만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서 이미징

HIV에 감염된 성인 환자의 경우, 신경염증이 정상적인 시냅스 신호 전달을 방해하여 추상화, 언어 유창성, 주의력 학습, 새로운 정보 습득 및 기억력의 어려움을 포함하는 신경인지 결손을 유발합니다. HIV-1 Tat은 염증성 분자의 분비를 유도하며, 이는 HIV 환자에게서 관찰되는 시냅스 기능 장애를 모방할 수 있습니다. 여기서는 미세아교세포를 포함한 단핵세포에서 GFP를 발현하는 성인 마우스를 사용하여, 얇은 두개골 2광자 현미경을 통해 HIV-1 Tat으로 유도된 신경염증을 조사합니다.

tat 주입 후 미세아교세포의 반응을 생체 내(in vivo)에서 이미징할 수 있습니다. 결과 영상은 미세아교세포 돌기의 단축 및 증후, 식세포 컵 형태의 구조 형성, 그리고 뇌 미세혈관 내 말초 단핵구의 이동을 보여줍니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 신경발달 및 질환 센터의 Harris Galbard 연구실 소속 Dan Marker입니다.

안녕하세요, 로체스터 대학교 신경생물학 및 해부학과의 Esca 연구실 소속 EF Trombley입니다. 안녕하세요, 저 역시 Albas 연구실 소속인 Shain Luu입니다. 오늘은 얇은 두개골 표본 제작을 이용한 이광자 이미징 절차를 보여드리겠습니다.

우리는 만성 신경염증을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 여기에서 보여주는 실험을 시작하겠습니다. 미세아교세포를 포함한 단핵세포 계통에서 GFP를 발현하는 OT가 사용됩니다.

특정 프로젝트의 필요 사항을 충족하기 위해 다양한 마우스 계통을 사용할 수 있습니다. 수술을 위해 fentanyl과 midazolam으로 마취된 마우스를 준비하십시오. 먼저, 꼬리 꼬집기와 같은 통증 자극에 동물이 더 이상 반응하지 않는지 확인하십시오.

마취 후 저체온증을 방지하기 위해 동물을 가열 패드 위에 놓습니다. 그런 다음 동물의 눈을 촉촉하게 유지하기 위해 보호용 안연고를 눈에 도포합니다. 모든 수술 기구는 오토클레이브 또는 유리 비드 멸균기로 멸균되어 있어야 하며, 70% ethanol에 담가 기구를 추가로 소독합니다.

가위를 사용하여 동물의 두피에서 털을 제거한 다음, 10% povidone iodine 용액과 70% ethanol을 사용하여 해당 부위를 소독합니다. 작은 가위를 사용하여 두개골에서 4~5mm 후방부터 시작하여 눈 앞쪽까지 두피의 정중선을 따라 절개하며 수술을 시작합니다. 이 절개 부위는 이광자 이미징 동안 생쥐의 머리를 고정하는 플레이트를 접착할 때 피부가 방해되지 않을 만큼 충분히 길어야 합니다.

다음으로, 멸균된 면봉에 100% ethanol을 묻혀 두개골 상단의 막을 건조시킵니다. 세밀한 핀셋을 사용하여 막을 긁어 제거합니다. 막이 제거되지 않으면 헤드 플레이트 부착이 불안정해질 수 있습니다.

해부 현미경 아래에서 얇게 만들 부위를 확인합니다. 두개골 봉합선 바로 위에 위치한 관심 영역은 피하십시오. 해당 부위는 두개골이 덜 안정적이며, 하층의 큰 혈관과 뇌수막이 관심 영역의 뷰잉 윈도우(viewing window)로 전송되는 영상에 간섭을 일으키기 때문입니다. 그 다음, 면봉을 사용하여 10% 염화철(ferric chloride) 용액으로 두개골을 다시 처리합니다.

헤드 플레이트 아래쪽의 관찰창 가장자리를 따라 perma bond, nine 10 glue를 얇게 도포합니다. 그런 다음, 접착제가 붙을 수 있도록 가볍게 압력을 가하며 동물의 두개골 내 관심 영역 위에 플레이트를 배치합니다. 주사기를 사용하여 관찰창 가장자리에 소량의 아크릴을 도포합니다.

