마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지
March 19th, 2010
이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.
기능을 조절하는 메커니즘을 이해하기 위해 살아있는 세포 내 분자의 상호 작용 네트워크를 밝히는 것이 특히 중요합니다. 정성적 및 정량적 정보를 제공하는 점점 더 많은 방법론이 세포 기능에 대한 전체적인 그림을 얻기 위한 원동력이 되고 있습니다. Co ip, TAP 태그 또는 사진 교차 결합 에세이는 시험관 내에서 사전 분자의 정제를 허용합니다.
또한 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 분석하기 위해 여러 가지 접근 방식이 설계되었습니다. 여기에는 두 개의 하이브리드 스크리닝 또는 형광 단백질의 보완 에세이가 포함됩니다. 또한 이 질문을 해결하기 위해 fret 또는 FCS와 같은 일부 분광 접근 방식과 비 분광 방법이 확립되었습니다.
앞서 언급한 기술은 많은 세포 집단을 기록하기 위해 개발되었지만 다소 간접적이기 때문에 정량화가 거의 없다는 단점이 있습니다. 대조적으로, 몇 가지 고급 정량적 접근 방식이 도입되었습니다. 그러나 높은 처리량을 확장하면 높은 처리량 기능과 정량적 정보를 추출할 수 있는 가능성을 결합하기가 어렵습니다.
우리는 최근에 단백질 단백질 상호 작용을 식별하기 위한 새로운 개념을 개발했습니다. 여기서 마이크로 패터링 기법은 BSA Sci five의 마이크로 패터링 SA 그리드를 개략적으로 보여준 것으로, 기능화된 유리 커버 슬립에 인쇄되고 간공간은 스트렙타비딘으로 채워지며 그 뒤에 비오틴화 리간드가 채워집니다. 대부분의 경우, 멤브레인에 대한 항체.
이러한 마이크로바이옴 칩에서 자란 세포의 단백질 미끼. 미끼는 항체 마이크로 패턴에 따라 원형질막에 배치됩니다. 두 번째 형광 표지된 단백질 먹이와의 상호 작용은 피처 크기와 깊이가 있는 사각형 배열이 있는 실리콘 마스터 PD MS 스탬프를 사용하여 공동 패터링 정도를 측정하여 조사됩니다.
3 마이크로 미터는 젤에서 생산되고 잘라냅니다. 스탬프는 100% 에탄올과 더블 de 증류수로 헹구고 전에 질소로 건조합니다. 그들은 공상 과학 밀리리터당 0.67밀리그램으로 배양됩니다.
30분 동안 라벨이 붙은 BSA 용액 배양 중 실온에서 에폭시 개질 유리 커버 슬립을 동일한 방식으로 세척합니다. 잉크 입력 후 같은 방법으로 스탬프를 PBS와 물로 씻습니다. BSA sci five 전송의 경우.
스탬프는 질소로 건조된 직후 유리 커버 슬립 아래에 30분 동안 자체 무게로 놓입니다. 마이크로 패턴 필드의 위치는 커버 슬립의 뒷면에 표시되어 있습니다. 스탬프를 제거하면 커버 슬립이 접착 실리콘 마스크로 밀봉됩니다.
챔버에는 밀리리터당 50마이크로그램의 스트렙타비딘 용액이 적재되어 1시간 동안 배양된 후 1밀리리터 PBS로 헹굽니다. 그 후, 스트렙타비딘 패턴을 1시간 동안 밀리리터당 10마이크로그램의 비오틴화 항체와 함께 배양하고 PBS로 세척한 후 세포를 챔버에 로드합니다. 세포가 표면에 부착되면 샘플을 측정할 준비가 된 것입니다.
판독에 대한 유일한 요구 사항은 전체 내부 반사 구성에서 샘플을 비출 수 있는 형광 현미경입니다. 이러한 시스템은 다양한 공급업체에서 상업적으로 사용할 수 있으며 지난 몇 년 동안 사용자가 쉽게 다룰 수 있게 되었습니다. 당사의 검출 시스템은 epi 형광 현미경에 설정되어 있습니다.
아르곤 및 크립톤 이온 레이저는 사용된 fluoro fours 샘플의 선택적 형광 여기에 사용되며, 100배 배율의 높은 NA 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 대물렌즈 기반 전반사 구성으로 조명됩니다. 표준 필터 세트를 사용하여 적절한 필터링을 거친 후 형광이 이면조사형 CCD 카메라에 이미지화되고 시간 지연 및 통합 모드에서 판독이 수행되어 넓은 샘플 영역을 스캔할 수 있습니다. 이를 위해 샘플은 카메라의 라인 이동과 동기화된 전동 XY 스테이지를 사용하여 이동됩니다.
후면 반사 레이저 빔은 2 세그먼트 포토 다이오드에서 이미지화되고 차동 신호는 빠른 재초점을 위해 Z pizo를 제어하는 데 사용됩니다. 이 리더기에는 GFP의 선택적 여기를 위해 488나노미터에서 한 번 스캔하고, PS Five의 선택적 여기를 위해 647나노미터에서 두 번째 스캔으로 스캔 프로세스 중에 작동하는 자동 초점 유지 시스템이 장착되어 있습니다. 데이터 분석을 위해 캡처된 항체 영역 내부 및 외부의 형광 강도를 기반으로 MATLAB에서 작성된 대비 계산 프로그램을 사용합니다.
