Name: 만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 배우세요 박막 해골 창 기법을 이용한 생체내 소교세포 이미징 방법으로 HIV-1 Tat 유도 신경염증을 연구합니다. 이 기술은 소교세포 활성화 및 형태 변화를 장기간 관찰하여 신경면역학 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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우리는 머리 플레이트 디자인 에밀리 A. 켈리 감사합니다. 우리는 노파에게 NIH 보너스의 지원에 대한 감사 : PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851이 작업이 가능 않았을 텐데 어떤 않고 제프리 Waasdorp 소아 신경과의 기금의 관대한 지원합니다. AKM은 NIH (EY019277), 화이트홀 재단, 알프레드 P. 슬로안 재단과 버로우즈 웰컴 기금에서 의생명 과학의 경력 수상으로 후원됩니다. MET는 퐁 드 라 공들인 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ) 박사 교육 수상에 의해 후원됩니다. DFM은 NIH T32 GM07356 및 T32 AI049815에 의해 재정 지원 의료 과학자 훈련 프로그램에 연수생입니다.

1. 이미징을위한 동물 준비 <ol><li> 우리의 실험에서, 우리는 microglia 포함한 mononuclear 세포 lineages에 표현 GFP. 생쥐의 4 가지 변종이 특정 프로젝트의 요구를 충족하는 데 사용할 수있는 성인 CX 3 CR 1 GFP / + 마우스를 사용합니다. </li><li> 동물이 더 이상 통증 자극에 반응하지 후 0.05 밀리그램 / kg 펜타 닐, 5.0 MG / kg Midazolam 및 0.5 밀리그램 / kg Medetomidine 구성된 세 마약 칵테일의 intraperitoneal 주사와 마우스를 마취. TSCW 5 외과 준비, 시작 등 꼬리 핀치로. 수술과 영상 전반에 걸쳐, 우리는 포스트 마취의 저체온증을 방지하기 위해 가열 패드에있는 동물을 유지. 필요한 경우 1, 3 분의 1의 부스터 선량은 마취 칵테일의 원래 복용량은 원래 마취 비행기를 복원 부여하실 수 있습니다. </li><li> 마취 동안 눈을 촉촉한 유지 보호 안과 연고와 동물의 눈을 감아라, 이것은 동물의 깜빡 반사를 표시하지 않습니다. 면도칼을 사용하여 동물의 두피에서 머리카락, 가위, 가위, 또는 화학적 방법을 제거합니다. 10 % povidone - 요오드 용액과 70 % 에탄올을 사용하여 두피를 소독. 모든 수술 장비 유리 비드 살균기, 또는 70 % 에탄올로 소독과 멸균, autoclaved해야합니다. </li><li> 두개골에 꼬리 4~5밀리미터를 시작하고 눈 앞에 앞으로 발전, 작은 가위를 사용하여 두피의 정중선 절개를합니다. 이 절개가 충분히 피부가 두 광자 이미징 (그림 1) 동안 마우스 머리를 고정하는 데 사용되는 머리 판의 gluing 방해하지 않을 것이 중요합니다. 해부 현미경 thinned으로 지역을 식별합니다. 두개골이 분야에서 덜 안정 및 대형 선박과 meninges을 기본 것은 이미지에 영향을하므로 직접 두개골 봉합 이상있는 관심의 영역을 피하십시오. </li><li> 두개골의 상단에있는 세포막을 건조하고 고급 핀셋 또는 면도날을 사용하여 거리를 긁어 멸균 면봉과 산화철 염화의 10 % 용액 다음 100 % 에탄올을 적용합니다. 불안 정한 헤드 플레이트 첨부의 세포막 결과를 제거하는 실패. </li><li> 머리 접시 아래에있는보기 창의 가장자리 주변 Permabond 910 접착제의 얇은 레이어를 놓습니다. 빛의 압력 (그림 1)와 동물의 두개골에 대한 관심의 영역 접착제로 코팅 머리 접시를 놓습니다. 머리 판에만 두개골의 뼈에 붙어있다 것이 중요합니다. 머리 판과 두개골 사이에 잡힐되는 피부 또는 점막은 채권의 안정성을 감소합니다. 즉시에 주사기 본드 접착제를 사용하여보기 창의 주위 아크릴 레이트의 작은 금액을 적용합니다. 