Name: 마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 배우세요 생체내 단백질-단백질 상호작용을 마이크로 패터닝 기법으로 정량 분석하는 방법을. 형광 현미경과 MATLAB을 활용하여 약한 상호작용을 검출하고 고처리량 분석이 가능합니다.

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우리는 GPI - GFP 들어, hCD71 - GFP 구축, 그리고 다니엘 레글러, 콘스탄츠, 스위스의 대학에 대한 그녀의 친절한 도움 Katharina Strub, 스위스 제네바 대학에 대한 Quentina 비티, 린츠, 오스트리아의 대학, 감사의 말씀을 전합니다 - DAF는 건설. 과학 연구에 대한 오스트리아 연방 교육부의 GEN - AU 프로젝트,이 작품은 오스트리아 과학 기금 (프로젝트 Y250 - B03 FWF)에 의해 지원되었다.

Microcontact 인쇄 : <ol><li> 메스를 사용하여 PDMS 스탬프의 micropattern 분야를 잘라 </li><li> 에탄올 (100 %)와 증류수로 플러싱하여 micropattern가 들어있는 필드를 씻으십시오. </li><li> 질소 또는 아르곤 가스와 PDMS 스탬프를 건조시킵니다. </li><li> 피펫 50 μl BSA - Cy5 작업 솔루션 (0.67 MG / ML) 전체 micropattern 필드 솔루션으로 덮여있다 있도록 PDMS 스탬프로. 실온에서 30 분 알을 품다. </li><li> 인산과 플러싱하여 micropattern 필드를 세차 살린 (PBS)와 증류수를 버퍼. </li><li> 질소 또는 아르곤 가스와 PDMS를 건조시킵니다. </li><li> 한 에폭시 코팅 coverslip의 중간에 자체 무게에 따라 PDMS 스탬프를 놓고는 배양 접시에 실온에서 30 분 알을 품다. </li><li> coverslip의 뒷면에있는 PDMS 스탬프의 위치를​​ 분류하고 집게로 슬라이드에서 우표를 스트립. </li><li> coverslip에 microcontact - 인쇄 분야를 통해 안전한 인감 하이브 리다이 제이션 실 스틱. 레이블이 분야의 중심을 집중하는 데 도움이됩니다. </li><li> 피펫 60 μl streptavidin 작업 반응 챔버에 솔루션 (50 μg / ML)과 실온에서 60 분에 대한 샘플을 품어. </li><li> 챔버 중 하나 포트에 버퍼를 추가하고 펌프와 두 번째 포트에서 동시에 그것을 제거하여 한 ML PBS로 샘플을 씻으십시오. </li><li> 피펫 60 μl biotinylated 항체 작업 솔루션 (10 μg / 0.1 % 트윈 20과 보충 PBS의 ML, "PBST") 실온에서 60 분 반응 챔버 및 부화에. </li><li> 챔버 중 하나 포트에 버퍼를 추가하고 펌프와 두 번째 포트에서 다시 제거하여 한 ML PBST하고 이후 1 ML PBS로 샘플을 씻으십시오. </li><li> 세포 시딩 준비가 될 때까지 상온에서 어둠의 PBS에서 micropatterned 표면을 저장합니다. </li></ol> micropatterned 표면에 세포의 인큐베이션 : <ol><li> 3cm 조직 문화 판의 50 % 합류로 자기편 세포를 성장. </li><li> Ethylenediaminetetraacetic 산성 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 솔루션으로 관심을 유인 먹이 단백질을 표현하는 세포를 분리하고 1,000 rpm으로 5 분 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 따라 성장 매체에있는 세포 펠렛을 디졸브. </li><li> 1,000 rpm으로 5 분 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 적절한 성장 매체 세포 펠렛을 디졸브. </li><li> 교환 세포 현탁액의 60 μl로 micropatterned coverslip에 반응 챔버에서 PBS. </li><li> 증류수에 살균 패드를 몸으로 건조 실행 예제를 방지하기 위해 페트리 접시에 그것을 넣어 humidified 챔버를 만듭니다. </li><li> 37 박 이상의 세포를 품어 ° micropatterned 표면에 5 % CO 2 분위기에서 C. </li><li> 현미경에서 세포를 분석하기 전에, CA 2 포함한 행크의 버퍼 소금 솔루션으로 매체를 교환 +와 MG 2 +. </li></ol> 현미경 : <ol><li> coverslip는 적절한 마운트에 위치하고 세포 형태는 흰 빛 아래에서 확인합니다. </li><li> BSA - Cy5 패턴의 품질은 647 nm의 여기에 의해 확인됩니다. </li><li> 형광 먹이 단백질 (GFP 또는 YFP)의 Micropatterns는 총 내부 반사 (티르) 여기에 따라 488 또는 514 nm의에 기록됩니다. </li></ol> 대표 결과 : micropatterned 표면에 성장 세포에있는 대상 단백질 간의 상호 작용이있는 경우, 먹이가 미끼 재배포를 수행합니다. 결과 micropattern는 먹이 단백질의 형광 레이블로 시각 수 있습니다. 중요한 얻은 대비 상호 작용의 강도를 직접 측정을 (그림 1 참조)을 제공합니다. 두 단백질의 상호 작용에 따라서 간단한 평가는 가능한 것입니다 - 자세한 측정 기본 데이터를 처리하는 데 필요하지 않고. <img src="/files/ftp_upload/1969/1969fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 다른 상호 작용의 강점에서 라이브 셀 플라즈마 막의 미끼에 다시 정리하기. CD59 - 항체 microbiochips에 티르의 CD71 - 항체에 (A) CD71 - GFP와 transfected T24 세포의 이미지, (B) CD4와 CD4 - 항체에 cytosolic YFP 그리고 (c) GPI - GFP - DAF가 표시됩니다. 데이터에 대한 특성없는 강한 (A),도 (B) 또는 약한 상호 작용 (C). (A) (Weghuber 외., 언론), (B) (Schwarzenbacher 외., 2008)로부터 재현됩니다.

