샘플당 150 µL의 비처리 대조군 세포를 새로운 디쉬로 옮깁니다. 그 후 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.

24시간 후, 한 세트의 세포에는 IL four를 사용하여 유전자 전사를 유도하고, 다른 세트에는 배지만 추가합니다. 세포에 IL four를 1개 추가합니다. 총 48시간의 배양 후, 37 °C 및 5% carbon dioxide 조건에서 24시간 동안 추가로 배양합니다.

실험적 처리가 세포 분열에 영향을 미치는 경우 세포 밀도에 큰 차이가 있을 수 있습니다. 따라서 TC 10 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 빠르게 다시 측정하는 것이 좋습니다. RNA 추출을 위해 각 웰에서 한 분주량을 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후 냉동 보관하십시오.

웨스턴 블로팅 또는 기타 단백질 분석을 위한 두 번째 분주액입니다. 오늘은 RNA 워크플로만 보여드립니다. 샘플을 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.

그 다음 각 튜브에서 상층액을 제거하여 폐기합니다. orum total RNA kit를 사용하여 RNA 추출을 진행합니다. RNA 추출이 완료되면 샘플을 얼음 위에 보관하며 즉시 분석을 진행하십시오.

한 단계로 RNA의 품질과 양을 확인하려면, Experian 자동 전기영동 시스템을 사용하여 샘플과 Experian RNA 래더를 열 변성시킨 후 얼음에 놓으십시오. 젤과 염색약의 준비된 혼합물을 RNA 칩의 프라이밍 웰에 추가하고, 프라이밍 스테이션에서 프라이밍 코드를 설정하십시오.

칩을 자동 프라이밍 스테이션에 넣고 시작 버튼을 누릅니다. 프라이밍 스테이션에서 칩을 꺼내 로딩합니다. 칩을 볼텍싱하여 샘플과 로딩 버퍼를 혼합합니다.

칩을 전기영동 스테이션에 넣고 분석을 시작합니다. Experian 소프트웨어는 결과를 전기영동도(electropherogram), RNA 농도와 리보솜 비율이 표시된 결과 테이블, RNA 품질 지수(RQI) 수치, 그리고 전통적인 RNA 젤과 유사한 가상 젤 형태로 자동 표시합니다. 고품질의 총 RNA 샘플은 일반적으로 8에서 10 사이의 RQI 값을 갖습니다.

RNA 품질을 확인한 후, cDNA 합성 반응을 준비합니다. cDNA 합성 및 실시간 PCR을 결합하기 위해 IS script ONEstep R-T-P-C-R mix를 사용합니다. 각 프라이머 세트에 대해 RNA 템플릿을 제외한 모든 반응 성분을 포함하는 마스터 믹스를 한 번에 조제합니다.

그 다음 혼합물을 PCR 플레이트의 웰에 분배합니다. RNA를 균일한 농도로 희석한 후, 해당 샘플을 적절한 웰에 3반복으로 첨가합니다. 플레이트를 밀봉하여 실시간 PCR 기기에 넣고, 적절한 프로토콜을 선택하여 실행합니다. 실행이 완료되면 실시간 트레이스를 사용하여 발현 수준을 결정합니다.

소프트웨어는 처리된 세포와 대조군 세포에서의 실험 유전자 및 참조 유전자의 상대적 발현량을 기반으로 데이터로부터 정규화된 유전자 발현량을 계산합니다. 이 그림은 IL 4 신호 전달 경로의 개요를 보여주며, IL 4가 그 수용체에 결합하면 STAT 6의 이량체화 및 활성화가 유도됩니다. 활성화된 STAT 6는 핵으로 이동하여 표적 유전자의 전사를 활성화합니다.

IL-4 유도가 없는 경우 CCL 17과 같은 유전자의 전사는 STAT6 유전자의 siRNA 매개 사이런싱 후에도 낮은 구성적 수준으로 유지될 것입니다. IL-4 처리 시 CCL 17 발현의 증가는 거의 없거나 전혀 나타나지 않아야 합니다. IL-4에 의한 CCL 17의 유도는 정량적 실시간 PCR을 통해 다양한 조건에서 측정되었습니다.

IL-4 없이 배양된 PCR 샘플은 낮은 수준의 구성적 발현을 보였습니다. siRNA의 종류와 관계없이, 녹색과 파란색으로 표시된 대조군 샘플은 IL-4 처리 시 CCL17이 8~10배 유도되며 정상적으로 반응했습니다. 그러나 빨간색과 분홍색으로 표시된 STAT6 표적 siRNA가 형질전환된 세포는 IL-4에 반응하여 CCL17 발현이 감소하였으며, 이는 STAT6가 IL-4 유도 CCL17 발현에 역할을 한다는 가설을 뒷받침합니다.

지금까지 형질전환이 어려운 부유 세포주에 siRNA를 도입하는 방법과 해당 세포에서 유전자 발현을 추적하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 샘플 간의 일관성을 최대한 유지하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 설명을 마칩니다.

시청해주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.