마지막으로, 누출을 방지하기 위해 시청 윈도우의 가장자리에 Loctite 454의 작은 금액을 적용합니다. </li><li> 동물 홀더 (그림 1) 머리 플레이트 비할 가볍게 포셉 한 쌍의로 탐색하여 절개 범위에서 머리 판의 안정성을 확인합니다. 머리 접시에 상대적으로 두개골에 대한 움직임이 없어야합니다. 아무 누수가 없다 않도록 보는 창에서 호수의 드롭 놓습니다. </li></ol> 2. Thinned 해골 두피 창 준비 <ol><li> 두개골을 벗겨 준비에서 무균 목화 면봉 및 압축 공기의 조합을 사용하여 두개골을 건조. 4000 RPM으로 설정 Microtorque II 훈련에 살균 IRF 007 드릴 비트와 함께 두개골을 우리는 처음에 얇은. 아주 부드럽게, 두개골의 2-2.5 mm 직경 원형 지역을 고르고 ​​시작합니다. 두개골에 거의 평행 광만을 청소 동작을 사용하며, 직접적인 하향 압력을 사용하지 않습니다. 압축 공기를 사용하여 뼈 먼지를 제거하는 모든 20~30초을 드릴링 중지합니다. 드릴링에서 이러한 휴식은 기본 뇌 조직에 더 열을 유발 손상이 없습니다 때문에 두개골 괜찮아 수 있습니다. <ol class="lalpha"><li> 시추가 진행되면서 moister 해면 뼈 계층 (예 : "diploe")로의 전환을 확인합니다. 이 레이어에 도달되면, 드릴 여분주의. </li></ol></li><li> 때때로 thinned 영역 살린 배치 및 해부 현미경으로 보면 두개골의 두께를 확인하십시오. 호수가 추가로 방열을 사용합니다. 두개골이 thinned이므로, 작은 vasculature가 표시됩니다. </li><li> microblade은 두개골의 안정성에 대한 더 많은 촉각 피드백을 제공하는 등 생리에 따라 숱이 최종 달성하기 위해 살균 치과 microblade을 사용합니다. 이것은 혼자 드릴보다 훨씬 얇은 준비를 위해 수 있습니다. 우리의 경험에서 최적의 두개골 두께는 10-30 μm의 수 있습니다. <ol class="lalpha"><li> 얇은 두개골 윈도우를 만들기에있는 처음 몇 시도하는 동안 epifluorescence 여러 번 아래에있는 두개골의 두께를 확인하는 것이 중요합니다. 보이는 microglia과 vasculature의 선명도와 깊이 창 이미지 준비 때만큼 잘 알려주지. </li></ol></li><li> 일단 창이 접착제는 # 0 coverglass WI의 사용자 정의 - 만든 사각형 조각, 준비 창문이 지남에 따라 각 면에 미만 2mm의 크기 일. 1.0 mm 직경의 유리 피펫을 사용하여 thinned 두개골 지역에 cyanoacrylate 접착제의 작은 방울을 배치하고 coverslip의 작은 조각 아래 신중하게 낮은, 다음 접착제를 초과하는 금액을 짜내다로 두개골에 대해 부드럽게 누르십시오. 광학 불투명 될 수 밑에 갇힌 공기가 지역의 원인이 있기 때문에 이것은 유리와 접착제 사이의 거품 형성을 방지하는 것이 중요합니다. 그 때 건조 투명 남아 있으며, 뼈 및 얇고 반투명 창 아래에있는 두개골을 유지 막 regrowth을 방지하기 때문에 cyanoacrylate 접착제가 사용됩니다. 커버 유리 상단에있는 접착제가있다면, 커버 유리가 자리하고 접착제가 건조되면 신중하게 그것을 제거하는 microblade을 사용합니다. </li><li> 진통제 (예를 들어, Buprenorphine 2 MG / 서브 cutaneously kg)은, 체중 감소, 타액의 분비, piloerection, 호흡 소리, 이동 먹지도 않고 마시지도 않으려는 등 수술 후 즉시 시행과 고통의 흔적에 다시 관리합니다 등등 </li></ol> 3. 두 광자 이미징 <ol><li> 두 광자 이미징을위한 준비에 호수와 TSCW을 차지하고 있으며 epifluorescence에 따라 관심 영역 (그림 2)를 찾습니다. 지역의 이후 이미지를 사용하려면, 사진 카메라를 사용하여 사진을 찍었. </li><li> 사파이어 레이저 920 nm의에 조정된 : 두 광자 이미징을 위해, 우리는 티로 맞춤 제작된 두 개의 광자 현미경 6 사용합니다. 형광은 전체 - 현장 감지 모드와 180분의 580 방사 필터에 photomultiplier 튜브를 사용하여 감지됩니다. 20X 물 침지 렌즈 (NA 0.95) 이미징 세션 전반에 걸쳐 사용됩니다. 