Name: 원자력 교통 단일 분자 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 학습하세요 단일 분자 현미경을 이용한 세포핵 수송 메커니즘 분석 방법을. 형광 표지 화물 분자의 핵공을 통과하는 운동을 시각화하여 수송 역학을 정량적으로 분석하고 세포 기능 이해에 필요한 통찰을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 프로젝트는 연구 능력 향상 그랜트 (볼링 그린 주립 대학)에 의해 지원되었다.

1. 단일 분자 실험의 셀룰라 시스템의 준비 <ol><li> 사전에 적어도 하나의 주, 37 ° C를 해동 5 ML 미디어 25cm 두 문화 플라스크에 넣어 주식에서 헬라 세포 라인의 새로운 문화를 시작, 37에서 세포를 품어 ° C 이내에 5 % CO 2 24 시간 보육 및 세포에 대한 최적의 조건을 제공하기 위해 최소한 3 번 나눠. 그러나 세포는 크게 천천히 자신의 성장 속도 proclivity으로 인해 20 개 이상의 시간을 분할해서는 안됩니다. 헬라 세포는 이전에 다음 ID로 유전자 핵 봉투 기공 막 단백질 POM 121에 융합 GFP를 (녹색 형광 단백질)하도록 설계되었습니다. 그것은 핵 봉투의 정확한 현지화 필요합니다. </li><li> 하루 전에 실험, 단일 분자 실험을위한 세포는 멸균 페트리 접시에 배치 autoclaved 커버 슬립에 전파해야합니다. coverslip는 4.5 g / L의 포도당, 862 MG / L GlutaMAX - I, 15 MG / ML 페놀 레드, 100 U / ML 페니실린, 100μg/mL와 보충 DMEM (Dulbecco의 수정 이글 배지, 그랜드 아일랜드, NY)에서 일시 중지되어야합니다 스트렙토 마이신와 10 %의 신생아 송아지 혈청. 문화의 볼륨 균일하게 표면 전체를 통해 분산 커버 슬립 당 ​​1mL,해야합니다. 커버 풀렸는데 이러한 배양 접시는 다음 CO 2 배양기에 배치 사전 실험에 24 시간 동안 보관됩니다. 단일 분자 실험에 적합하기 위해 세포 배양하기 위해서 커버 슬립에 confluency 세포는 핵 수송을받은 관심 세척 버퍼 및 단백질에 대한 좋은 자유를 제공하는 70 %를 넘지 않아야합니다. </li><li> 실험의 날, 흐름 챔버 스는 최고의 커버 스페이서로 실리콘 기름의 두 라인과 함께 미끄럼 추가하여 건설되었다. 이것은 세포가 준비하는 동안 밖으로 건조하지 않도록하기 위해 필수적입니다. 우리는 보통 표지에 만든 두 챔버 스가 실험을 위해 두 개의 서로 다른 조건을 허용하도록 살짝해야하는 것을 선호합니다. 상단 커버는 약 6mm2가 Kimwipe에 거꾸로 놓여 있었다 될 수있는 다이아몬드 칼로 절단 유리 커버 슬립의 작은 조각 버렸는데. 실리콘 그리스의 두 라인은 잘게 단단히 그리스 비드의 크기를 제어하는​​ Parafilm와 연결된 피펫 팁을했다 10 ML의 플라스틱 주사기로 커버 전표의 그 가장자리를 따라 배치되었다. </li><li> 헬라 세포 코팅 슬라이드 다음 드립 건조 및 가정 가공 알루미늄 프레임에 접착제로 그리스와 함께 탑재했습니다 - 성격, 현미경 샘플 홀더에 슬라이드를 개최 하였다. </li><li> 그리스의 두 라인 상단 커버 전표는 다음 흐름 챔버를 형성, 세포 - 코팅 슬라이드를 통해 거꾸로 지적 핀셋 그리고 함께 체포되었다. 상대적으로 회사 첨부 파일이 coverslip의 기름칠 가장자리를 통해 부드럽게 눌러 만들어졌다. </li><li> 우리가 한 셀 - 코팅 슬라이드에 두 개의 별도의 방을 만들므로 그것은 교차 오염을 방지하기 위해 좋은 씰링을 제공하는 것이 필수적입니다. 이러한 목적으로 실리콘 그리스의 여러 라인이 떨어져 인감 가기에서 슬라이드의 하단에 실 사이에 적용되었습니다. 그리스의 여러 라인 또한 챔버의 외부 측면에 넣어했다. </li><li> DMEM 미디어 다음 밖으로 건조로부터 세포를 방지하기 위해 흐름 챔버에 추가되었습니다. 솔루션 흐름은 흐름 챔버의 출구 쪽의 유체를 흡수하는 작은 조각 종이 필터에 의해 추진되었다. 꾸준한 손으로, 솔루션 micropipette하여 한 손으로 흐름 챔버 한쪽으로 동시에 추가할 수, 및 필터 종이로 반대편에 흡수. </li><li> 건설 후, 슬라이드의 아래쪽은 두 번 물로, 침수 솜 밀고 면봉로 씻은 다음 두 번 100 % 에탄올로.했습니다 </li><li> 슬라이드가 현미경에 장착되면, 세포는 2 X 25 μL 수입 버퍼 (20 MM의 Hepes, 110 MM KOAc, 5 MM NaOAc, 2 MM MgOAc, 1 MM EGTA, 산도 7.3)로 세탁. 세포가 수입 버퍼 2 X 25 μL 40 μg / ML digitonin와 ~ 2 분 동안 permeabilized 2 X 25 μL 수입 버퍼 (20 MM의 HEPES, 110 MM KOAc, 5 MM NaOAc, 2 MM MgOAc, 1 ㎜로 다시 세탁 360 KDA), EGTA, 산도 7.3) 1.5 % polyvinylpyrrolidone (PVP와 함께 보충. 