Name: Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-06T19:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 학습하세요 방사선 생물학에서 γH2AX 포커 정량화를 통한 DNA 이중가닥 파손 측정 방법을 인간 세포에서 면역형광 분석을 활용하여 방사선 감수성 및 방호 효과를 평가하는 이 기법은 DNA 손상 및 복구 과정을 정밀하게 모니터링할 수 있습니다.

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원자력 과학 및 공학의 호주 연구소의 지원 인정받고 있습니다. TCK는 AINSE 보너스받는했다. Epigenomic 의학 연구소는 국민 건강과 호주의 의료 연구위원회 (566559)에 의해 지원됩니다. LM은 멜버른 연구 (멜버른 대학)와 바이오 메디컬 이미징 CRC의 보조 장학금으로 지원됩니다. 모나 마이크로 이미징의 지원 (DRS 스티븐 코디 Iśka 카마 이클)이 작품 소중한했다.

셀 준비 <ol><li> 37, 표피 성장 인자, 소 뇌하수체 추출물 및 20 μg / ML gentamicin과 보충 ° C와 5% CO 2; 인간 keratinocytes (FEP - 1811)은 (Invitrogen K - SFM) Keratinocyte - 세럼 무료 매체 성장했다. </li><li> 단일 세포 현탁액은 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.05 % V / V)로 분리하여 준비했습니다 </li><li> 전지는 8 잘 연구실 테크 II microchamber 슬라이드에서 씨앗을 품고 있었다 (10,000 셀 / 음)과 슬라이드가 37 ° C와 5 % CO 2에서 3 일간 incubated되었습니다. </li></ol> 조사 <ol><li> 세포는 137 고사 소스를 (; Nordion 국제, ON, 캐나다, 20.6 초 / 쥐 Gammacell 1000 엘리트 irradiator)를 사용하여이 쥐와 함께 얼음에 조사되었다 </li><li> Unirradiated 제어 및 2 쥐 조사 전지는 37 ° C와 5% CO 2에서 1 시간 동안 incubated되었습니다. </li></ol> Immunofluorescence 염색법 <ol><li> 미디어는 밀고되어 세포가 잘 당 PBS의 300μl (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +)로 씻어 5 분 동안 궤도 믹서에 회전 하였다. </li><li> 버퍼는 밀고와 paraformaldehyde 각 잘 추가되었고 슬라이드가 10 분 동안 상온에서 incubated 있었다 신선한 4퍼센트 (V / V)의 100μl했습니다. 모든 incubations은 humidified 얼룩 트러프에서 수행되었다 </li><li> 전지는 다음 PBS (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +)로 세탁했다. 슬라이드가 5 분 궤도 믹서에 코플린 병 및 회전에 배치했다. 이 세척 단계는 더 이상 두 번 반복되었다. </li><li> 버퍼 밀고했고 초과 PBS는 부드럽게 blotted되었습니다. </li><li> 세포 100ml 트리톤 X - 100 (0.1 % V / V) 당 잘하고 실온에서 10 분 배양을 사용하여 permeabilized되었습니다. </li><li> 세포 PBS로 씻은했다 (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +)와 같은 3 단계 이상 4 설명했다. </li><li> 비 - 특정 단백질 바인딩은 상온에서 잘하고 이십분 부화 당 BSA의 100ml (1 % V / V)로 차단되었습니다. </li><li> 초과 BSA는 밀고되었으며 기본 마우스 단클론 항 phospho - H2AX 히스톤 항체 (1 % BSA에 1:500 희석, Millipore)의 100μl는 상온에서 1 시간 배양 각 잘 추가되었습니다. </li><li> 세포 PBS로 씻은했다 (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +) 위의 3 단계와 4 단계에서 설명한 및 보조 항체의 100μl (알렉사 플루어 488 염소 방지 마우스 IgG와 incubated 1 % BSA에 1:500 희석 ; Invitrogen) 어둠 속에서 실온에서 45 분간 잘마다. (희석 항체가 절차를 통해 어둠에 보관되었습니다) </li><li> 세포 PBS로 씻은했다 (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +)와 같은 3 단계 이상 4 설명했다. 