목적에 레이저 파워의 최대 출력 50 65 MW 사이에 설정됩니다. </li><li> 대뇌 피질의 레이어에 대한 관심의 영역 I 또는 II (pial 표면 아래에 150 μm의)을 선택하십시오. 다시 영상을 촉진하기 위하여, 1X, 2X 볼 같은 분야의 사진을, 그리고 3 배 디지털 줌. 혈관 쉽게 후속 영상 세션 동안 볼 같은 분야를 찾는 랜드마크 역할을하실 수 있습니다. 80-90로 3 배, 다중 Z - 스택의 확대에 따라 각 스택 및 0.69 μm의 단계에서 Z - 단계 (최대 시간이 지남에 따라 microglial 형태와 행동의 좋은 샘플링을 가능하게 30 분, 위해 5 분마다 취득 수 있습니다 그림 3). Z - 스택의 인수 사이에, 하나는 TSCW를 통해 호수의 수준뿐만 아니라 마취의 동물의 깊이를 확인한다. </li></ol> 4. HIV - 1 Neurotoxin, 태트의 분사 <ol><li> 첫째, 35 게이지 바늘과 태트 증착을 방지하기 위해 10 μL Microvolume 주사기의 내부 안감을 silanize. 그것은 바늘과 주사기를 모두 채우고 때까지 silanizing 솔루션 (Sigmacote)을 철회. 상온에서 5 분 앉아에 대한 해결책을 허용합니다. 주사기에서 솔루션을 비우기, 플런저를 제거하고 주사기와 바늘이 완전히 건조 수 있습니다. 마지막으로, 탈이온수과 함께 철저하게 주사기와 바늘을 씻으십시오. </li><li> 지름도 작은 드릴 비트를 사용하여 주동이의 또는 두 개의 광자 이미지가 얻은되었습니다 TSCW하는 측면 3mm에 작은 craniotomy 0.5 mm를 수행하고 신중하게 날카로운 팁을 포셉 한 켤레까지 두개골을 고르고 ​​것은의 thinned 레이어를 삭제할 수 있습니다 쉽게 멀리 뼈. 우리는 3 축 micromanipulator과 craniotomy에 바늘 끝을 라이닝 후 장착 Ultramicropump III 주사기 펌프에 의해 제어되는 35 게이지 바늘로 장착되어 10 μL Microvolume의 주사기를 사용하여 그 아래에 900 μm의 700의 깊이에 신중 고급입니다 3 μL 태트 1-72 (또는 다른 프로 염증성 대리인) 또는 생리 (또는 제어 차량) 80 NL / 분 전달 pial 표면. </li></ol> 5. 동물 주택 <ol><li> 동물은 하루에 여러 번 몇 군데있다면, 안과 연고 및 이미징 세션 사이에 불편함이나 두개골 손상을 방지하기 위해 바셀린의 혼합물로 두개골의 열린 영역을 커버. 작은 헤드 플레이트 (그림 1B 참조)에서 지원 다리를 분리하고 쉽게 접근할 음식과 물을 따뜻하게 새장에 동물을 놓으십시오. 모든 동물은 항상 수술 후 단독으로 위치해 수 있습니다. 동물 이미징 세션은 주어진 하루 완료되면 조심스럽게 머리 판 전체를 제거하고 # 6 또는 작은 봉합과 두개골을 통해 다시 피부를 봉합. 다시 실험 일 사이 쉽게 접근할 음식과 물로 단독 동물 집. 모든 스트레스의 흔적, 고통, 또는 감염 매일 동물을 확인합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 수술과 두 광자 영상 (A)와 헤드 플레이트 디자인 (B)에 대한 동물의 안정화. <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. GFP - 라벨 microglia는 epifluorescence와 시각. jove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. GFP - 라벨 microglia는 TSCW의 주입 후 두 광자 이미징과 시각, 약 50 pial 표면 아래 μm의. TSCW (일 공)의 주입 후 15-30분 데리고 싱글 두 광자 섹션뿐만 아니라, 7 17일 후, microglia가 염증 모욕의 부재에 inactivated 남아있는 동안 창문을 확실히 유지 것을 보여줍니다. Z - 투영 6 촬영한 24 시간 활성화된 microglia의 에이즈 neurotoxin 문신 전시 인상 morphologic 변경 후 주사. 스케일 바 : 10 μm의.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

