구조 질량 분광법에 의해 큰 단백질 단지 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 구조 질량 분석법을 사용하여 큰 단백질 어셈블리를 특성화하는 것입니다. 이는 나노 흐름 전기 분무 이온화를 위해 금도금 모세관을 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 샘플이 준비되고 고질량 측정을 위해 질량 분석기가 교정됩니다.

다음으로, 기체 상태에서 단백질 복합체를 그대로 유지하기 위해 실험 조건을 최적화합니다. 그런 다음 MS 및 탠덤 Ms.Spectra를 획득합니다. MS Spectra는 온전한 복합체에 해당하는 질량 전하 상태를 보여주었으며 탠덤 MS 실험에서는 단량체와 벗겨진 복합체의 결합 패턴을 생성했습니다.

안녕하세요, 저는 Whiteman Institute of Science의 Miron 실험실에서 온 Naam Kiba이고, 저는 Michelon의 실험실에서 온 Isaac Ky입니다. 오늘 우리는 구조 분광법을 적용하여 큰 단백질 복합체를 분석하는 기본 절차를 보여 드리고자하며, 실험실에서이 절차를 사용하여 단백질 복합체를 특성화하고 스톡 기하학, 구성 및 상호 작용 네트워크를 정의합니다. 시작하겠습니다.

비전류 결합 단백질 복합체의 분석은 EMME Plus 또는 qua capillaries를 사용하여 공기 분무 면역 기술로 수행됩니다. 이 모세관 C는 약 1미크론 직경의 미세한 팁으로 당긴 다음 금과 같은 물질을 전도하여 코팅할 수 있습니다. 이 모세혈관은 여기에서 볼 수 있듯이 상업적으로 이용 가능합니다.

그러나 사용하는 것이 훨씬 더 비용 효율적입니다. 냉각될 수 있고 바로 사용할 수 있는 상태 냉각으로 코팅될 수 있는 유리 모세관은 이 니들 풀링 장치에서 수행되고 이 eh 코팅 장치에 코팅됩니다. 이 절차를 시작하려면 양면 접착 패드 스트립 두 개를 페트리 접시 바닥에 부착하고 스트립을 2cm 간격으로 유지합니다.

패드 중 하나의 중앙에 유리 막대를 놓습니다. 접착 패드는 모세혈관을 제자리에 고정하고 유리 막대는 준비된 모세혈관을 지지하고 모세혈관의 팁이 파손되지 않도록 합니다. 외경이 1mm, 직경이 0.78mm인 Boris 규산염 유리 모세관을 사용했습니다.

모세관 하나를 바늘에 삽입하고 모세관을 제자리에 부드럽게 뭉친 다음 가열 필라멘트의 중앙에 놓이도록 위치를 조정합니다. cl을 조입니다.amp모세관이 양쪽 끝에서 단단히 고정될 때까지 s를 부드럽게 조입니다. 여기에 표시된 사전 정의된 프로그램을 사용하여 모세관을 당깁니다.

그러나 풀러를 프로그래밍하는 과정은 시행착오 중 하나임을 기억하십시오. 허용 가능한 팁 모양이 얻어질 때까지 당겨진 모든 모세관은 두 개의 최종 모양의 모세관을 생성합니다. 기기에서 당겨진 모세관을 제거하고 팁을 검사하여 변형되거나 파손된 모세관은 버리십시오.

무딘 포지셔닝 핀셋을 사용하여 페트리 접시에 모세혈관을 놓습니다. 접착 패드에 부착된 모세혈관의 바닥과 윗부분은 끝이 위를 향하도록 유리 막대에 기대어 있습니다. 페트리 접시가 가득 찰 때까지 모세혈관을 계속 당깁니다.

직경 10cm의 접시에 약 80개의 모세혈관이 들어갑니다. 다음으로 모세혈관을 금으로 코팅합니다. 골드 스퍼터 코트에 플레이트를 삽입합니다.