그러나, 빛에 노출 호일을 사용하여 최소화했다. </li><li> 잘 따라와 실온에서 10 분 배양, 핵 counterstaining은 100ml TOPRO3 (Invitrogen 1:500 희석)으로 수행되었습니다 </li><li> 전지는 PBS (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +)가로 씻은 것처럼 위의 단계 10 설명했다. </li><li> 챔버 스는 조심스럽게 슬라이드에서 제거되었습니다, 과잉 수분이 blotted되었고 슬라이드는 건조 공기를 허용되었다. </li><li> GOLD 방지 퇴색 솔루션 (Invitrogen)를 연장 중 하나는 방울마다 잘 추가되었습니다과 슬라이드가 탑재되었다 (22x50 mm coverslip) 및 슬라이드의 가장자리 주위에 초과 액체는 bl​​otted되었습니다. </li><li> 슬라이드는 매니큐어로 밀봉하기 전에 실온에서 추가로 30 분 어둠에 보관했다. </li><li> 슬라이드 4에서 하룻밤 저장된 ° C 분석하기 전에 어둠 속이라서. </li></ol> 현미경 / 분석 <ol><li> (- 알렉사 플루어 488 염소 안티 - 마우스 IgG γH2AX)과 멀리 붉은 레이저 (TOPRO - 3) 자이스 혈구 LSM510 메타 공촛점 Microscpe은 표준 GFP를 사용하여 이미지를 획득하는 데 사용됩니다. 일반적으로 63 X 오일 침지 객관적인 렌즈가 사용됩니다. 이미지는 0.5 μm의의 스텝 크기와 Z - 시리즈 패턴에 인수됩니다. 0.5 μm의의 단계 크기는 핵에서 다른 비행기에 foci 선물의 손실을 최소화하기 위해 선정되었습니다. 분석하는 동안, 개인 비행기는 deconvoluted 및 foci의 중복 (톱 - 모자 필터 적용)를 최소화하기 위해 최대 예상 이미지를 생산하기 위해 정렬됩니다. </li><li> Metamorph (분자 디바이스, 미국)는 foci의 개수를 분석하는 데 사용되었다. 임계값이 배경을 제외 적용된 후이 프로그램은 각 셀에 foci의 수를 quantitates. 이 정보는 추가 분석을 위해 Microsoft Excel 스프레드 시트에 기록됩니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 치료 인간 keratinocytes에서 2 쥐와 조사 37에서 추가로 1 시간 동안 incubated 세포 γH2AX foci (녹색)의 Immunofluorescence 시각화 ° C 5 % CO 2. DNA는 TOPRO - 3 (블루) 물들일했습니다. 이미지 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 현미경을 사용하여 인수했다. 바 = 10 μm의. e_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 인간 keratinocytes에서 2 쥐와 조사 37에서 추가로 1 시간 동안 incubated 세포 γH2AX foci (녹색)의 Immunofluorescence 시각화 ° C 5 % CO 2. 이미지는 모든 foci가 인수되었습니다 보장하기 위해 0.5 μm의 Z - sectioning (1-9)를 사용하여 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 현미경을 사용하여 인수했다. 이미지는 다음 Metamorph를 사용하여 quantitation 위해 쌓아했다. DNA는 TOPRO - 3 (블루) 물들일했습니다. 스택 γH2AX 및 파랑 이미지는 시각화를 위해 쌓아되었습니다. 바 = 10 μm의.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Dynamic+%5Bgamma%5D-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li>
<li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li>
<li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5D-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li>
<li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li>
<li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li>
<li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li>
<li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li>
<li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이온화 방사선 (γ 선), 빠르게 γH2AX foci 양식 및 foci 번호를 다음 노출 30~60분 2 사이 최대에 도달. 따라서, 우리 1시간 후 방사선 시점은 초기 DSB 형성을 반영합니다. 우리는 우리의 실험 2 쥐의 임상 관련 방사선 선량을 사용했습니다. 그러나 방법은 초기 DSB 형성의 검출 4 쥐 위해 방사선 접종에 사용할 수있는, foci 상당한 중복 높은 복용에 정확한 quantitation 걸로. γH2AX foci가 같지는 숫자 결과, 수리​​로 인한 손실로 높은 방사선 접종은 더 후 방사선 배양 시간에 사용할 수 있습니다. 일반적으로, 최대 24 시간 후 방사선 배양 시간 4시간하며 모니터링 DNA의 수리를 위해 사용됩니다. 우리는 DNA가 우리 공촛점 현미경의 여기 레이저의 제한 TOPRO - 3으로 인해 스테인 사용하고 있습니다. 더 일반적으로, 4,6 - diamidino - 2 - phenylindole의 dihydrochloride (DAPI)는 핵 counterstaining...