HIV - 1 관련 neurocognitive의 결손 (수동)에 대한 실제 기판은 아마도 HIV - 1 감염 mononuclear phagocytes에서 출시된 프로 염증 중재자에 의한 시냅스 아키텍처의 파괴는 것을 강력히 주장하고있다. Microglial 활성화, multinucleated 거대한 세포, 그리고 astrocytic 비대로 인한 gliosis은 CNS 7 HIV - 1 감염과 염증의 특이 현상이 특징으로 간주됩니다. 반면, premortem neurologic 질환의 심각도는 시냅스 복잡 손실뿐만 아니라 CNS 8,9,10,11에서 대식 세포의 부담과 상관되었습니다. 그러나, microglia, 주변 침투 macrophages, 그리고 손으로 환자의 뉴런 사이의 역동적인 상호 작용은 단순히 기존의 immunocytochemical 연구에서 얻은 종래의 고정 처리를 사용하여 모델 수 없습니다. 우리 연구소의 최근 연구 주변 및 중앙 mononuclear 세포와 뉴런 사이의 이러한 상호 작용의 적어도 일부가 뇌 실질 조직 (류, 마커, 트렘블리로 HIV - 1 단백질 태트 1-72의 stereotactic 주사로 부분 모델 수있는 것을 제안했습니다 치, 그리고 Gelbard, 발표되지 않은 데이터). 따라서 neuroAIDS에 대해 다루기 쉬운 작은 동물 모델에서 단핵구 파생 macrophages, 뇌 주민 microglia과 뉴런 사이의 상호 작용을 검토하는 생체내 두 광자 이미징에 적용하기로 결정했다. 오픈 두개골 또는 thinned - 두개골 준비 시간이 짧은 기간 (시간)에 대한 대뇌 피질의 건축의 단일 심사, artifactually 인해의 수술 조작에 microglia / 대식 세포를 활성화하지 않고 이러한 준비를 사용할 수 없습니다 아급성 이벤트의 시간 코스에 관심이 조사 여유가 있지만 calvarial 창. 여기 gluing TSCW의 재생에서 두개관을 방지뿐만 아니라 ≥ 3 주간 반투명을 유지 thinned 두개골 영역 유리 coverslip의 작은 조각하여 이러한 한계를 우회의 간단한 방법을 보여줍니다. 우리는 더이 기술이 우리 (CX 3 CR 1 / GFP에 대한 heterozygous 생쥐의 피질에있는 HIV 태트 1-72의 stereotactic 분사에 대한 응답으로 뇌성 microvasculature뿐만 아니라 두뇌 주자 microglia를 입력 주변 monocytes의 행동을 관찰 할 수 있습니다는 것을 보여준다 mononuclear 혈통의 세포를 식별). 이 기술은 쉽게 다른 유전 배경을 가진 생쥐를 사용하여 적용할 수 있습니다, 예를 들어, 우리는 정기적으로 heterozygous CX 3 CR 1 / GFP를 사용하여 X 뜻 - 1 단핵구 파생 macrophages, 뇌 주민 microglia 및 뉴런 간의 상호 작용을 조사하기 위해 YFP 12 쥐 손에 관련 neuroinflammation의 생체내 모델 인치 우리 TSCW 준비는 조사관은 주변과 동물 실험 반복 치료 전후에 몇 군데 수있는 주간의 기간, 이상 발생할 수 있습니다 CNS 사이 세포 세포의 상호 작용을 공부하실 수 있습니다. 따라서, 각 동물 자체 제어로 검색할 수 있습니다. 이 TSCW 모델에 대한 하나 주의해야 할 점은 조사에서 대상 세포 중 유전자 향상된 형광 단백질 (eXFP)를 표현하거나 두개 관의 기계적 위반하지 않고 형광 염색이 표시 설계해야 할 것입니다, 그 eXFP 표현은 충분히 강력한해야합니다 셀룰러 아키텍처 주 기간 동안 반복 이미징 세션 이후 시각 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>구연산 펜타닐</td><td>Hospira Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미다졸람 염산염</td><td>Baxter International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine hydrochloride (Domitor)</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>체온 그 이상</td><td></td><td></td></tr><tr><td>토브라마이신 및 덱사메타손 안연고 (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포비돈-아이오딘 10% 용액</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 염화제이철 용액</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td></td></tr><tr><td>메틸 시아노아크릴레이트 910</td><td>Permabond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 454</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEETS 틀니 재료 가교 메틸 메타크릴레이트</td><td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtorque II 핸드피스 키트</td><td>Pearson 평가 도구</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>IRF 007 드릴 비트</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>Norland 굴곡 가능 마이크로블레이드 풀 래디우스</td><td>Salvin Dental</td><td>BLAD-NORLAND-69</td><td></td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트</td><td>최초의 강력접착제</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#0 유리 커버슬립</td><td>전자현미경학</td><td>63750-01</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;마이크로볼륨 주사기</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>ILS010LT</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>35 게이지 NanoFil 바늘</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NL35BL-2</td><td></td></tr><tr><td>볼 밀, 초경 비트 #1/4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501860</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100</td><td></td></tr><tr><td>광전증배관 </td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>HC125-02</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Sapphire 레이저 Mai-Tai</td><td>Newport Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서</emneuroinflammation의 모델 murine microglia의> 이미징