그것은 밝은 필드를 사용하여 실시간으로 permeabilization을 모니터 할 수 있습니다. 핵의 삼투 팽창을 방지하기 위해 digitonin 후 PVP는 모든 수입 버퍼 솔루션에 포함되었습니다. 함께 제어 세포질 환경에 그대로 핵은, 우리는 단계로 복잡한 핵 수송 단계를 명료하게하다 수 있도록 크게 단순화된 교통 시스템을 제공합니다. 시스템의 실시 이전 앙상블과 단일 분자 실험은 핵​​ 수송 큰 통찰력을 제공하고 있습니다. </li></ol> 2. 핵 전송 실험에 필수적인 단백질의 준비 <ol><li> 일반 세균 변화를 통해 E.coli (JM109)의 특별한 변종은에 책임이있는 유전자를 overexpress 수 있도록 설계되었습니다관심 상기 단백질의 생산하며 -80 ° C.에 재고가 유지됩니다 (NLS - 2xGFP 위해 우리는 Invitrogen로 pTrcHisB 벡터를 사용). E. 대장균 세포를 표현하는 형광등이나화물 단백질의 냉동 주식 loopful 또는 ~ 50 μL는 암피실린의 5μL를 추가로 LB 미디어의 5mL로 전송 (U 1000) 37에서 야간 흔들어 ° C를 225 rpm으로 함께 aerobically 성장하고 있습니다. </li><li> 24 시간 후에 포화 문화 500 μL는 LB 미디어 500 ML에 전송되고 37 ° C 배양기에서 떨면서 5-6시간 250 μL IPTG의 추가 (이소 프로필 _ - D - 1 - thiogalactopyranoside) 다음과 같은 다른에 대한 incubated 5~6시간. IPTG는 lacZ 유전자가 관심과 IPTG의 유전자로 대체됩니다 락 오페론의 전사가 다음 유전자 발현을 유도하는 데 사용되는 트리거되는 유당 대사이기 때문에 그것이 필요합니다. </li><li> 문화 다음 15 분 동안 12,000 rpm으로 냉각 고속 원심 분리기에 걸려든되고 뜨는가 삭제됩니다. 전지는 그 볼륨이 펠렛의 1g 당 10 ML을 기반으로해야합니다 CelLytic B (친화력 정화 및 분석에 적합 단백질의 신속하고 효율적인 추출에 CelLytic B 결과.) 40 ML에 resuspended 있습니다. 메르 캅 토 에탄올 28 μl는 세포 용해 후 관심 단백질 소화의 프로 테아제를 비활성화 이황화 채권 phenylmethanesulphonyl 불화 400 μl을 깰에 추가됩니다. 단백질 추출물은 대상에 대한 분석을하기 전에 저하하지 않도록하기 위해서는, "프로 테아제의 칵테일"도 (2 MG / ML 트립신 억제제 400 μL 0.2 MG / ML 류펩틴의 0.2 MG / ML pepstatin A. 400 μL 400 μL)이 추가됩니다 관심. 우리는 다음 400 μL 1M 졸을 추가, 5 phosphodinucleotide 및 oligonucleotide로 원치 않는 단일 및 이중 좌초된 DNA를 저하하는 데 사용 DNase I의 크로마 토그래피 컬럼 및 1mM의 구슬의 표면에 부착된 니켈 이온에 바운드 태그 단백질을 elute하는 데 사용됩니다 조각. </li><li> 냉각 원심 분리기에서 60 분 10,000 RPM의 반응에 대한 적절한 시간, 스핀을 허용하는 30 분간 얼음 어둠 속에서 혼합물을 저어. 뜨는을 수확하고 크로마 토그래피에 대비하여 3 분 최대 속도 microfuge의 원심 분리기 튜브의 회전 및 용해 버퍼로 세척, 혼합물이 될 때까지 회전 및 세탁을 반복하여 니켈 NTA (Qiagen의 니켈 - nitrilotriacetic 산성 Superflow)으로 주입을 수행 모든 푸른 색조의 취소합니다. 천천히 60 분 정도 얼음에 어두운 용기에 표시된 혼합물을 저어. </li><li> 칼럼 크로마 토그래피는 다음과 같이 12 분수 흐르는 수행합니다. 첫 번째 소수는 이전 단계에서 니켈 - NTA로 혼합 10 ML의 뜨는의를 통해 흐름입니다. 두 번째는 용해 완충액 10 ML (50 MM 나 - 인산, 300 MM NaCl, 20 MM 이미다졸, 산도 8.0)이며, 셋째 열 버퍼의 ML (10 MM 이미다졸, 100 MM NaCl, 산도 8.0), 넷째 나머지입니다 용출 버퍼의 0.5 ML (250 MM 이미다졸, 100 MM NaCl, 산도 8.0) </li><li> SDS - PAGE의 polyacrylamide 젤을 준비하고 분수 4 μL와 배 SB (300mM 트리스 6.8, 25 % BME 10 % SDS, 50 % 글리세롤) 1 μL를 혼합하여 샘플을 준비합니다. 표준 우리는 Invitrogen 100 이하의 DNA 사다리를 사용했습니다. 로드하기 전에 우리가 5 분 동안 우리의 샘플을 삶아. 로딩 후에 우리가 60 분 동안 120V에서 젤을 실행. 그렇다면, 스테인드 destained 그리고 마지막으로 80C에서 2 시간 동안 특수 젤 건조기에서 건조. </li><li> 우리는 다음 겔에서 결과를 조회하고 최상의 결과를 굴복 분수를 위치하고 있습니다. 