<table><tbody><tr><td>Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)</td><td>배지</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>인간 재조합 Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53) 및 Bovine Pituitary Extract (BPE)가 첨가된 각질세포 배지.</td></tr><tr><td>Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)</td><td>챔버 슬라이드</td><td>Nalge Nunc international</td><td>NUN154534</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 (22x50mm)</td><td>커버슬립</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 BSA (1%)를 사용함. 1차 및 2차 항체는 BSA에 희석함.</td></tr><tr><td>PBS (Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 및 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 제외)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA x10</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>배양 플라스크에서 세포를 분리하기 위해 Trypsin-EDTA (0.05%)를 사용함.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>세포 투과화를 위해 Triton X-100 (0.1%)을 사용함.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>세포 고정을 위해 Paraformaldehyde (4%)를 사용함.</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX 항체</td><td>1차 항체</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>1% BSA에서 1차 항체 희석 (1:500).</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>1% BSA에서 2차 항체 희석 (1:500).</td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>DNA 염색제</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>흔히 사용되는 DNA 염색제: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). 적절한 여기 레이저가 장착된 현미경에서만 사용 가능함.</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>항퇴색 용액</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>20&amp;#x00B0;C에서 굴절률 1.42.</td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크, 통기성 캡</td><td>배양 플라스크</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시 (150x25mm)</td><td>페트리 접시</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>코플린 자(Jar), 유리제</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>염색 트러프</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td><td>감마 조사기</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td><td>공초점 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ionising 방사선에 대한 응답으로 γh2ax foci의 부량

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

내생 신진 대사 과정 중 또는 외인성 소스에 의해 유도된 아르 DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)는, 게놈 무결성 생존과 보존에 관한 가장 중요한 DNA의 병변 중 하나입니다. DSBs의 유도에 초기 반응은 γH2AX을 형성, 높​​은 보존 C - 터미널 SQEY의 모티브에서 세린 - 139 잔여물에서 H2A 히스톤 변형, H2AX의 인산화입니다<sup&gt; 1</sup&gt;. DSBs의 유도에 따라, H2AX는 빠르게 phosphatidyl - inosito 3 키나제 (PIKK) 단백질의 가족 운동 실조증 telangiectasia 변이된 (ATM), DNA - 단백질 키나제 촉매 subunit와 ATM과 RAD3 관련하여 phosphorylated입니다 (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. 일반적으로 단지 몇베이스 쌍 (BP)은 DNA 손상 신호 및 수리에 염색질 수정의 중요성을 감안할 때, 그러나, 중요한 신호 증폭이, DSB에 연루됩니다. H2AX의 인산화는 DSB 당 전체 세포 H2AX의 약 0.03 %에 영향을 미치는, 염색질의 인접 지역에 ATM 확산에 의해 주로 중재<sup&gt; 2,3</sup&gt;. 이것은 쉽게 시각과 immunofluorescence 현미경에 의해 quantitated 수있는 DSB와 이산 γH2AX foci 형성의 결과의 사이트를 둘러싼 염색질의 ~ 2 MBP 영역을 걸쳐 약 2000 H2AX 분자의 인산화에 해당하는<sup&gt; 2</sup&gt;. DSB에 γH2AX의 손실 복구를 반영하지만, DSBs의 완전한 복구를 정의하는 무엇 같은 논쟁이있다, 그것은 DNA의 양쪽 가닥이 복귀하는 것은 그러나 적절한 것을 제안되었습니다, 그것은 또한 제안되었음을에 다시 instatement 압축의 원래 염색질 상태가 필요합니다<sup&gt; 4-8</sup&gt;. γH2AX의 disappearence 적어도 부분적으로 포함, phosphatases, 인산 가수 분해 효소 2A 및 인산 가수 분해 효소 4C에 의해 dephosphorylation<sup&gt; 5,6</sup&gt;. 또한, H2A.Z와 히스톤 교류를 포함한 재배포하여 γH2AX의 제거가 연루되어있다<sup&gt; 7,8</sup&gt;. 중요한 것은 γH2AX foci의 정량 분석​​은 의료 및 핵 연구에 응용 프로그램의 다양한되었다. 여기서는 γ - 반구 자기편 인간 keratinocytes에서 γH2AX foci의 탐지 및 quantitation에 의해 초기의 DNA 손상 평가를 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법을 보여주 immunofluorescence<sup&gt; 9</sup&gt;.