<ol><li>Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to+%22Uncoupling+diffusion+and+binding+in+FRAP+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments.</a> Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).</li>
<li>Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Zinc+Clasp+Structure+Tethers+Lck+to+T+Cell+Coreceptors+CD4+and+CD8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8.</a> Science. 301, 1725-1728 (2003).</li>
<li>Ramm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+screening%3A+a+technology+in+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Image-based screening: a technology in transition.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).</li>
<li>Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+for+quantitative+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).</li>
<li>Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein-protein+interactions+in+the+live+cell+plasma+membrane+by+quantifying+prey+redistribution+upon+bait+micropatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.</a> Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

비디오 시각화 연구실의 홈페이지에서 가져온 올림푸스, 브라운 대학에 의해 제공 또는 (김 외., 2003)에서 재현되었습니다 이미지가 포함되어 있습니다.

함께 비디오 생활 세포의 플라즈마 - 멤브레인 (.; Brameshuber 외, 2009;.. Weghuber 외, 언론에서 Schwarzenbacher 외, 2008)에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 방법을 보여줍니다. 원칙적으로, 모든 TIRF 기반 현미경 플랫폼은 판독 시스템으로 사용할 수 있습니다. 높은 감도 (단일 분자의 검출에 대한 예) 원하는 경우에만, 고급 현미경이 필요합니다. 최상의 결과가 준비 과정에서 다음과 같은 중요한 사항을 달성하기 위해서는 특별한주의가 필요합니다 : <ol class="lroman"><li> 어두운 조건 스토어 Cy5 주식 솔루션은 형광단의 표백 방지와 microcontact 인쇄하기 전에 신선한 BSA - Cy5 작업 솔루션을 준비합니다. </li><li> 피펫 팁로 PDMS에 micropattern을 긁거나 형광단의 표백 피하기 위해 어두운 조건에서 샘플을 부화하지 않도록주의하십시오. </li><li> 페트리 접시에 유리 슬라이드의 고집 방지하기 위해 멸균 패드에 coverslip 놔. PDMS 스탬프는 유리 슬라이드에 준수되면, 그것을 이동하지 않습니다. </li><li> 반응 챔버에서 공기 방울을 피하고 형광단의 표백 피하기 위해 어두운 조건에서 샘플을 품어. </li><li> 소금 결정의 형성을 피하기 위해 2 개 이상 분 샘플 건조시키지 마십시오. </li><li> 세포의 분리에 관해서는 트립신을 사용하지 않는 그것 클리브은 지금까지 표현 막 단백질의 세포외 도메인 것입니다. 