우리의 관심의 단백질에 따라 밴드는 단백질의 크기에 각각 위치한다. 이 분수는 MonoQ 및 Superdex 200 (애머스햄 Pharmacia)을 추가로 단백질 정화를 위해 선택되어야합니다. </li><li> 농도는 모든 시간을 5 분 14 RPM에서 10K의 기공 크기 Nanosep 필터에서 가장 집중적으로 분수를 회전 용출 버퍼로 세척하여 수행됩니다. 그것은 더 이상 단백질 라벨 절차에 대한 BSA 분석을 이용하여 최종 단백질 농도를 결정하는 것이 필요합니다. </li><li> NLS - 2xGFP의 본질 녹색 형광은 그 사진 안정성 가난하고 overlapped 스펙트럼 세포 autofluorescence로 인해 핵 교통 단일 분자 이미징을위한 이용하실 수 없습니다. 따라서, 우리는 TCEP 트리스 (2 감소 후 50 MM의 인산 나트륨, NaCl 150 MM의 실온에서 2 시간 시스테인 반응 유기 염료 (분자 프로브에서 Alexa555 또는 알렉사 647 maleimide)의 초과와화물 분자를 라벨 - 20 분 carboxyethyl). 반응은 2 - 메르 캅 토 에탄올과 침묵되었고, 단백질 솔루션은 무료 염료를 제거하는 dialyzed했다. </li></ol> 3. 단일 분자 현미경 <ol><li> 우리 현미경 세트는 최대 1.4 NA 100x 기름 침지 목표 (UPLSAPO 100XO, 올림푸스)을 갖춘 올림푸스 IX81, 35 MW 633 nm의 GFP 필터와 수은 램프가 설정 He - Ne 레이저 (Melles Griot),에 포함되어 있습니다 칩 증 이득 전하 결합 소자 카메라 (캐스케이드 128 +, 로퍼 과학)와 일데이터 수집 및 처리를 위해 전자 Slidebook 소프트웨어 패키지 (지능형 이미징 혁신). 광학 초퍼 (뉴 포트)은 레이저 여기의 온 - 오프 모드를 생성하는 데 사용되었다. GFP 및 Alexa647 형광는 각각 수은 램프와 633 nm의 레이저에 의해 흥분했다. 녹색과 빨간색 형광 방출은 이색성 필터 (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) 및 배출 필터 (NF01-405/488/561/635-25X5에 의해 필터링 같은 목적에 의해 수집되었다. 0 Semrock)과 동일한 CCD 카메라에 의해 몇 군데. </li><li> 단일 분자 실험에서 우리는 수송 시간 이상으로 단일화물 분자의 형광 photobleaching 시간을 설정합니다. photobleaching 시간을 확인하려면, 0.1 NM화물 분자가 아닌 특정 흡수로 인해 30 분 후에 슬립과 고정되어되는 유리 커버에 도금입니다. 그런 다음, 형광의 시간 과정은 측정됩니다. 관심 photobleach 시간의 단백질에 따라 그러므로 maleimides, 조도 및 조명 면적 반응하는 능력을 cysteins의 숫자에 따라 달라집니다 예비 photobleaching를 유도하지 순서대로 조정할 수 있어야하며 알렉사 647 디스플레이 표시되는화물 분자를 확보 cargos가 NPCs와 상호 작용 이상에 대한 형광. </li><li> permeabilized 세포의 수입 실험은화물과 필수적인 교통 cofactors 함께 추가되었습니다. 일반 수입화물 반응이 1 ㎜ GTP, 0.5 μm의 포함된 Importin을, 0.5 μm의 Importin - 1, 2 μm의 달아 및 수동 전송 10KDa Dextran의 촉진 수송 및 0.1 nm의 1 μm의 NTF2 .. 형광등화물 농도가 대량 실험에서&gt; 100 nm의되었고, 단일 분자 assays 100 오후 ~. 이 농도에서화물의&gt; 99%는 Importin와 Importin과 단지를 형성 것으로 예상했다. 전송 속도는 epifluorescence (단 상대 속도가 중요하게 여긴다면) 또는 공촛점 형광 현미경 (절대 속도를 원하는이라면)에 의해 감시되었다. </li><li> 먼저 핵 봉투의 위치는 NE의 사진을 찍을하기 위해 GFP 필터의 집합과 HBO 수은 램프를 매력으로 넓은 필드 epifluorescence 현미경에 의해 결정되었다. 행 또는 열 내에있는 픽셀 농도는 대략 직각 NE에 아르 가우스와 맞는 지. 픽셀 농도의 특정 집합에 대한 가우스의 최고 순위는 해당 행 및 열에 대한 NE 위치 여겨졌다. 이러한 Gaussians 일련의 정상 위치는 다음 전체 이미지 내에서 NE의 경로를 항복, 2 급 다항식과 맞는 지. </li><li> NE가 현지되면 완전히 photobleached 때까지, 그것이 633 nm의 그 - NE 레이저를 사용하는 모든 autofluorescence 제거하는 것이 필수적입니다, 보통 이상의 60 초 충분합니다. </li><li> 샘플 분자 다음 PVP의 1.5 % 용액에 보관해야하며 혼합 25 L의 볼륨 흐름 챔버에 추가하고 필터 종이 심지를 적용 챔버를 통해 끌려. 