가스 공급이 제조업체의 지침에 따라 선택되었는지 확인하고 사전 정의된 코팅 주기를 활성화하십시오. 코팅은 모세혈관이 고르게 황금색이 될 때까지 3-6회 반복합니다. 모세혈관이 준비되면 질량분석기 보정을 진행합니다.

MultiPro 복합체에서 수행되는 대부분의 실험은 이와 같이 al Electrospray 4배 비행 시간 질량 분석기에 의해 수행됩니다. 높은 질량을 위해 수정 된 물에서 Inupt. 단백질 샘플을 로드하기 전에 요오드화 세슘을 사용하여 질량 분석기를 보정합니다.

먼저 정제수에 100mg/ml의 세슘 용액을 준비하며, 세슘은 고질량 보정에 사용됩니다. 단 하나 위탁된 소금 송이가 393의 돛대에서 10, 000 이상 우정에 책임 비율에 넓은 질량 범위에 확장하기 때문에. 뭉툭한 핀셋을 사용하여 페트리 접시에서 코팅된 모세관을 취하고 2마이크로리터의 세슘 용액을 모세관에 로드합니다.

einor 젤이 적재 된 팁을 사용합니다. 용액을 모세관 끝 쪽으로 수동으로 또는 스핀 다운 어댑터를 사용하여 밉니다. 모세관을 모세관에 삽입하고 팁이 홀더 가장자리에서 약 10mm 떨어지도록 모세관을 조정합니다.

모세관을 광학 현미경 아래에 놓고 날카로운 AA 유형 핀셋을 사용하여 팁을 다듬습니다. 모세관 내에 흐름을 차단할 수 있는 기포가 없는지, 모세관이 막히지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다. 또한 모세혈관에서 금 코팅이 벗겨지지 않았는지 확인하십시오.

그렇다면 모세관을 교체하거나 팁을 다듬고 코팅되지 않은 부분을 제거하십시오. 다음으로, 모세관 홀더를 nano flow ESI 인터페이스에 연결합니다. XY, Z 스테이지를 뒤로 회전하여 모세관 손상을 방지하고 스테이지를 활성화 위치로 밀어 넣습니다.

모세관은 원뿔 오리피스에서 1-10mm 거리에 배치해야 합니다. 스프레이가 시작될 때까지 모세관 전압과 낮은 나노 흐름 압력을 가합니다. 그런 다음 나노 유량 압력을 최소값으로 줄이십시오.

XYZ 스테이지의 위치, 모세관 전압, 나노 흐름 압력 및 디스 용매 가스 흐름을 조정하여 신호 강도를 최적화합니다. 시즌 피크 시리즈의 넓은 질량 범위를 감지하려면 가속 전압을 최적화해야 합니다. 여기에 사용된 매개변수는 모세관 1.3 - 1.7 킬로볼트, 샘플 콘 80 - 150 볼트, 추출 원뿔, 부드러운 담염 조건이 필요한 고질량 이온의 전달을 최적화하기 위한 1 - 3 볼트입니다.

배킹 압력은 소스와 분석기 사이의 초기 진공 단계에서 5-6mbar로 증가합니다. 배압 압력을 높이려면 차단 밸브를 부분적으로 닫아 스크롤 펌프에 대한 소스 진공 라인의 전도도를 조심스럽게 줄이면서 신호 강도에 대한 영향을 모니터링하십시오. 질량 분서계를 완전히 설정할 때, 1000에서 15, 000 사이의 마스터 전하 비율 범위에서 초당 한 번의 스캔으로 약 30 스캔을 수집하여 획득 후 적절한 보정 테이블을 사용하여 비행 시간을 보정합니다.

이제 보정이 완료되었으므로 단백질 샘플을 로드할 수 있습니다. 시료는 질량 분석기를 교정하기 전에 준비되며 낮은 마이크로몰 농도가 필요합니다. 필요한 경우 원심 한외 여과 장치를 사용하여 샘플을 농축합니다.