트립신을 피하기 것은 바로 표면에 세포 부착 후 micropatterns을 형성 낮은 회전율 속도로 단백질을 위해 도움이 될 것입니다. </li><li> 현미경에 incubated 세포의 수를 제어하고 세포가 이상 30-50%의 합류에 도달하지 않은지 확인하십시오. 과도한 세포 인해 항체 - 코팅 표면에 세포의 빠른 첨부 파일에 즉시 제거되었는지 확인합니다. </li><li> 고품질 BSA - Cy5 패턴만을 슬라이드가 추가 분석을 위해 사용될 수 있습니다. </li><li> 형광 먹이 단백질의 안정적인 표현으로 인해 스캔마다 분석할 수 세포의 더 많은 것이 바람직합니다. </li><li> 적절한 TIRF 조정은 cytosolic 배경으로 인해 패턴을 시각화하기 위해 필수입니다. </li></ol> 마이크로 patterning 기술은 단백질 - 단백질 상호 작용의 분석을위한 몇 가지 가능성을 제공합니다. 첫째, 지역, 공간 해결 단백질 단백질 상호 작용의 부량와 함께 또한 약한 또는 간접적으로 상호 작용의 검출은 잘못된 반응 또는 제외 높은 번호를 부여의 단점없이 가능합니다. 둘째 그것은 2 하이브리드 화면과 같은 생화 학적 방법에 의해 달성하기 어렵습니다 라이브 세포의 플라즈마 막에 단백질 단백질 상호 작용을 분석하기 위해 연구자 수 있습니다. 셋째 방법은 온도, 다른 단백질이나 다른 분자 또는 사후 translational 수정의 존재와 같은 환경 변화에 의해 변조된 아르 미끼 - 먹이 상호 작용의 검출을 허용합니다. 따라서 분석 살 세포의 맥락에서 주어진 상호 작용 쌍 심사 변조기를 허용합니다. 또한 캡처 리간드 또는 monovalent 리간드의 사용의 표면 밀도를 줄임으로써, 휴식 상태의 분석이 가능하게됩니다. 적절한 검색 플랫폼을 사용하는 경우 마지막으로, 분석 세포의 숫자는 약물 검사를위한 제약 회사의 높은 처리량 요구 (램, 2005)와 일치 정도로 높습니다.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

분자의 상호 작용 네트워크를 무너지고있다<em&gt;에 - 생체내</em&gt; 세포 기능과 신진 대사를 조절하는 메커니즘을 이해하는 열쇠입니다. 세포의 분자 상호 작용을 해결하기위한 방법 론적 선택의 무리가 개발하지만, 이러한 방법의 대부분은 거의 양적 오히려 간접 따라서되는 고통되었습니다. 반대로, 몇 가지 고급 양적 접근 방법이 도입되었다, 그러나 높은 처리량을 확장하기가 어렵습있는. 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합하기 위해, 우리는 최근에 단백질 단백질 상호 작용을 파악하기위한 새로운 개념을 (Schwarzenbacher 개발<em&gt; 외</em&gt;., 2008). 여기, 우리는 ( &quot;미끼&quot;) 형광단 - 라벨 단백질 ( &quot;먹이&quot;)와 막 단백질 사이의 상호 작용을 분석하는 허용이 시스템의 설계 및 건설에 대한 자세한 프로토콜을 설명<em&gt;에 - 생체내</em&gt;. 세포는 미끼 exoplasmic 도메인에 대한 항체로 작용 micropatterned 표면에 도금입니다. 미끼 - 먹이 상호 작용은 형광등 먹이의 재배포를 통해 assayed 있습니다. 방법은 선별 도구로 그것이 적용하고, 아래로 단일 분자 수준 높은 감도, 약한 상호 작용을 감지하는 능력, 높은 처리 능력에 의해 특징입니다.