포커스가 쉽게 어떤 격렬한 운동에 의해 중단될 수 수 있기 때문에 완전한 치료는 바로 핵 봉투 지방화 후 permeabilized 세포에 수입화물 단백질 이외에 주의해야한다. </li><li> 즉시화물 분자는 He - Ne 레이저는 진입중 분자의 수송 궤도를 조명하는 데 사용된 633 나노미터를 추가로. 광학 초퍼 (뉴 포트)은 고전력 레이저의 밀도뿐만 아니라 비 photobleached 단일 분자의 새로운 부분은 NE 접근 수 있도록하는 photobleaching 인해를 피하기 위해 약 5 Hz에서에 참여해야합니다. 단일 분자 translocations의 비디오 시리즈는 2,500 Hz에서 최대 갈 수있는 고속 CCD 카메라로 찍은한다. </li></ol> 4. 대표 결과 제대로 수행, 우리 프로토콜은 우리가 permeabilized 헬라 POM 121 세포에서 핵 기공 복합과 상호 작용하는 하나의화물 분자의 translocation을 보여주는 동영상 일련의를 수집하는있었습니다. (그림 1). 우리는 이미지로 설정하고 안정 GFP - POM121을 표현 digitonin - permeabilized 헬라 세포에있는 NPC를 통해 dextran 분자의 과도 수송 단계를 추적할 수 있습니다. 세포는 표시 dextran 분자의 낮은 농도와 incubated했다. 핵의 적도 비행기는 488 - NM 수은 램프 라이트에 의해 흥분 GFP 형광 녹색 반지의 명확한 이미지를 초점으로 가져온 것입니다. GFP - NE의 오랜 노출은 NE의 한가운데 비행기를 집중하기 위해 우수한 신호 대 잡음 (SNR) 비율을 얻는 우리에게 있습니다. 이전 10 KDA dextran 분자 500 또는 1000 Hz의 탐지 프레임 속도로 약 20-40 나노미터의 공간 해상도를 가진 약 2 MS 내에서 NE 통해 확산을 발견했다. 이러한 spatiotemporal 해상도는 수동 확산에 대한 더 많은 공간 정보를 명료하게하다하는 것만으로는 충분하지 않습니다 NPC를 통해 dextran 분자만이 1-2 보급 단계 캡처 수 있습니다. 더 나은 spati와 NPC 사이 dextran 분자보다 좋은 단계를 캡처하려면더 잘 확산 단계를 캡처 2,500 Hz의 빠른 감지 프레임 속도를 적응 (I) 및 (2)을 구하는 하나의 분자에서 더 많은 광자를 자극 높은 조명 광학 밀도를 고용하기 : otemporal 해상도, 우리는 두 가지 주요 개선을 실시했습니다 높은 공간 해상도. 이러한 개선은 우리가 12 nm의 400 MS의 spatiotemporal 해상도 100 kW 급 / cm 2 조사량에서 633 - NM 레이저 빛으로 NE 전체 alexa647 - 표시 dextran 분자의 과도 보급의 여러 단계를 캡처할 수 있습니다. 그림 1에 표시된, dextran 분자의 전형적인 전송 사건의 스틸 이미지의 연속이 기록되었습니다. 개인 진입중 dextran 분자의 공간적 탄도를 추적함으로써, NE 통해 확산의 고급 단계는 구별되었다. 우리는 NE와 상호 작용 이벤트의 약 30 %가 발생하고 대상 구획으로 인정이있다는 것을 발견했습니다. 그 중에서도, 세포질에서 NE로 이동 dextran 분자는 두 목적지가 : NE 통해 diffusing 후 핵의 끝을하거나 유사한 상황은 수출 이벤트 발생 NE와 상호 작용 후 세포질로 이동 : 핵부터 dextran 분자 세포질을 입력하거나 NE와 상호 작용 후 핵으로 확산. 이러한 이미지 시리즈는 NPC에 관해서뿐만 아니라 NPC를 통해 분자의 면만 시간에 시간적 정보와 단일 분자의 공간적 위치에 대한 정보를 포함합니다. NE의 주변 dextran 분자의 탄도를 분석함으로써, 전송 시간, 효율성 및 입구 주파수가 결정하실 수 있습니다. 우리 연구의 운송 시간은 가져 오거나 내보내기 시간으로 확인할 수 있습니다. 그들은 평균 가져 오거나 내보내기를 받아야 NPCs 이내 dextran 분자 시간을 머물러로 정의했다. 가져 오거나 내보내기 효율성이 완료 가져 오거나 완전하고 불완전 이벤트의 합계를 통해 수출 사건의 비율로 정의했다. 가져 오거나 내보내기 입구 주파수는 두 번째 동안 NE과 상호 작용 분자의 개수를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2040/2040fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. NE 통해 dextran 분자의 전형적인 전송 이벤트의 선택된 비디오 프레임. (A) 세포질 - 투 - 핵 이벤트. 단일 dextran 분자 (붉은 반점)은 NE (녹색 픽셀 라인)와 상호 작용, 세포질에서 시작하고, 핵에 끝났다. 이벤트 (파란색 라인 및 오픈 도트)의 궤도가 결정되고 NE (블랙 라인)로 겹쳐 있었다. 녹색과 빨간색 라인은 세포질과 핵 쪽 NE에서 100 nm의 - 거리를 나타냅니다. C, 세포질. N, 핵. 스케일 바 : 2mm. (B) 세포질 - 투 - 세포질 이벤트. (C) 핵 대 핵 이벤트. (D) 핵 - 투 - 세포질 이벤트.