사용하기 전에 단백질 복합체가 장치 멤브레인에 흡수되지 않는지 확인하십시오. 부피 및 UV 흡광도를 확인하면 휘발성 용액만 NESI에 사용될 수 있으며, 이로 인해 버퍼 교환이 필요한 경우가 많습니다. 마이크로 원심분리기 겔 여과 칼럼은 염, 완충 분자 또는 기타 비휘발성 부가물의 모든 흔적을 제거하는 데 사용할 수 있습니다.

대신 샘플을 일시 중단합니다. 수성 암모늄 아세테이트 용액. 이 중요한 단계는 스펙트럼의 품질을 결정합니다.

최대 교환이 이루어질 때까지 장치당 1.3배 미만인 최소 희석으로 버퍼 교환을 최대 3회 반복합니다. 농축 및 완충액 교환이 모두 필요한 경우, 이 섹션의 시작 부분에 표시된 것처럼 원심 한외 여과를 사용하여 함께 수행할 수 있습니다. 다음으로, 요오드화 세슘 보정을 위해 표시된 대로 샘플을 로드하고 스프레이를 시작합니다.

신호가 감지될 때까지 스프레이의 초기 최적화부터 시작합니다. 표시된 평균 전하 상태에 대한 방정식을 사용하며, 여기서 M은 복합체의 질량입니다. 그러나 Daltons에서 전하 상태의 정확한 위치는 단백질에 따라 다릅니다.

복잡한 해리를 방지하려면 철분원을 가열하지 마십시오. 히터를 끄거나 온도를 섭씨 40도 이하로 유지하십시오. 모세관 위치, 샘플 원뿔 및 추출기 전압을 변경합니다.

철 투과를 최대화하기 위해 가능한 시작점은 원뿔 전압, 100V 추출기 원뿔, 1V 및 모세관 전압 1.5kW입니다. 스펙트럼의 결과 변화를 확인합니다. 이러한 파라미터를 나노 유동 압력과 함께 최적화하여 신화를 개선하고 잔류 수분 및 완충 성분을 제거합니다.

충돌 셀의 가스 압력에서 바이어스 전압을 높입니다. 일반적인 바이어스 전압은 10-100V 범위 내에 있으며 트랩 가스 흐름은 분당 1-10밀리리터입니다. 이 작업을 신중하게 수행하여 복합체의 연관을 방지하고 트랩을 조정하며 충돌 에너지를 전달하십시오.

종종 일반적으로 10-30 볼트 범위 내의 더 높은 전압은 높은 질량의 이온을 전송하는 데 필요합니다. 이 시점에서는 다음과 같이 복합체의 충돌로 인한 해리를 피하는 것이 중요합니다. 안정적인 신호에 도달한 후에는 안정적인 분무를 유지하면서 나노 유량 압력과 모세관 전압을 최소값으로 낮출 것을 권장했습니다.

여러 스캔을 수집한 후 탠덤 질량 분석법으로 복합체의 구성 요소를 식별하십시오. 단백질 복합체에 대한 최적의 안정적인 신호를 얻으면 격리 폭의 질량 중심을 설정하는 전구체 이온을 선택합니다. 일반적으로 12의 낮은 질량 분해능과 13 내지 15 사이의 높은 질량 분해능은 넓은 질량 범위를 사용하여 고질량 저전하 해리 생성물을 검출한 다음 이를 원하는 값으로 감소시켜 ms를 수행합니다.

MS는 전구체인 철을 해리함으로써 충돌 에너지, 약칭 CE를 증가시키고 충돌 셀에 대한 압력을 10-20 볼트의 단계로 점진적으로 트랩 또는 전송 CE를 증가시키고 충돌 가스 압력을 분당 0-5 밀리리터로 상승시킵니다. 최적의 활성화 조건에 도달할 때까지 스펙트럼의 변화를 모니터링합니다. 높은 활성화 에너지는 온전한 복합체에서 하나 이상의 소단위체의 해리를 유도하고 다른 소단위의 상호 작용 친화도를 명확히 할 수 있습니다.

ms MS 분석을 위해 두 개 이상의 충전을 선택합니다. 구성 요소가 중복되는 경우, 탠덤 MS Spectra 세트를 획득하면 서로 다른 집단의 전하 시리즈를 해결하는 데 도움이 됩니다. 더욱이, 높은 전하 상태는 낮은 전하 상태가 MS와 MS를 중첩하는 것에 비해 더 쉽게 해리됩니다.