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

전통적으로 신경 과학에서 생체내에 murine 중추 신경계의 두 광자 영상도 오픈 두개골 1,2 또는 thinned - 두개골 3 준비의 사용을 참여했다. 오픈 두개골 기술은 다용도로 쓰인다하는 동안 그것이 침략하고 microglial 활성화를 일으킬 수 있기 때문에, 그것은 microglia 공부를위한 최적되지 않습니다. thinned - 두개골 접근 법으로서에도 불구하고, 만성 이미징에 필요한 두개골 다시 밝은 반복하면 조직 손상과 microglial 활성화의 위험을 증가 및 이미징 세션의 제한된 수의를 허용합니다. 여기서 우리는 두 광자 현미경을 사용하여 오랜 시간 동안 생체내에 murine microglia을 감시하는 만성 박막 해골 창 방법을 제시한다. 우리는 간헐적인 관찰의 세 주 과정을 통해 투명 남아 apposed 유리 coverslip와 안정, 접근, thinned - 두개골 대뇌 피질의 창 (TSCW)를 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 TSCW 준비가 훨씬 더 immunologically 불활성 숱이 오픈 craniotomy 또는 반복 두개골보다 microglial 활성화와 관련되고 주 기간 동안 이미징 세션의 임의의 숫자 수 있습니다. 우리는 pial 표면 아래 ≤ 150 μm의 향상된 녹색 형광 단백질과 microglia을 시각화하는 CX 3 CR 1 GFP / + 생쥐 4 TSCW을 준비합니다. 우리는 또한 이러한 준비가 내구성이 microgliosis을 유도하는 능력이 TSCW에 인접 태트 HIV - 1 neurotoxic 단백질의 stereotactic 뇌 주사와 함께 사용할 수 보여줍니다. 따라서,이 방법은 HIV 관련 Neurocognitive 장애 (수동)과 neuroinflammatory 구성 요소와 다른 neurodegenerative 질병 모델로 살아있는 두뇌에 시간이 지남에 따라 microglial 형태학 및 운동성 변화를 조사를 위해 매우 유용합니다.

우리는 반복 murine microglia를 시각화하고 monocytes 순환하는 방법을 설명<em&gt; 생체내에</em&gt; 시간, 일 또는 transcranial 두 광자 현미경을 사용하여 주 동안. 우리는 HIV - 1 단백질 규제 태트의 인접한 stereotactic 분사에 의해 활성화될 수있는 정지 microglia의 간헐적인 관찰을 허용 thinned - 해골 창을 준비하는 방법을 보여줍니다.

만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서</emNeuroinflammation의 모델 Murine Microglia의> 이미징

전통적으로 신경과학 분야에서 생쥐 중추신경계의 인 비보(in vivo) 이광자 이미징은 개두술(open-skull)의 사용이나...