<ol><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li>
<li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

케어는 실험 도중 NE 및 단일 분자의 적절한 colocalization 확보로 이동해야합니다. 신호가 낮은 가난한 라벨 또는 photobleaching로 인해 특히 때 높은 신호 잡음 비율을 제공하는 것도 중요합니다. 현지화 정밀도는 배경 잡음 (아웃 - 오브 - 초점 형광, CCD 판독 잡음, 어두운 현재 및 기타 요인으로 인한)에 의해 제한됩니다.

원자력 교통 단일 분자 이미징

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

단일 분자 형광 현미경 접근의 유틸리티는 지난 10 년간 생물 학적 반응을 이해하는데 큰 소용이 될 입증되었습니다. 세포 내에서 깊은 높은 시간적 및 공간적 해상도로 분자 상호 작용의 조사로 인해 각각의 분자에서 발생하는 본질적으로 약한 신호에 도전 남아있다. 양 외가 최근 작동합니다. 좁은 - 현장 epifluorescence 현미경은 단일 분자 수준에서 nucleocytoplasmic 운송 시각화를 허용 보여주었다. 신호 의존과 독립화물 분자의 단일 분자 접근법 등 핵 수송 시간과 효율 중요한 운동에 의해 얻은되었습니다. 여기 우리는 0.4 MS 12 NM의 향상 spatiotemporal 해상도와 방법론의 접근 방식에 프로토콜을 설명했다. 향상된 해상도는 우리 반 그대로 세포의 핵 기공 단지 (NPC)를 통해 과도 적극적인 전송 및 수동 확산 이벤트를 캡처 수있었습니다. 이 방법은 세포 내의 다른 바인딩과 인신 매매 사건을 elucidating에 사용될 예정입니다.

단일 분자 현미경은 핵 수송에 새로운 통찰력을 제공 approch.

단일 분자 형광 현미경법의 유용성은 ...에 걸친 생물학적 반응을 이해하는 데 매우 유용한 것으로 입증되었습니다.