Ms spectra는 선택한 전구체 ion의 분리를 검증합니다. MS와 MS에 의한 온전한 복합체의 특성화 외에도 MS는 온화한 변성 조건에서 더 작은 하위 복합체와 용액을 생성하고 이들도 특성화합니다.

서브 복합체의 MS 및 ms MS 분석은 서브 유닛 서브 유닛 상호 작용의 부분적 파괴를 위한 복합체의 서브 유닛 아키텍처를 정의하기 위한 기초를 형성하며, 유기 용매를 점진적으로 첨가하여 50% 농도까지 추가하거나 암모니아 또는 포름산을 4% 농도까지 첨가하여 용액의 pH를 변경합니다. 복합체를 구성하는 개별 소단위의 질량을 결정하려면 변성 조건에서 스펙트럼을 획득하는 것이 중요합니다. 이는 25-75 물 아세토 니트릴 비율과 1% 포름산을 엘루시안 용매로 사용하는 지퍼 팁 C 4를 사용하여 수집된 모든 데이터와 함께 수행하고 함께 제공되는 서면 프로토콜에 자세히 설명된 대로 결과를 분석하고 분석할 수 있습니다. 단백질 복합체 샘플을 로드하기 전에 질량 분석기는 요오드화 세슘을 사용하여 보정했습니다.

빨간색으로 표시된 일련의 동일한 간격의 피크는 393의 마스터 충전 비율에서 10,000을 훨씬 넘는 광범위한 범위로 확장됩니다. 그들은 세슘 플러스 복합체의 일반적인 구성의 소금 클러스터를 단독으로 충전하는 데 할당됩니다. 검은색으로 표시된 주요 피크 사이의 추가 신호는 계열 세슘 2 플러스 복합체와 세슘 3 플러스 복합체의 이중 및 삼중 전하 종에 의해 발생합니다.

초기 진공 단계에서 압력을 높이는 것은 높은 질량의 클러스터를 감지하는 데 필수적입니다. 높은 질량 피크에 대한 압력의 영향은 여기에서 1.2 및 5.3 밀리바의 압력 판독 백으로 입증되었습니다. 더 높은 압력에 대한 질량 스펙트럼이 여기에 확장된 것으로 표시됩니다.

다음은 3000과 5, 000 마스터 전하 비율 사이의 전하 상태 분포를 발생시키는 렉틴 변이체 복합체의 질량 분석법의 예입니다. 그러나 이온의 적절한 담수로 인해 피크가 넓습니다. 바이어스 전압을 4V에서 15V로 증가시키면 가속 조건이 증가하고, 잔류 수분과 완충 성분이 제거되어 고분해능 스펙트럼이 생성되며, 측정된 질량은 펜타메릭 복합체에 해당합니다.

그런 다음 탠덤 MS 분석을 위해 플러스 15 전하 상태를 선택했습니다. 충돌 에너지에 있는 증가는 1, 664의 주된 책임 비율에 중심 높게 위탁된 단위체의 방출 및 5, 000에서 8의 000의 질량 책임 비율의 범위에 있는 벗겨진 사량체 복합체의 방출을 일으키는 원인이 됩니다. 렉틴 변이체 복합체는 또한 복합체 결합으로 이어지는 변성 조건에서 검사되었습니다.

이러한 방식으로, 복합체를 구성하는 개별 소단위체의 정확한 질량을 결정할 수 있습니다. 우리는 방금 고질량 이온의 MS와 Tandem Ms Spectra를 획득하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 시료를 적절하게 준비하고 질량 분석법과 호환되는 휘발성 버퍼만 사용하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.