이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.

생체 내(in-vivo) 분자 간의 상호작용 네트워크를 밝히는 것은 세포 기능과 대사를 조절하는 메커니즘을 이해하는 핵심입니다. 수많은...

세포의 대사와 기능을 조절하는 메커니즘을 이해하기 위해서는 살아있는 세포 내 분자들의 상호작용 네트워크를 밝히는 것이 특히 중요합니다. 정성적 및 정량적 정보를 제공하는 점점 더 많은 방법론들이 세포 기능에 대한 총체적인 그림을 얻기 위한 원동력이 되고 있습니다. Co ip, TAP tag 또는 광가교결합(photo cross linking) 분석법을 통해 시험관 내(in vitro)에서 표적 분자들을 정제할 수 있습니다.또한, 살아있는 세포 내에서의 단백질 상호작용 분석을 위해 여러 가지 접근 방식이 설계되었습니다. 여기에는 두 가지 하이브리드 스크리닝 또는 형광 단백질의 상보성 분석법이 포함됩니다. 나아가, 이 문제를 해결하기 위해 FRET 또는 FCS와 같은 일부 분광학적 접근 방식과 비분광학적 방법들이 확립되었습니다.앞서 언급한 기술들은 대규모의 세포 집단을 기록하기 위해 개발되었으나, 다소 간접적인 방식이라는 단점이 있어 정량적 분석이 어렵습니다. 이와 대조적으로, 몇 가지 정밀한 정량적 접근 방식들이 도입되었습니다. 하지만 높은 처리량의 기능을 유지하면서 정량적 정보를 추출할 수 있는 가능성을 결합하여 확장하는 것은 어렵습니다.최근 당사는 단백질-단백질 상호작용을 식별하기 위한 새로운 개념을 개발하였습니다. 여기서 마이크로 패터닝 기술은 BSA Sci five의 마이크로 패터닝 SA 그리드에 대한 도식적 설명으로, 기능화된 유리 커버슬립 위에 인쇄되며 간격은 스트렙타비딘과 비오틴화된 리간드로 채워집니다. 대부분의 경우, 막에 대한 항체를 사용합니다.이러한 마이크로바이옴 칩 상에서 배양된 세포 내의 단백질 베이트(bait)입니다. 베이트는 항체 마이크로 패턴에 따라 세포막에 배치됩니다. 형광 표지된 두 번째 단백질 프레이(prey)와의 상호작용은 공패턴 형성(co patterning) 정도를 측정하여 탐색합니다. 이때 특정 크기와 깊이의 사각형 어레이가 형성된 실리콘 마스터 PDMS 스탬프를 사용합니다.3 µm 크기의 스탬프를 겔에서 제작하여 절단합니다. 스탬프를 100% ethanol과 2차 증류수로 헹군 후, 질소 가스로 건조시킵니다. 그 다음 0.67 mg/mL의 sci-fi와 함께 배양합니다.실온에서 30분 동안 라벨링된 BSA 용액으로 인큐베이션합니다. 에폭시 변성 유리 커버슬립도 동일한 방식으로 세척합니다. 인킹 후, 스탬프를 PBS와 물로 세척하는 과정도 동일하게 진행합니다. BSA sci five 전이를 위해.스탬프를 질소로 건조시킨 후, 즉시 유리 커버슬립 아래에 자체 무게로 눌러 30분 동안 둡니다. 마이크로 패턴 영역의 위치를 커버슬립 뒷면에 표시합니다. 스탬프를 제거한 후, 커버슬립을 접착성 실리콘 마스크로 밀봉합니다.