마지막으로, 누설을 방지하기 위해 뷰잉 윈도우의 가장자리에 Tite 4 54를 소량 도포합니다. 헤드 플레이트를 동물 홀더에 나사로 고정하고 해부 현미경 하에서 안정성을 확인합니다. 핀셋으로 가볍게 건드려 보았을 때, 헤드 플레이트에 대해 두개골이 움직이지 않아야 합니다.

박층화(thinning) 준비 과정에서 누수가 없는지 확인하기 위해 관찰창 위에 생리식염수를 한 방울 떨어뜨립니다. 멸균 면봉과 압축 공기를 사용하여 두개골을 건조시킵니다. 마이크로 드릴의 IRF 0 0 7 드릴 비트를 사용하여 두개골을 얇게 깎아냅니다.

4,000 RPM에서, 지름 2~2.5 mm의 원형 영역을 매우 조심스럽게 얇게 만들기 시작합니다. 두개골과 거의 평행하게 가벼운 스위핑 동작만을 사용하십시오.

수직으로 직접적인 압력을 가하지 마십시오. 20~30초마다 드릴링을 멈추고 압축 공기를 사용하여 골분(bone dust)을 제거하십시오. 이렇게 드릴링 중간에 휴지기를 두면 두개골이 냉각되어 하부 뇌 조직에 열로 인한 손상이 발생하는 것을 방지할 수 있습니다.

천공이 진행됨에 따라 Diplo라고 불리는 더 습한 다공성 골층으로 전환되는 지점을 확인하십시오. 이 층에 도달하면 드릴 사용 시 각별히 주의해야 합니다. 얇은 부위에 식염수를 도포하고 해부 현미경으로 관찰하여 두개골의 두께를 수시로 확인하십시오.

식염수는 열 발산을 추가적으로 가능하게 합니다. 두개골이 얇아짐에 따라 더 작은 혈관들이 보이기 시작합니다. 식염수를 적신 상태에서 치과용 마이크로블레이드를 사용하여 최종적으로 얇게 깎아냅니다.

마이크로블레이드는 두개골의 안정성에 대해 훨씬 더 많은 촉각적 피드백을 제공합니다. 이를 통해 드릴만 사용하는 것보다 훨씬 더 얇게 준비할 수 있습니다. 이미징을 위한 최적의 두개골 두께는 10 to 30 micrometers입니다.

전체 박층화 과정은 일반적으로 15분에서 30분 정도 소요됩니다. 얇은 두개골 윈도우를 만드는 동안 에피 형광 현미경으로 두개골의 두께를 여러 번 확인하십시오. 관찰되는 미세아교세포와 혈관의 선명도 및 깊이는 윈도우가 이미징 준비가 되었는지를 판단하는 좋은 지표가 됩니다.

윈도우 준비가 완료되면, 직경 1mm의 유리 피펫을 사용하여 얇은 두개골 영역에 Cy 아크릴 접착제를 소량 떨어뜨리고 그 위에 커버글라스를 조심스럽게 내립니다. 그다음 두개골을 부드럽게 눌러 과도한 접착제를 밀어내며, 시야를 가릴 수 있는 커버글라스와 두개골 사이의 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 접착제가 건조되면, 이광자 이미징(two photon imaging) 준비를 위해 마이크로블레이드를 사용하여 커버글라스 위에 남은 접착제를 조심스럽게 제거합니다.

생리식염수로 얇은 두개골 피질 창을 덮고, 에피 형광(epi fluorescence) 하에서 관심 영역을 찾습니다. 이후 해당 영역의 이미징이 가능하도록 사진 촬영용 카메라를 사용하여 사진을 찍습니다. 여기서는 920 nanometers로 튜닝된 ti sapphire 레이저가 장착된 맞춤 제작된 이광자 현미경이 사용되었습니다.

형광은 전면 검출 모드의 광전증배관(PMT)과 581/80 방출 필터를 사용하여 검출합니다. 이미징 세션 전반에 걸쳐 20x 수침 렌즈를 사용합니다. 대물렌즈의 레이저 출력 최대치를 50에서 65 milliwatts 사이로 설정하십시오.