분자 마커로 γH2AX 형성을 사용하여 DNA 이중 스트랜드 줄무늬의 부량 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 방사선에 노출 후 세포의 γH2AX foci의 부량위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

내인성 대사 과정 또는 외인성 요인에 의해 유도되는 DNA 이중가닥 절단(double-strand breaks, DSBs)은 가장 치명적인 DNA...

안녕하세요, Baker Eye, DI Heart and Diabetes Institute의 Tom Caris 박사님이 이끄시는 후성유전체 의학 연구실의 Ian Ma입니다. 저는 현재 박사 과정 중이며, 이중 가닥 절단의 분자 표지자인 Gamma H two A X에 미치는 방사선의 영향에 중점을 두고 연구하고 있습니다. 오늘은 인간 각막 세포에서 감마선 조사에 반응하여 나타나는 Gamma H two A expo의 정량 분석 실험을 시연하겠습니다.이 면역염색 프로토콜은 초기 DNA 손상과 DNA 복구를 모두 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 이 방법은 잠재적인 방사선 조절 화합물의 효능을 평가하는 데 유용합니다. 예를 들어, DNA 손상을 증가시킬 것으로 예상되는 방사선 민감제는 더 많은 수의 gamma H two A X 포커스를 형성하게 하며, 반대로 방사선 보호제는 DNA 이중 가닥 절단을 감소시켜 검출되는 포커스 수를 낮추는 반대 효과를 나타냅니다.이제 실험을 시작하겠습니다. 이 실험에 사용된 세포는 인간 세포이며, 각 웰에 10,000개의 세포가 배치된 챔버 슬라이드로 준비되었습니다. 슬라이드는 방사선 조사 전 37°C, 5% carbon dioxide 조건에서 3일 동안 배양되었습니다.운반체 2D 조사기를 얼음 위에서 슬라이스한 다음, 2 Gray로 조사하며 대조군 슬라이드는 조사하지 않은 상태로 둡니다. 조사 후 슬라이드를 인큐베이터에 1시간 동안 다시 넣으며, 이 배양 기간을 통해 초기 DNA 손상을 관찰할 수 있습니다. 다음으로 염색 과정을 진행합니다.먼저 웰을 조심스럽게 형성한 후, 챔버에 calcium chloride와 magnesium chloride가 없는 PBS 300 µL를 첨가합니다. 세포를 헹구기 위해 플레이트 쉐이커 위에서 5분 동안 둔 다음, PBS를 조심스럽게 따라내어 제거합니다. 다음으로, 4% paraldehyde 100 µL로 세포를 고정하고 상온에서 10분 동안 방치한 후, PBS가 채워진 코튼 자에 넣어 플레이트 쉐이커 위에서 5분 동안 둡니다.이 세척 단계를 반복하여 총 3회, 각 5분씩 세척합니다. 세척 후, 슬라이드를 흡수성 종이 위에서 조심스럽게 건조시킵니다. 과량의 PBS를 제거하기 위해, 세포를 100 µL의 0.1% Triton X-100에서 실온으로 10분 동안 처리합니다. 10분 후, 앞서 설명한 것과 같이 PBS로 3회, 각 5분씩 슬라이드를 세

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

γH2AX foci을 바탕으로 DNA 이중 가닥 나누기의 Quantitation는 조직 radiosensitivity 방사선 수정 화합물의 효과 평가를 위해, 특히 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 조직 샘플에서 γH2AX foci의 quantitation위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.