HIV에 감염된 성인 환자의 경우, 신경염증이 정상적인 시냅스 신호 전달을 방해하여 추상화, 언어 유창성, 주의력 학습, 새로운 정보 습득 및 기억력의 어려움을 포함하는 신경인지 결손을 유발합니다. HIV-1 Tat은 염증성 분자의 분비를 유도하며, 이는 HIV 환자에게서 관찰되는 시냅스 기능 장애를 모방할 수 있습니다. 여기서는 미세아교세포를 포함한 단핵세포에서 GFP를 발현하는 성인 마우스를 사용하여, 얇은 두개골 2광자 현미경을 통해 HIV-1 Tat으로 유도된 신경염증을 조사합니다.tat 주입 후 미세아교세포의 반응을 생체 내(in vivo)에서 이미징할 수 있습니다. 결과 영상은 미세아교세포 돌기의 단축 및 증후, 식세포 컵 형태의 구조 형성, 그리고 뇌 미세혈관 내 말초 단핵구의 이동을 보여줍니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 신경발달 및 질환 센터의 Harris Galbard 연구실 소속 Dan Marker입니다.안녕하세요, 로체스터 대학교 신경생물학 및 해부학과의 Esca 연구실 소속 EF Trombley입니다. 안녕하세요, 저 역시 Albas 연구실 소속인 Shain Luu입니다. 오늘은 얇은 두개골 표본 제작을 이용한 이광자 이미징 절차를 보여드리겠습니다.우리는 만성 신경염증을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 여기에서 보여주는 실험을 시작하겠습니다. 미세아교세포를 포함한 단핵세포 계통에서 GFP를 발현하는 OT가 사용됩니다.특정 프로젝트의 필요 사항을 충족하기 위해 다양한 마우스 계통을 사용할 수 있습니다. 수술을 위해 fentanyl과 midazolam으로 마취된 마우스를 준비하십시오. 먼저, 꼬리 꼬집기와 같은 통증 자극에 동물이 더 이상 반응하지 않는지 확인하십시오.마취 후 저체온증을 방지하기 위해 동물을 가열 패드 위에 놓습니다. 그런 다음 동물의 눈을 촉촉하게 유지하기 위해 보호용 안연고를 눈에 도포합니다. 모든 수술 기구는 오토클레이브 또는 유리 비드 멸균기로 멸균되어 있어야 하며, 70% ethanol에 담가 기구를 추가로 소독합니다.가위를 사용하여 동물의 두피에서 털을 제거한 다음, 10% povidone iodine 용액과 70% ethanol을 사용하여 해당 부위를 소독합니다. 작은 가위를 사용하여 두개골에서 4~5mm 후방부터 시작하여 눈 앞쪽까지 두피의 정중선을 따라 절개하며 수술을 시작합니다. 이 절개 부위는 이광자 이미징 동안 생쥐의 머리를 고정하는 플레이트를 접착할 때 피부가 방해되지 않을 만큼 충분히 길어야 합니다.다음으로, 멸균된 면봉에 100% ethanol을 묻혀 두개골 상단의 막을 건조시킵니다. 세밀한 핀셋을 사용하여 막을 긁어 제거합니다. 막이 제거되지 않으면 헤드 플레이트 부착이 불안정해질 수 있습니다.해부 현미경 아래에서 얇게 만들 부위를 확인합니다. 두개골 봉합선 바로 위에 위치한 관심 영역은 피하십시오. 해당 부위는 두개골이 덜 안정적이며, 하층의 큰 혈관과 뇌수막이 관심 영역의 뷰잉 윈도우(viewing window)로 전송되는 영상에 간섭을 일으키기 때문입니다. 그 다음, 면봉을 사용하여 10% 염화철(ferric chloride) 용액으로 두개골을 다시 처리합니다.헤드 플레이트 아래쪽의 관찰창 가장자리를 따라 perma bond, nine 10 glue를 얇게 도포합니다. 그런 다음, 접착제가 붙을 수 있도록 가볍게 압력을 가하며 동물의 두개골 내 관심 영역 위에 플레이트를 배치합니다. 주사기를 사용하여 관찰창 가장자리에 소량의 아크릴을 도포합니다.마지막으로, 누설을 방지하기 위해 뷰잉 윈도우의 가장자리에 Tite 4 54를 소량 도포합니다. 헤드 플레이트를 동물 홀더에 나사로 고정하고 해부 현미경 하에서 안정성을 확인합니다. 핀셋으로 가볍게 건드려 보았을 때, 헤드 플레이트에 대해 두개골이 움직이지 않아야 합니다.박층화(thinning) 준비 과정에서 누수가 없는지 확인하기 위해 관찰창 위에 생리식염수를 한 방울 떨어뜨립니다. 멸균 면봉과 압축 공기를 사용하여 두개골을 건조시킵니다. 마이크로 드릴의 IRF 0 0 7 드릴 비트를 사용하여 두개골을 얇게 깎아냅니다.4,000 RPM에서, 지름 2~2.5 mm의 원형 영역을 매우 조심스럽게 얇게 만들기 시작합니다. 두개골과 거의 평행하게 가벼운 스위핑 동작만을 사용하십시오.수직으로 직접적인 압력을 가하지 마십시오. 20~30초마다 드릴링을 멈추고 압축 공기를 사용하여 골분(bone dust)을 제거하십시오. 이렇게 드릴링 중간에 휴지기를 두면 두개골이 냉각되어 하부 뇌 조직에 열로 인한 손상이 발생하는 것을 방지할 수 있습니다.천공이 진행됨에 따라 Diplo라고 불리는 더 습한 다공성 골층으로 전환되는 지점을 확인하십시오. 이 층에 도달하면 드릴 사용 시 각별히 주의해야 합니다. 얇은 부위에 식염수를 도포하고 해부 현미경으로 관찰하여 두개골의 두께를 수시로 확인하십시오.식염수는 열 발산을 추가적으로 가능하게 합니다. 두개골이 얇아짐에 따라 더 작은 혈관들이 보이기 시작합니다. 식염수를 적신 상태에서 치과용 마이크로블레이드를 사용하여 최종적으로 얇게 깎아냅니다.마이크로블레이드는 두개골의 안정성에 대해 훨씬 더 많은 촉각적 피드백을 제공합니다. 이를 통해 드릴만 사용하는 것보다 훨씬 더 얇게 준비할 수 있습니다. 이미징을 위한 최적의 두개골 두께는 10 to 30 micrometers입니다.전체 박층화 과정은 일반적으로 15분에서 30분 정도 소요됩니다. 