많은 수의 세포를 빠르게 분석하기 위해 대비 수준과 그에 따른 단백질 상호 작용 정도를 분석합니다. 또한 상업적으로 이용 가능한 자동화 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Olympus에서 제공하는 스캔 R 이미징 소프트웨어는 마이크로 패턴 실험의 대비 평가를 위해 성공적으로 테스트되었습니다.
우리는 여기에서 볼 수 있듯이 초기 T 세포 신호전달에서 단백질에 대한 CD 4 및 LCK의 잘 알려진 상호 작용을 분석합니다. 형광 LCK는 CD에 4개의 항체 코팅 영역을 명확하게 재분배합니다. 아연 세포를 첨가하여 이 두 단백질의 주요 상호 작용 부위인 아연 걸쇠 구조를 파괴하면 나중에 LCK 마이크로 패턴의 대비가 감소합니다.
요약하면, 마이크로 패터닝 기술의 주요 장점은 국부적으로 공간적으로 분해된 단백질 상호 작용의 정량화입니다. 또한, 살아있는 세포의 원형질막에서도 약한 상호 작용 감지, 조절된 미끼 먹이 상호 작용 감지, 휴지 상태 분석 및 높은 처리량을 위한 접근 방식의 적용 가능성.
개요
이 연구는 생체 내 세포에서 단백질-단백질 상호작용을 분석하기 위한 새로운 마이크로 패터닝 기술을 제시합니다. 이 방법은 고처리량 기능과 정량적 분석을 결합하여 약한 상호작용을 감지하고 베이트-프레이 상호작용을 조절할 수 있게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 단백질 상호작용
배경
- 분자 상호작용 네트워크를 이해하는 것은 세포 대사와 기능을 밝히는 데 매우 중요합니다.
- 단백질 상호작용을 분석하는 기존 방법은 종종 정량적 정밀도가 부족합니다.
- 세포 기능에 대한 전체적인 통찰력을 제공하는 새로운 방법론이 필요합니다.
- 마이크로 패터닝은 단백질 상호작용을 직접 관찰할 수 있는 유망한 접근 방법을 제공합니다.
연구 목적
- 단백질-단백질 상호작용을 정량화하는 고처리량 방법을 개발합니다.
- 생체 내 세포에서 약한 상호작용을 감지할 수 있게 합니다.
- 동적 세포 과정의 분석을 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 스트렙타비딘 및 비오틴화된 항체를 사용한 표면의 마이크로 패터닝.
- 단백질 상호작용 이미징을 위한 형광 현미경.
- 데이터 분석을 위한 MATLAB의 대비 계산 프로그램.
- 마이크로 패터닝 실험을 평가하기 위한 자동화된 소프트웨어.
주요 결과
- 생체 내 세포에서 국소 단백질 상호작용의 성공적인 정량화.
- 혈장막에서 약한 상호작용의 감지를 입증했습니다.
- T-세포 신호전달에서 CD4와 LCK 단백질 상호작용의 분석.
- 단백질 상호작용의 고처리량 분석을 위한 신뢰할 수 있는 방법을 확립했습니다.
결론
- 마이크로 패터닝 기술은 단백질 상호작용을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.
- 이 접근 방법은 생체 내 세포에서 조절된 상호작용의 감지를 가능하게 합니다.
- 세포 메커니즘에 대한 이해를 발전시키는 잠재력을 가지고 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Understanding protein-protein interaction networks in living cells is critical for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. This micro-patterning technique enables quantitative, high-throughput analysis of weak and modulated interactions directly in the plasma membrane, providing predictive confidence for therapeutic hypothesis interrogation. The approach supports portfolio triage by reducing biological ambiguity in target engagement assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying spatially resolved protein interactions in living cells.
- Operational Value: Detects weak interactions in the plasma membrane, supporting functional target validation where indirect methods fail.
- Predictive Value: Measures modulated bait-prey interactions, informing go/no-go decisions based on interaction dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by patterning membrane proteins according to antibody microarrays.
- Operational Value: Uses fluorescence microscopy in total internal reflection configuration for quantitative, spatially resolved readouts.
- Scalability: Compatible with automated XY stage scanning and time-delay integration for high-throughput analysis of large cell populations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Analyzes resting-state and modulated interactions in living cells, bridging discovery to preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Quantifies interaction changes upon perturbation (e.g., zinc chelator disruption of CD4-LCK), supporting risk-adjusted advancement.
- Biomarker Alignment: Enables detection of interaction network alterations relevant to disease-relevant signaling pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling quantitative interaction profiling prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping protein co-localization patterns in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized micropatterned surfaces and reproducible fluorescent prey redistribution readouts.
- Analytics: Provides contrast-based quantification via MATLAB or automated software, enabling statistical comparison of interaction strengths.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by analyzing dynamic interactions in physiologically relevant membrane environments.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening multiple bait-prey pairs across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct, quantitative measurement of protein interactions in living cells.
- Operational Value: Standardization via micropatterned surfaces and automated focus control ensures reproducibility across experiments and users.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by quantifying interaction modulation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on interaction strength and dynamics data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein labeling, micropatterning, and fluorescence microscopy.
- Needs instrumentation for total internal reflection fluorescence (TIRF) imaging and motorized stage control.
- Demands standardization of antibody patterning and fluorescent prey expression across teams.
- Adaptation considerations include varying membrane protein expression levels and prey labeling efficiency.
- Practical limitations include dependency on accessible exoplasmic domains for antibody binding and potential steric hindrance from micropatterning.
