마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

세포의 대사와 기능을 조절하는 메커니즘을 이해하기 위해서는 살아있는 세포 내 분자들의 상호작용 네트워크를 밝히는 것이 특히 중요합니다. 정성적 및 정량적 정보를 제공하는 점점 더 많은 방법론들이 세포 기능에 대한 총체적인 그림을 얻기 위한 원동력이 되고 있습니다. Co ip, TAP tag 또는 광가교결합(photo cross linking) 분석법을 통해 시험관 내(in vitro)에서 표적 분자들을 정제할 수 있습니다.

또한, 살아있는 세포 내에서의 단백질 상호작용 분석을 위해 여러 가지 접근 방식이 설계되었습니다. 여기에는 두 가지 하이브리드 스크리닝 또는 형광 단백질의 상보성 분석법이 포함됩니다. 나아가, 이 문제를 해결하기 위해 FRET 또는 FCS와 같은 일부 분광학적 접근 방식과 비분광학적 방법들이 확립되었습니다.

앞서 언급한 기술들은 대규모의 세포 집단을 기록하기 위해 개발되었으나, 다소 간접적인 방식이라는 단점이 있어 정량적 분석이 어렵습니다. 이와 대조적으로, 몇 가지 정밀한 정량적 접근 방식들이 도입되었습니다. 하지만 높은 처리량의 기능을 유지하면서 정량적 정보를 추출할 수 있는 가능성을 결합하여 확장하는 것은 어렵습니다.

최근 당사는 단백질-단백질 상호작용을 식별하기 위한 새로운 개념을 개발하였습니다. 여기서 마이크로 패터닝 기술은 BSA Sci five의 마이크로 패터닝 SA 그리드에 대한 도식적 설명으로, 기능화된 유리 커버슬립 위에 인쇄되며 간격은 스트렙타비딘과 비오틴화된 리간드로 채워집니다. 대부분의 경우, 막에 대한 항체를 사용합니다.

이러한 마이크로바이옴 칩 상에서 배양된 세포 내의 단백질 베이트(bait)입니다. 베이트는 항체 마이크로 패턴에 따라 세포막에 배치됩니다. 형광 표지된 두 번째 단백질 프레이(prey)와의 상호작용은 공패턴 형성(co patterning) 정도를 측정하여 탐색합니다. 이때 특정 크기와 깊이의 사각형 어레이가 형성된 실리콘 마스터 PDMS 스탬프를 사용합니다.

3 µm 크기의 스탬프를 겔에서 제작하여 절단합니다. 스탬프를 100% ethanol과 2차 증류수로 헹군 후, 질소 가스로 건조시킵니다. 그 다음 0.67 mg/mL의 sci-fi와 함께 배양합니다.

실온에서 30분 동안 라벨링된 BSA 용액으로 인큐베이션합니다. 에폭시 변성 유리 커버슬립도 동일한 방식으로 세척합니다. 인킹 후, 스탬프를 PBS와 물로 세척하는 과정도 동일하게 진행합니다. BSA sci five 전이를 위해.

스탬프를 질소로 건조시킨 후, 즉시 유리 커버슬립 아래에 자체 무게로 눌러 30분 동안 둡니다. 마이크로 패턴 영역의 위치를 커버슬립 뒷면에 표시합니다. 스탬프를 제거한 후, 커버슬립을 접착성 실리콘 마스크로 밀봉합니다.

챔버에 50 µg/mL Streptavidin 용액을 넣고 1시간 동안 배양한 후, 1 mL PBS로 헹굽니다. 이어서, streptavidin 패턴을 10 µg/mL biotinylated antibody와 함께 1시간 동안 배양하고, PBS로 세척한 후 챔버에 세포를 주입합니다. 세포가 표면에 부착되면 샘플 측정 준비가 완료됩니다.

판독을 위한 유일한 요구 사항은 전반사 구성으로 시료를 조명할 수 있는 형광 현미경입니다. 이러한 시스템은 다양한 공급업체를 통해 상용 판매되고 있으며, 최근 몇 년 동안 사용자가 다루기 쉬워졌습니다. 본 연구의 검출 시스템은 에피 형광 현미경에 구축되었습니다.

사용된 형광체 샘플의 선택적 형광 여기를 위해 아르곤 및 크립톤 이온 레이저가 사용되며, 100배 배율의 고 NA 오일 침강 대물렌즈를 이용한 대물렌즈 기반 전반사 구성으로 샘플을 조사합니다. 표준 필터 세트를 사용하여 적절히 필터링한 후, 형광을 후면 조사형 CCD 카메라로 이미징합니다. 판독은 시간 지연 및 통합(TDI) 모드로 수행되어 넓은 샘플 영역의 스캐닝이 가능합니다. 이를 위해 카메라의 라인 시프트에 동기화된 전동 XY 스테이지를 사용하여 샘플을 이동시킵니다.

반사된 레이저 빔은 2분할 포토다이오드에 상이 맺히며, 여기서 발생하는 차동 신호를 이용하여 Z 피에조를 제어함으로써 빠르게 초점을 재조정합니다. 리더기에는 스캐닝 과정 중에 작동하는 자동 초점 유지 시스템이 장착되어 있으며, 첫 번째 스캔은 GFP의 선택적 흥분을 위해 488 nanometer에서, 두 번째 스캔은 PS Five의 선택적 흥분을 위해 647 nanometer에서 수행됩니다. 데이터 분석을 위해, 항체 포착 영역 내부와 외부의 형광 강도를 기반으로 MATLAB으로 작성된 대비 계산 프로그램을 사용합니다.

수많은 세포를 빠르게 분석하기 위해 대비 수준과 그에 따른 단백질 상호작용 정도를 분석합니다. 시판되는 자동화 소프트웨어를 사용할 수도 있습니다. 예를 들어, Olympus에서 제공하는 scan R 이미징 소프트웨어가 마이크로 패터닝 실험의 대비 평가에 성공적으로 테스트되었습니다.

여기에 나타난 바와 같이, 초기 T세포 신호 전달 단백질인 CD4와 LCK의 잘 알려진 상호작용을 분석합니다. 형광 LCK가 CD4 항체 코팅 영역에서 명확하게 재분포됩니다. 이후 아연 킬레이트제(zinc chelator)를 첨가하여 이 두 단백질의 주요 상호작용 부위인 아연 클라스프(zinc clasp) 구조를 파괴하면 LCK 마이크로 패턴의 대비가 감소합니다.

요약하자면, 마이크로 패턴화 기술의 주요 장점은 다음과 같습니다. 국소적으로 공간 분해능이 확보된 단백질 상호작용의 정량화가 가능합니다. 또한, 살아있는 세포의 세포막 내에서 일어나는 약한 상호작용의 검출, 조절된 bait-prey 상호작용의 검출, 휴지 상태의 분석, 그리고 고처리량 분석으로의 적용 가능성 등이 있습니다.