얇은 두개골 윈도우를 만드는 동안 에피 형광 현미경으로 두개골의 두께를 여러 번 확인하십시오. 관찰되는 미세아교세포와 혈관의 선명도 및 깊이는 윈도우가 이미징 준비가 되었는지를 판단하는 좋은 지표가 됩니다.윈도우 준비가 완료되면, 직경 1mm의 유리 피펫을 사용하여 얇은 두개골 영역에 Cy 아크릴 접착제를 소량 떨어뜨리고 그 위에 커버글라스를 조심스럽게 내립니다. 그다음 두개골을 부드럽게 눌러 과도한 접착제를 밀어내며, 시야를 가릴 수 있는 커버글라스와 두개골 사이의 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 접착제가 건조되면, 이광자 이미징(two photon imaging) 준비를 위해 마이크로블레이드를 사용하여 커버글라스 위에 남은 접착제를 조심스럽게 제거합니다.생리식염수로 얇은 두개골 피질 창을 덮고, 에피 형광(epi fluorescence) 하에서 관심 영역을 찾습니다. 이후 해당 영역의 이미징이 가능하도록 사진 촬영용 카메라를 사용하여 사진을 찍습니다. 여기서는 920 nanometers로 튜닝된 ti sapphire 레이저가 장착된 맞춤 제작된 이광자 현미경이 사용되었습니다.형광은 전면 검출 모드의 광전증배관(PMT)과 581/80 방출 필터를 사용하여 검출합니다. 이미징 세션 전반에 걸쳐 20x 수침 렌즈를 사용합니다. 대물렌즈의 레이저 출력 최대치를 50에서 65 milliwatts 사이로 설정하십시오.다음으로, 껍질 표면 아래 최대 150 µm까지의 피질 1층 또는 2층 중 관심 영역을 선택합니다. 재이미징을 용이하게 하기 위해, 동일한 시야를 1배, 2배 및 3배 디지털 줌으로 각각 촬영합니다. 혈관은 후속 이미징 세션 동안 동일한 시야를 쉽게 찾을 수 있는 지표로 활용될 수 있습니다.3배 확대 배율에서, 각 80~90 Z-step과 0.69 µm step 간격으로 5분마다 최대 30분 동안 여러 개의 Z-stack을 획득합니다. 이를 통해 Z-stack 획득 사이의 시간 경과에 따른 미세아교세포의 형태와 행동을 적절하게 샘플링할 수 있으며, 식염수의 양과 마취 깊이를 확인합니다. 필요한 경우, 주입 전 며칠 동안 주사기와 바늘에 약물이 침착되는 것을 방지하기 위해 시술 중에 초기 마취 칵테일 용량의 1/3에 해당하는 추가 용량을 투여할 수 있습니다.사이징 용액(sizing solution)을 바늘과 시린지 내부가 가득 찰 때까지 흡입하여 35 gauge 바늘과 10 microliter 미세 용량 시린지의 내부 라이닝을 실란화(Siloized)합니다. 용액 상태로 실온에서 5분간 방치한 후, 시린지에서 용액을 비우고 플런저를 제거하여 시린지와 바늘을 완전히 건조시킵니다. 마지막으로, 탈이온수로 시린지와 바늘을 철저히 세척합니다.실로화(siloized) 처리 후, 주사기와 바늘은 재코팅이 필요하기 전까지 6개월 이상 사용할 수 있습니다. 주입 당일에, 실로화 처리된 유리 슬라이드 위에 TAT 용액을 한 방울 떨어뜨립니다. 실리콘 처리된 피펫 팁을 사용하여 이 방울에서 필요한 양의 용액을 마이크로 볼륨 주사기에 채웁니다.드릴 비트를 사용하여, 이광자 이미지를 획득한 얇은 두개골 피질 창에서 전방 또는 측방으로 3 mm 떨어진 지점에 직경 0.5 mm의 작은 천공술을 시행합니다. 이를 위해 두개골을 조심스럽게 얇게 만든 다음, 날카로운 핀셋을 사용하여 얇은 뼈 층을 제거하십시오.마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 35 gauge 바늘과 시린지를 두개골 절개 부위에 맞춥니다. 그런 다음, 바늘을 박리 표면 아래 700 to 900 micrometers 깊이까지 조심스럽게 진입시킵니다. 마이크로프로세서 제어 시린지 펌프를 사용하여 80 nanoliters per minute의 속도로 3 microliters를 주입합니다.이 그림은 얇은 두개골 피질 창(thin skull cortical window) 이식 후, 박리 표면에서 약 50 µm 아래에서 이광자 이미징으로 시각화한 GFP 표지 미세아교세포를 보여줍니다. 이식 후 15~30분 뒤인 0일에 촬영한 단일 이광자 단면과 7일 및 17일 후에 촬영한 단면들을 통해, 염증성 자극이 없는 상태에서도 미세아교세포가 활성화된 상태를 유지하는 동안 창의 투명도가 유지됨을 확인할 수 있습니다. 이는 면역 작동 세포와 다른 신경 세포 유형 간의 정상적 및 염증성 상호작용을 연구하는 데 있어 이 방법의 유용성을 강조합니다.HIV 신경독소 TAT 주입 후 6시간 및 24시간에 촬영한 in vivo Z-projection 영상에서는 활성화된 미세아교세포의 뚜렷한 형태학적 변화가 나타납니다. 이는 급성 및 만성 신경염증 모델에서 미세아교세포의 형태학적 변화를 실시간으로 관찰할 수 있는 당사의 능력을 추가로 입증합니다. 지금까지 본 절차를 통해 얇은 두개골 창(thin skull window)을 제작하고 이를 이용하여 신경염증을 연구하는 방법을 살펴보았습니다.전처리 과정 자체로 인한 손상을 방지하기 위해 두개골을 다룰 때는 시간을 충분히 갖고 세심하게 작업하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 과정을 마쳤습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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이 비디오 및 보충 자료에서 우리는 만성에 대한 프로토콜을...