다음으로, 껍질 표면 아래 최대 150 µm까지의 피질 1층 또는 2층 중 관심 영역을 선택합니다. 재이미징을 용이하게 하기 위해, 동일한 시야를 1배, 2배 및 3배 디지털 줌으로 각각 촬영합니다. 혈관은 후속 이미징 세션 동안 동일한 시야를 쉽게 찾을 수 있는 지표로 활용될 수 있습니다.

3배 확대 배율에서, 각 80~90 Z-step과 0.69 µm step 간격으로 5분마다 최대 30분 동안 여러 개의 Z-stack을 획득합니다. 이를 통해 Z-stack 획득 사이의 시간 경과에 따른 미세아교세포의 형태와 행동을 적절하게 샘플링할 수 있으며, 식염수의 양과 마취 깊이를 확인합니다. 필요한 경우, 주입 전 며칠 동안 주사기와 바늘에 약물이 침착되는 것을 방지하기 위해 시술 중에 초기 마취 칵테일 용량의 1/3에 해당하는 추가 용량을 투여할 수 있습니다.

사이징 용액(sizing solution)을 바늘과 시린지 내부가 가득 찰 때까지 흡입하여 35 gauge 바늘과 10 microliter 미세 용량 시린지의 내부 라이닝을 실란화(Siloized)합니다. 용액 상태로 실온에서 5분간 방치한 후, 시린지에서 용액을 비우고 플런저를 제거하여 시린지와 바늘을 완전히 건조시킵니다. 마지막으로, 탈이온수로 시린지와 바늘을 철저히 세척합니다.

실로화(siloized) 처리 후, 주사기와 바늘은 재코팅이 필요하기 전까지 6개월 이상 사용할 수 있습니다. 주입 당일에, 실로화 처리된 유리 슬라이드 위에 TAT 용액을 한 방울 떨어뜨립니다. 실리콘 처리된 피펫 팁을 사용하여 이 방울에서 필요한 양의 용액을 마이크로 볼륨 주사기에 채웁니다.

드릴 비트를 사용하여, 이광자 이미지를 획득한 얇은 두개골 피질 창에서 전방 또는 측방으로 3 mm 떨어진 지점에 직경 0.5 mm의 작은 천공술을 시행합니다. 이를 위해 두개골을 조심스럽게 얇게 만든 다음, 날카로운 핀셋을 사용하여 얇은 뼈 층을 제거하십시오.

마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 35 gauge 바늘과 시린지를 두개골 절개 부위에 맞춥니다. 그런 다음, 바늘을 박리 표면 아래 700 to 900 micrometers 깊이까지 조심스럽게 진입시킵니다. 마이크로프로세서 제어 시린지 펌프를 사용하여 80 nanoliters per minute의 속도로 3 microliters를 주입합니다.

이 그림은 얇은 두개골 피질 창(thin skull cortical window) 이식 후, 박리 표면에서 약 50 µm 아래에서 이광자 이미징으로 시각화한 GFP 표지 미세아교세포를 보여줍니다. 이식 후 15~30분 뒤인 0일에 촬영한 단일 이광자 단면과 7일 및 17일 후에 촬영한 단면들을 통해, 염증성 자극이 없는 상태에서도 미세아교세포가 활성화된 상태를 유지하는 동안 창의 투명도가 유지됨을 확인할 수 있습니다. 이는 면역 작동 세포와 다른 신경 세포 유형 간의 정상적 및 염증성 상호작용을 연구하는 데 있어 이 방법의 유용성을 강조합니다.

HIV 신경독소 TAT 주입 후 6시간 및 24시간에 촬영한 in vivo Z-projection 영상에서는 활성화된 미세아교세포의 뚜렷한 형태학적 변화가 나타납니다. 이는 급성 및 만성 신경염증 모델에서 미세아교세포의 형태학적 변화를 실시간으로 관찰할 수 있는 당사의 능력을 추가로 입증합니다. 지금까지 본 절차를 통해 얇은 두개골 창(thin skull window)을 제작하고 이를 이용하여 신경염증을 연구하는 방법을 살펴보았습니다.

전처리 과정 자체로 인한 손상을 방지하기 위해 두개골을 다룰 때는 시간을 충분히 갖고 세심하게 작업하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 과정을 마쳤습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.