C. elegans의 나일 레드 염색: 고정 동물에서 지질 방울을 시각화하는 방법

0 조회수3:34 • April 30th, 2023

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- 지질 방울을 시각화할 때, 중성 지질에 대한 세포 내 저장 소기관은 Triton X-100이 함유된 것과 같은 세제 용액을 샘플에 첨가하는 것으로 시작합니다. 이것은 벌레의 세포를 투과화합니다. 다음으로, 샘플을 적절한 농도의 이소프로판올(예: 40%)로 고정합니다.

그런 다음 샘플에 나일 레드를 첨가하고 염료가 빛에 민감하므로 빛으로부터 보호하십시오. 고정을 통해 염료가 동물 전체의 지질 방울에 접근할 수 있습니다. Nile Red는 형광 방출 스펙트럼이 지역 지질 환경의 극성에 따라 달라지는 친유성 염료입니다.

인지질과 같은 극성 지질에 노출될 때 Nile Red의 방출 스펙트럼은 더 높은 빨간색 파장에 있습니다. 지질 방울의 중성 코어에서 트리아실글리세롤 및 스테롤 에스테르와 같은 중성 지질에 노출되면 Nile Red의 방출 스펙트럼은 더 낮은 황색 파장으로 이동합니다.

따라서 황색-금색 파장 방출을 수집하는 형광 현미경의 녹색 채널을 사용하여 동물 전체의 지질 방울의 나일 레드 염색을 시각화합니다. 예제 프로토콜에서는 Nile Red 염색 절차와 고정 샘플에서 지질 방울의 이미징을 볼 수 있습니다.

- 나일 레드 지질 염색을 수행하기 위해 후기 로그 OP50 E. coli를 파종한 선충 성장 배지 또는 NGM에 플레이트를 만들고 섭씨 20도에서 초기 L4 단계까지 벌레를 성장시킵니다. 1ml의 PBST 용액으로 웜을 세척하고 웜 현탁액을 1.5ml 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.

560배 중력에서 1분 동안 기생충을 원심분리한 다음 상층액을 제거하고 현탁액에서 대장균이 제거될 때까지 PBST 세척을 반복합니다. 다음으로, 웜 펠릿에 100마이크로리터의 40% 이소프로판올 또는 ORO 염색의 경우 60%를 첨가하고 샘플을 실온에서 3분 동안 배양합니다.

- 이소프로판올의 첨가는 염색 전에 벌레의 적절한 투과화에 중요합니다.

- 560배 중력에서 1분 동안 기생충을 원심분리하고 지렁이 펠릿을 파괴하지 않고 상층액을 제거합니다.

- 원심분리 단계에서 빛 노출을 최소화하는 것이 중요합니다.

- 이제 어둠 속에서 이전에 준비된 NR 작업 용액 600마이크로리터를 각 샘플에 추가합니다. 튜브를 세 번 뒤집고 벌레와 용액을 완전히 섞습니다. 그런 다음 실온의 어두운 곳에서 2시간 동안 샘플을 배양합니다.

배양 후 벌레를 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 600마이크로리터의 PBST를 추가하고 어두운 곳에서 30분 동안 샘플을 배양하여 과도한 NR 염색을 제거합니다. 이전과 같이 샘플을 다시 회전시킨 후 약 50마이크로리터의 상층액을 제외한 모든 것을 제거합니다.

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