조직 샘플에서 γH2AX Foci의 Quantitation

DNA 이중 가닥의 휴식 시간에 대한 응답으로 빼앗아 - 139에서 H2AX의 인산화 다음 양식 γH2AX foci,의 현미경 분석 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기서 우리는 핵 내에서 방사선 유발 γH2AX 형성의 공간적 분포를 평가하기 위해 적극적으로 속기 euchromatin의 epigenetic 마커로 라이신 4 모노 - methylated 히스톤 H3에 항체를 사용합니다.

이온화 방사선 다음 γH2AX의 공간적 분포 평가

유세포 분석을 이용하여 DNA 이중 가닥 절단의 마커인 인산화된 히스톤 H2AX를 측정하여 마우스 비장 림프구에서 만성 생체 내 저선량 조사로 인해 유발될 수 있는 DNA 손상 수준 및 DNA 복구 용량의 변화를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

만성 후 마우스 비장 세포에서 DNA 손상 및 복구를 측정<em&gt; 생체</em&gt; 베타와 감마 방사선의 매우 낮은 복용량에 노출

이 원고는 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

ΓH2AX와 53BP1 형성 및 DNA 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법

이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

제시된 방법은 DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs), 세포 주기 분포 및 세포 자멸의 정량 분석을 결합하여 DSB 유도 및 수리의 세포 주기 별 평가뿐만 아니라 수리 실패의 결과를 가능하게합니다.

유세포측정에 의한 유독성 응력 후 γH2AX 및 세포자멸의 세포 주기별 측정

붕소 중성자 포획 요법(BNCT)에 사용되는 중성자 혼합빔에 의해 활성화된 방사선 유도 DNA 손상 반응은 완전히 확립되지 않았다. 이 프로토콜은 중성자 혼합 빔으로 조사 한 후 인간 대장암 세포주에서 면역 형광 염색에 의해 수리 단백질의 방사선 유도 포시 (RIF)를 검출하는 단계별 절차를 제공합니다.

인간 결장 암 세포에 있는 DNA 손상 및 복구 Foci의 면역 형광 화상 진찰

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

이 프로토콜은 말초 혈액 림프구에 대한 γ-H2AX 포시 분석의 슬라이드 준비 및 자동 채점을 제공합니다. 분석의 방법 및 민감도를 설명하기 위해, 격리된 림프구는 시험관내에서조사되었다. DNA DSB 검출의 이 자동화된 방법은 빠르고 높은 처리량 생물학 도시법 응용에 유용합니다.

인간 말초 혈액 림프구의 γ-H2AX 포시 분석에 대한 자동화된 현미경 채점 방법

이 프로토콜은 블레오마이신 처리된 인간 말초 림프구의 간기 핵에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 동시 검출을 통해 DNA 이중 가닥 절단의 형성 및 복구를 평가하는 방법을 제시합니다.

인간 말초 림프구에서 γH2AX 및 53BP1의 이중 면역형광

여기에서는 DNA 손상 부위에서 단백질 상호 작용을 검출하기 위한 간단하고 신속한 프로토콜을 제시합니다.

DNA 손상 부위의 단백질을 국소화하기 위한 Proximity Ligand Assay

학습하세요 방사선 생물학에서 γH2AX 포커 정량화를 통한 DNA 이중가닥 파손 측정 방법을 인간 세포에서 면역형광 분석을 활용하여 방사선 감수성 및 방호 효과를 평가하는 이 기법은 DNA 손상 및 복구 과정을 정밀하게 모니터링할 수 있습니다.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

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