제브라피시 이종이식 분석법: 제브라피시 In Vivo의 종양원성에 대한 치료제의 항암 효능을 평가하는 방법

- 먼저 달걀을 페트리 플레이트에 넣고 Danieau의 용액을 넣어 갓 채취한 달걀을 보관합니다. 페닐 티오우레아를 첨가하여 색소 침착을 억제하고 며칠 동안 배양합니다. 배양 후 날카로운 집게를 사용하여 배아를 탈척하고 더 자라게 합니다.

다음으로, 배양 플라스크에 원하는 수의 암세포를 파종하고 밤새 배양합니다. 이제 항암 화합물을 추가하고 더 배양하십시오. 배양 후 형광 세포 추적기 염료를 첨가하면 세포막에 결합하여 세포를 염색합니다.

다음으로, 세포 해리를 위해 트립신을 첨가하고 pH를 평가하는 절차 전에 페놀 레드 PBS 용액에서 세포를 희석합니다. 마취된 제브라피시 배아를 한천 플레이트에 장착합니다. 이제 미세모세관에 암세포 현탁액을 넣고 배아의 난황낭에 주입합니다.

배아를 Danieau's solution을 함유한 배양 플레이트로 옮기고 추가로 배양합니다. 다음으로, 유리 슬라이드에 배아 몇 개를 이식하고 메틸셀룰로오스를 첨가하여 고정시킵니다. 슬라이드를 형광 현미경 아래에 놓고 소프트웨어를 사용하여 종양 크기를 정량화합니다.

항암 화합물은 일반적으로 암세포의 종양 형성 능력을 억제합니다. 다음 프로토콜에서는 BH3 모방체와 함께 하이드록시쿠마린이 in vivo 제브라피시의 종양 형성에 미치는 영향을 연구할 것입니다.

- A549 세포를 파종하고 텍스트 프로토콜에 따라 화합물로 배양한 후 처리 종료 24시간 전에 형광 세포 추적기 염료 CM-Dil의 4마이크로몰을 첨가하여 세포를 염색하고 2시간 동안 배양합니다.

배양 후 0.05% 트립신 EDTA를 사용하여 세포를 트립신화합니다. 그런 다음 주입하기 전에 50 마이크로 리터의 페놀 레드 PBS 용액에 10에서 6 번째 세포를 희석하십시오. 암세포의 미세주입을 수행하려면 다음 프로그램 설정을 사용하여 유리 모세관을 1.0mm 당깁니다.

주사기를 사용하여 모세관을 절단하여 날카로운 모서리를 만듭니다. 그런 다음 미세 모세관에 20 마이크로 리터의 세포 페놀 레드 용액을 로드합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 제브라피쉬를 마취한 후 3-5회 주사를 통해 6-10나노리터를 주사하여 100-200개의 세포를 난황낭에 주입합니다.

- 미세주입은 정확한 양의 세포가 주입되고 주입 부상이 최소화되며 이산화탄소 압력이 물고기의 치사율을 피하기 위해 최적이어야 합니다.

- 주입 후 PTU가 함유 된 신선한 Danieau 용액 5ml에서 물고기가 10-30 분 동안 회복되도