세포의 핵막에는 약 2000개의 핵공 복합체가 포함되어 있어 RNA, 리보솜, 특정 단백질, 탄수화물 및 신호 분자와 같은 수용성 분자의 수송이 가능합니다. 투과성 세포에 표지된 화물 분자를 추가함으로써, 핵공을 통한 단일 분자의 이동을 형광 현미경으로 시각화할 수 있습니다. 국소화뿐만 아니라 수송 시간, 유입 및 유출 효율, 진입 빈도와 같은 시공간적 특성을 결정하기 위해서는 타임랩스 이미지가 필요합니다. 안녕하세요, 저는 볼링그린 주립대학교 생물학과 단일 분자 현미경 실험실의 박사 과정생 Alex ov입니다.저는 단분자 현미경 연구실의 석사 과정 학생인 Asha P Shema입니다. 저는 Juma입니다. 이곳 단분자 현미경 연구실의 박사후 연구원입니다.오늘은 HeLa 세포의 핵공 복합체(nuclear PO complexes)를 통한 핵 수송의 단일 분자 이미징 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 핵공 복합체를 통한 다양한 분자의 전위(translocation)를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.핵 수송 실험을 위한 단백질을 준비하려면, 핵 화물 단백질 생산에 관여하는 유전자를 발현하는 JM 1 0 9 E coli를 통상적인 방법으로 형질전환하여 LB 배지에서 배양하고 IPTG로 유도합니다. 세포가 광학 밀도 0.7에서 0.8의 대수 증식기에 도달하면, 4 °C에서 6,000 ×g로 15분 동안 배양액을 원심분리하여 상층액을 제거하고 펠릿의 무게를 잽니다. 그 다음, 친화성 정제 및 분석에 적합한 단백질을 추출하기 위해 펠릿 1 g당 10 mL의 Celtic B에 세포를 재현탁합니다.다음으로, 적절한 양의 protease cocktail과 beta-mercaptoethanol을 DNAs에 첨가합니다. 혼합물을 얼음 위에서 암소 상태로 30분 동안 교반합니다. 그런 다음 4°C에서 25,000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 크로마토그래피 준비를 위해 상층액을 새 병으로 옮깁니다. 4개의 마이크로 원심분리 튜브에 400 µL의 nickel NTA와 아세톤을 넣습니다. 16,000 ×g에서 3분 동안 원심분리합니다.상층액을 버립니다. 그런 다음 400 µL의 용해 세척 완충액(lysis wash buffer)을 추가합니다. 최종 세척 후 이전 세척 단계를 3회 반복합니다.nickel NTA를 용해 버퍼(lysis buffer)에 다시 현탁하고, 4개의 튜브에 든 내용물을 모두 세포 상층액이 담긴 병에 넣습니다. 결과 혼합물을 얼음 위 어두운 용기에 담아 60분 동안 천천히 교반합니다. 형광 단백질의 광퇴색을 방지하기 위해 ecno pack 크로마토그래피 컬럼을 알루미늄 호일로 감싸 준비합니다.또한 컬럼 아래의 랙에 12개의 수집 튜브를 배치합니다. 혼합물을 60분 동안 교반한 후, 10 mL의 SNA 니켈 NTA 혼합물을 로딩하고 완전히 통과하도록 둡니다. 분획 수집을 시작합니다.다음으로, lysis wash buffer 10 milliliters를 첨가합니다. 버퍼가 완전히 통과하도록 둡니다. 그런 다음 IZO buffer 10 milliliters를 첨가하고 통과시킵니다.분획 수집을 계속합니다. 다음으로, 0.5 mL의 용출 완충액을 흘려보내며, 총 12개의 분획이 모두 수집될 때까지 용출 완충액을 반복해서 흘려줍니다. 어떤 분획에서 단백질 농도가 가장 높게 나타나는지 확인하기 위해, 각 분획 4 µL를 페이지 겔(page gel)에 전기영동하고 코마시 염색(Coomassie stain)을 수행합니다.표준 절차에 따라 가장 농도가 높은 분획들을 혼합하고, 용리 버퍼(elution buffer)로 사전 세척한 공극 크기 10 kilo daltons의 nano step 필터에 500 µL를 첨가합니다. 16,000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 단백질을 농축합니다. 버퍼를 버리고 남은 단백질 분획을 저어준 후, 필터 원심분리기(filter centrifuge)에 500 µL를 추가로 첨가합니다.선택된 모든 분획에 대해 동일한 과정을 반복합니다. 다음으로, 용출 버퍼를 사용하여 농축된 단백질의 최종 부피를 약 50 microliters로 맞춥니다. 그 후 마이크로 피펫으로 필터 표면에서 조심스럽게 저어 수집하면서, 초고순도 단백질을 얻기 위해 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 계속해서 실행하고 최종 단백질 농도를 측정합니다.다음으로, Alexa 555 또는 Alexa 647과 같이 과량의 보조 반응성 유기 염료로 화물 분자를 표지합니다. GFP의 고유한 녹색 형광은 광안정성이 낮고 세포 자가 형광과 스펙트럼이 겹치기 때문에 핵 수송의 단일 분자 이미징에 사용할 수 없으므로 이와 같이 수행합니다. 표지된 단백질은 실험 하루 전에 25 µL씩 여러 분량으로 나누어 -80 °C에 보관해야 합니다. 