챔버에 50 µg/mL Streptavidin 용액을 넣고 1시간 동안 배양한 후, 1 mL PBS로 헹굽니다. 이어서, streptavidin 패턴을 10 µg/mL biotinylated antibody와 함께 1시간 동안 배양하고, PBS로 세척한 후 챔버에 세포를 주입합니다. 세포가 표면에 부착되면 샘플 측정 준비가 완료됩니다.판독을 위한 유일한 요구 사항은 전반사 구성으로 시료를 조명할 수 있는 형광 현미경입니다. 이러한 시스템은 다양한 공급업체를 통해 상용 판매되고 있으며, 최근 몇 년 동안 사용자가 다루기 쉬워졌습니다. 본 연구의 검출 시스템은 에피 형광 현미경에 구축되었습니다.사용된 형광체 샘플의 선택적 형광 여기를 위해 아르곤 및 크립톤 이온 레이저가 사용되며, 100배 배율의 고 NA 오일 침강 대물렌즈를 이용한 대물렌즈 기반 전반사 구성으로 샘플을 조사합니다. 표준 필터 세트를 사용하여 적절히 필터링한 후, 형광을 후면 조사형 CCD 카메라로 이미징합니다. 판독은 시간 지연 및 통합(TDI) 모드로 수행되어 넓은 샘플 영역의 스캐닝이 가능합니다. 이를 위해 카메라의 라인 시프트에 동기화된 전동 XY 스테이지를 사용하여 샘플을 이동시킵니다.반사된 레이저 빔은 2분할 포토다이오드에 상이 맺히며, 여기서 발생하는 차동 신호를 이용하여 Z 피에조를 제어함으로써 빠르게 초점을 재조정합니다. 리더기에는 스캐닝 과정 중에 작동하는 자동 초점 유지 시스템이 장착되어 있으며, 첫 번째 스캔은 GFP의 선택적 흥분을 위해 488 nanometer에서, 두 번째 스캔은 PS Five의 선택적 흥분을 위해 647 nanometer에서 수행됩니다. 데이터 분석을 위해, 항체 포착 영역 내부와 외부의 형광 강도를 기반으로 MATLAB으로 작성된 대비 계산 프로그램을 사용합니다.수많은 세포를 빠르게 분석하기 위해 대비 수준과 그에 따른 단백질 상호작용 정도를 분석합니다. 시판되는 자동화 소프트웨어를 사용할 수도 있습니다. 예를 들어, Olympus에서 제공하는 scan R 이미징 소프트웨어가 마이크로 패터닝 실험의 대비 평가에 성공적으로 테스트되었습니다.여기에 나타난 바와 같이, 초기 T세포 신호 전달 단백질인 CD4와 LCK의 잘 알려진 상호작용을 분석합니다. 형광 LCK가 CD4 항체 코팅 영역에서 명확하게 재분포됩니다. 이후 아연 킬레이트제(zinc chelator)를 첨가하여 이 두 단백질의 주요 상호작용 부위인 아연 클라스프(zinc clasp) 구조를 파괴하면 LCK 마이크로 패턴의 대비가 감소합니다.요약하자면, 마이크로 패턴화 기술의 주요 장점은 다음과 같습니다. 국소적으로 공간 분해능이 확보된 단백질 상호작용의 정량화가 가능합니다. 또한, 살아있는 세포의 세포막 내에서 일어나는 약한 상호작용의 검출, 조절된 bait-prey 상호작용의 검출, 휴지 상태의 분석, 그리고 고처리량 분석으로의 적용 가능성 등이 있습니다.

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