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

우리는 mm에 걸쳐하고 뇌의 염증없이 몇 달 동안 안정 마우스 두개골에 이미지 창을 형성하는 방법을 제시한다. 이 방법은 잘 두 광자 현미경을 사용하여 혈류, 세포 역학 및 세포 / 혈관 구조의 종방향 연구에 가장 적합합니다.

마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

출처: Bisht, K., et al. 생쥐의 신경 면역 역학에 대한 반복적인 생체 내 이미징을 수행하기 위한 정밀한 뇌 매핑. J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 두개골 임플란트가 있는 형질전환 마우스의 신경 면역 역학의 형광 이미징을 보여줍니다. 혈관 및 신경 안정성은 신경 활동에 대한 면역 반응을 반영하는 동적 미세아교세포 변화와 함께 이미지화됩니다.

두개골 임플란트를 사용한 신경 면역 역학의 형광 이미징

출처: Maruoka, H., et. al. 깨어 있는 쥐의 미세아교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징.J. Vis. Exp. (2022) 이 비디오는 시각적 자극 중 깨어 있는 쥐의 신경 활동과 미세아교세포 역학을 이미징하기 위한 이광자 현미경 절차를 보여주며 칼슘 과도 및 세포 상호 작용을 강조합니다.

깨어 있는 쥐에서 미세아교세포의 역학과 신경 활동의 동시 이미징(Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse)

출처: Kamei, R., et. al., 마우스 해마에서 미세아교세포의 생체 내 만성 이광자 이미징. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 해마 CA1(Cornu ammonis 1) 및 치상회에서 미세아교세포 역학의 생체 내 2광자 현미경을 위한 설정 및 이미징 프로세스를 보여 최적의 광학 정렬 및 구조적 무결성 평가를 보장합니다.

마우스 해마에서 미세아교세포 역학의 생체 내 2광자 이미징

급성 뇌 손상은 날짜에 더 적절한 치료가없는 심각한 부상입니다. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 급성 뇌 손상 개발의 과정을 공부하고 설치류에 치료 적 전략을 프로빙 할 수 있습니다. 두뇌의 생체 내 두 광자 이미징 연구 급성 뇌 손상의 두 가지 모델이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

이 프로토콜은 신경 질리오 혈관 구조, 상호 작용 및 건강하고 병들인 조건 둘 다에 있는 기능의 세로 화상 진찰에 사용될 수 있는 만성 두개골 창 이식 기술을 기술합니다. 그것은 종종 선호하는 동안, 몇몇 중요한 한계를 가지고 있는 경두개 화상 진찰 접근에 대한 보완적인 대안으로 봉사합니다.

마우스에서 신경 면역 역학의 생체 내 이미징에서 반복적인 능력을 발휘하는 정밀한 두뇌 매핑

여기에 제시된 것은 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 뇌 세포의 종방향 이미징을위한 만성 두개골 창을 이식하기위한 프로토콜입니다.

깨어있는 마우스 에서 반복되는 생체 내 이미징을위한 두개골 창 이식

이 논문은 정밀하게 제어된 수술과 이광자 현미경을 사용하여 마우스 해마 CA1에서 휴식 미세아교세포를 만성적으로 생체 내에서 관찰하는 방법을 설명합니다.

생체 내 마우스 해마에서 미세아교세포의 만성 이광자 이미징

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

이 연구는 이광자 현미경을 사용하여 뉴런 발현 EGFP의 후속 생체 내 이미징을 위해 마우스에 반복적인 외상성 뇌 손상을 전달하고 두개골 창을 동시에 이식하는 방법을 보여줍니다.

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope(2광자 현미경을 사용한 폐쇄 두개골 외상성 뇌 손상 및 두개골 창이 있는 마우스의 형광 단백질 발현의 생체 내 이미징)

배우세요 박막 해골 창 기법을 이용한 생체내 소교세포 이미징 방법으로 HIV-1 Tat 유도 신경염증을 연구합니다. 이 기술은 소교세포 활성화 및 형태 변화를 장기간 관찰하여 신경면역학 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서 이미징

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