멸균된 35 mm 페트리 접시에 오토클레이브 처리된 커버슬립을 놓고, 그 위에 9 mL의 DMEM을 피펫으로 분주합니다.다음으로, 1 mL의 세포 배양액을 피펫으로 취해 사용 중인 커버슬립 위에 균일하게 떨어뜨립니다. 여기에서 사용된 세포는 GFP가 표지된 pore membrane protein POM 1 21을 발현하도록 이전에 유전적으로 조작되었습니다. 디쉬를 이산화탄소 배양기에 넣고 12시간 동안 배양합니다.실험 당일, 플로우 챔버 준비를 시작합니다. 다음으로 인큐베이터에서 세포가 코팅된 슬라이드를 꺼내 물기를 제거하고 건조시킨 후, 진공 그리스 접착제를 사용하여 장착합니다. 자체 제작한 알루미늄 프레임에 장착하며, 준비 과정 동안 세포가 건조해지지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.10 milliliter 플라스틱 주사기를 사용하여 핀셋으로 커버슬립 양쪽에 실리콘 두 줄을 바릅니다. 실리콘 두 줄이 도포된 작은 준비된 커버슬립을 들어 올려 세포 코팅 슬라이드 위에 뒤집어 놓고 살짝 눌러 플로우 챔버를 형성합니다. 하나의 세포 코팅 슬라이드에 두 개의 개별 챔버를 준비하는 경우, 교차 오염을 방지하기 위해 밀봉이 잘 되었는지 확인하는 것이 필수적입니다.그 후 슬라이드의 상단부터 하단까지 챔버 사이에 실리콘 그리스를 여러 줄 도포하여 챔버들을 서로 밀봉합니다. 또한, 챔버의 외측면에도 그리스를 여러 줄 도포합니다. 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위해 유체 챔버에 DMEM을 추가합니다.다음으로, 면봉을 사용하여 슬라이드 바닥을 물로 두 번, 이어서 100% ethanol로 두 번 세척합니다. 프레임을 현미경에 장착합니다. 25 µL의 transport buffer를 유동 챔버(flow chamber)에 넣고 흡수시켜 두 번 세척합니다.출구 쪽에 작은 거름종이 조각을 적용하여, digitonin 25 µL로 약 2분 동안 세포를 1회 투과시킵니다. 투과 과정은 명시야(brightfield)를 사용하여 실시간으로 모니터링해야 합니다. 마지막으로, 핵의 삼투성 팽창을 방지하기 위해 1.5% polyvinyl pyrrolidone(PVP)가 첨가된 transport buffer 25 µL로 세포를 세척합니다. 현미경으로 투과된 세포를 찾아 밝은 녹색 형광 링을 확인합니다.그 다음 세포의 적도 영역에 초점을 맞추고 형광 화물 분자를 첨가하기 전의 이미지를 캡처합니다. 핵막 영역을 선택하고 633 nm 헬륨-네온 레이저로 완전히 광퇴색될 때까지 조사하여 모든 자가형광을 제거합니다. 일반적으로 2분 이상의 시간이 소요됩니다.1.5% PVP가 포함된 운송 버퍼로 희석한 표지된 덱스트란 샘플 25 µL를 흐름 챔버에 추가하고, 필터 페이퍼 심지를 적용하여 챔버 전체에 퍼지게 합니다. 투과성 세포인 수송 화물 단백질을 추가할 때는 주의해야 하는데, 격렬한 움직임으로 인해 초점이 쉽게 흐트러질 수 있기 때문입니다. 광퇴색을 방지하고 광퇴색되지 않은 단일 분자의 새로운 부분이 핵막에 접근할 수 있도록 광학 초퍼를 약 5 Hz로 작동시키십시오.샘플 분자를 첨가하자마자 핵공 복합체를 통한 전위 과정을 포착할 수 있도록 단일 분자 전위 영상 시리즈를 획득해야 합니다. 전위되는 분자의 이동 경로를 조명하기 위해 633 nm 헬륨-네온 레이저를 사용하십시오. 이 프로토콜을 통해 핵공 복합체와 상호작용하는 단일 화물 분자의 전위를 보여주는 일련의 영상을 수집할 수 있습니다.투과성 실험에서, 그는 1.21 cells를 사용했습니다. 개별 dextran 분자의 공간적 궤적을 추적함으로써, 핵막을 통한 확산의 미세한 단계들을 구별할 수 있습니다. 여기서는 세포질에서 핵으로 이동하는 이벤트가 나타나 있으며, 빨간색 점으로 표시된 단일 dextran 분자가 세포질에서 시작하여 녹색 픽셀 선으로 표시된 핵막과 상호작용한 후, 이곳 핵 내부에서 끝나는 모습을 보여줍니다.덱스트란 분자가 세포질에서 시작하여 핵막과 상호작용한 후 다시 세포질로 돌아왔습니다. 이 예시에서는 덱스트란 분자가 핵에서 시작하여 핵막과 상호작용한 후 다시 핵으로 돌아왔습니다. 그리고 여기서는 덱스트란 분자가 핵에서 시작하여 핵막과 상호작용한 후 세포질에서 끝났습니다.개별 transing dextran 분자의 공간적 궤적을 추적함으로써, 핵막을 통한 확산의 미세한 단계를 구분할 수 있습니다. 파란색 선과 빈 점으로 표시된 이벤트의 궤적을 결정하여 검은색 선으로 표시된 핵막에 겹쳐 놓았습니다. 초록색과 빨간색 선은 각각 세포질 쪽과 핵 쪽에서 핵막으로부터 100 nanometer 떨어진 거리를 나타냅니다.지금까지 400 $\mu\text{s}$의 시간 해상도와 10 $\text{nm}$의 공간 해상도로 핵공 복합체를 통한 단일 분자의 전위를 시각화하는 방법을 살펴보았습니다. 이 과정에서는 가능한 최대의 신호 대 잡음비를 확보하는 것이 중요하며, 초점이 쉽게 흐트러질 수 있으므로 단일 분자 실험을 수행하는 동안 매우 주의해야 한다는 점을 기억하시기 바랍니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

single-molecule-imaging-of-nuclear-transport

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기에서 우리는이 광학적으로 포획 된 마이크로 스피어 사이 일시 중지 하나의 DNA 분자와 상호 작용하는 하나의 형광 표지 단백질 분자를 검출하기위한 장비 및 방법에 대해 설명합니다.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

우리 화학 요소 존재 원래의 인간 세포에 그들의 생체 외에서 정량화의 검출을 위한 절차를 설명합니다. 메서드는 모든 셀 종류에 적합 하 고는 금속 산화물 나노 입자 노출 체 외에서 다음 단일 셀에 정량적 화학 분석에 특히 유용.

제자리에서 검색 및 핵 현미경 분석을 사용 하 여 금속 산화물 나노 입자의 단일 셀 정량화

이 프로토콜은 NLS-NES-GFP 단백질의 핵 임포트에서 실시간 변화를 정량화함으로써 모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 핵 세포질 수송 속도를 민감하게 측정하는 방법을 설명합니다.

모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 실시간으로 핵 세포질 수송을 측정하는 분석

이 프로토콜에는 포스터 공명 에너지 전달, 및 현미경 이미징 형광 수명에 따라 무 단백질의 복잡 한 형성의 양적 시각화에 대 한 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다.

형광 일생 화상 현미경 검사 법에 의해 인신 매매 세포내 올 무를 떠 올 리

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

우리는 광액성 신경필라멘트 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형질성 광섬유 마우스에서 말초 신경의 단일 골수축축에서 신경필라멘트의 축산수송을 분석하는 방법을 설명합니다.

절제된 마우스 티비알 신경에 있는 신경필라멘트 수송의 화상 진찰 그리고 분석

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

이 프로토콜은 광유전학 도구를 통해 핵세포질 수송을 추적하여 얻은 살아있는 세포 이미징 데이터의 자동 분석을 효율적으로 설정하고 수행하는 방법을 설명합니다.

LEXY 및 LINuS 광유전학 도구 및 자동화된 이미지 분석을 사용하여 살아있는 세포의 핵세포질 수송 역학을 정량화합니다.

이 프로토콜은 최적화된 분리, 고정, 표지를 활용하여 분리된 애기장대 핵의 단일 분자 위치 현미경 영상을 효율적으로 수행하여 크로마틴과 RNA 중합효소 II의 신뢰성 있는 나노 규모 시각화를 달성합니다. 이 접근법은 고해상도 영상을 위한 다른 염색질 관련 단백질이나 히스톤 변형에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

애기장대 핵에서 단일 분자 위치 현미경을 위한 간소화된 프로토콜

막 단백질 기능은 세포막의 지질 성분에 의해 규제됩니다. 이 비디오 - 문서 변경 막 속성의 기자로 이중층 패치 전극뿐만 아니라 사용하는 방법으로 그램이시딘 채널을 사용하여 패치를 형성하는 방법 세부 사항.

이중층 탄성 등록 정보 모니터링 변경에 대한 단일 분자 방법

학습하세요 단일 분자 현미경을 이용한 세포핵 수송 메커니즘 분석 방법을. 형광 표지 화물 분자의 핵공을 통과하는 운동을 시각화하여 수송 역학을 정량적으로 분석하고 세포 기능 이해에 필요한 통찰을 제공합니다.

원자력 교통 단일 분자 이미징

더 많은 동영상 탐색